专利名称：具有adcc和cdc功能及改善的糖基化特征的抗-cd19抗体的制作方法
具有ADCC和CDC功能及改善的糖基化特征的抗-CD19抗体
技术领域：
本发明涉及抗-CD19抗体，其具有赋予一种或几中有用的效应子功能的相对于野生型Fe区具有一些特定氨基酸修饰的变体Fe区。本发明尤其涉及包含该变体Fe区的嵌合，人源化的或全人抗-CD19抗体。其有利地涉及具有感兴趣的和有价值的糖基化特征，尤其低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的抗体。本发明也涉及这些抗体在疾病或病症，诸如癌，尤其B细胞恶性肿瘤，及自-免疫疾病的治疗，防止或管理中的用途。
背景技术：
在自身免疫和/或炎性病症中，免疫系统在无要抵御的外源物质时引发炎性应答，及身体的正常保护 性免疫系统通过错误地攻击本身来导致对其自身组织的损伤。有以不同方式影响身体的许多不同自身免疫病症。例如，在患多发性硬化的个体中影响脑，在患克罗恩病的个体中影响肠，及在患类风湿性关节炎的个体中影响各种关节的滑膜，骨和软骨。B细胞恶性肿瘤构成癌的重要组，其包括B细胞非-霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)和毛细胞白血病和B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)。目前,癌治疗可涉及手术,化学治疗,激素治疗和/或放射治疗，以根除患者中的肿瘤形成细胞。最近，癌治疗也可涉及生物学治疗或免疫治疗。有对于替代性的癌治疗，特别对于已证明了对标准癌治疗，诸如手术，放射治疗，化学治疗和激素治疗难治性的癌治疗的显著需求。有希望的替代性的是免疫治疗，其中癌细胞特别由癌抗原-特异性抗体靶向。主要努力已指向利用免疫应答的特异性，例如,杂交瘤技术致使肿瘤选择性单克隆抗体的开发，且在过去几年，食品和药物管理局批准了用于癌治疗的第IMAb:用于非-霍奇金氏淋巴瘤的RiUlxan (抗-⑶20)和用于转移性乳腺癌的赫赛汀[抗-(c-erb-2/HER-2)]。Rituxan (俗名是利妥昔单抗)是针对在外周血和淋巴样组织中的大多数B细胞表面发现的人CD20，35kDa，4跨膜-跨蛋白的嵌合小鼠-人单克隆抗体。抗体治疗(Rituxan ,，美国专利5，736，137)被美国食品和药物管理局(FDA)
批准用于治疗复发的或难治性低度或滤泡，CD20-阳性B细胞非-霍奇金氏淋巴瘤。此外，采用放射性标记的抗-⑶20抗体的淋巴瘤治疗已描述于美国专利5，595，721，5，843，398，6，015，542 和 6，090，365。
toon] 在肿瘤学中，Rituxan /MabTliera 也在us被作为单剂用于治疗复发的
或难治性，低度或滤泡，⑶20-阳性，B细胞NHL，用于治疗NHL，用于之前未治疗的滤泡，CD20-阳性，B细胞NHL组合环磷酰胺，长春新碱，泼尼松龙(CVP)化学治疗，作为单剂用于治疗非-进展(包括稳定的疾病)，低度，⑶20阳性，B细胞NHL，在第1-线CVP化学治疗之后，及用于之前未治疗的扩散大B细胞，⑶20-阳性，NHL组合标准化学治疗(CHOP)或其他基于蒽环类抗生素的化学治疗方案。在肿瘤学中，Rituxan >/MabThera .在EU被用于患之前未治疗的或复发
的/难治性慢性淋巴细胞白血病(CLL)的患者的治疗组合化学治疗，用于之前未治疗的患阶段II1-1V滤泡淋巴瘤的患者的治疗组合化学治疗，作为对于应答诱导利用用或不用Rituxan /MabThera 的化学治疗的治疗的患复发的/难治性滤泡淋巴瘤的患者的维持治疗，用于患⑶20-阳性扩散大B细胞非-霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的患者的治疗组合CHOP (环磷酰胺，多柔比星，长春新碱，泼尼松龙)化学治疗，及作为用于是化疗抗性或在它们的在化学治疗之后的二次或随后复发的患阶段II1-1V滤泡淋巴瘤的患者的治疗的单一治疗。此外，在风湿病学中，指示Rituxan /IV1abThera 组合甲氨喋呤用于已具
有对其他疾病-修饰抗-风湿性药物(DMARD)的不充足的应答或不耐性的患严重的有活性的类风湿性关节炎的成年患者的治疗，包括一种或更多肿瘤坏死因子(TNF)抑制物治疗。MabThera已在美国，日本和加拿大被知为Rituxan。阿仑珠单抗是靶向⑶52的另一抗体，其已被批准用于复发的慢性淋巴细胞白血病(CLL)，但相关于显著毒性，因为最正常免疫细胞包括T-细胞和自然杀伤(NK)细胞上靶抗原的普遍存在的表达。但是，呈现了一些对利妥昔单抗治疗的抗性或复发。复发可通过各种机理呈现，其中一些导致损失⑶20表达和对进一步利妥昔单抗治疗的抗性。抗性可呈现，其可导致⑶20表达的损失或调节，及特征在于重复 的利妥昔单抗治疗的功效的缺乏，或在一些情况中，由初次利妥昔单抗治疗的功效的缺乏。抗性也发生在组成性缺少CD20表达的淋巴瘤病例中，包括一些B-细胞淋巴瘤诸如成血浆细胞性淋巴瘤。而且，⑶20+患者可不应答，或获取对Rituxan 治疗的抗性。而且，在高B细胞负荷的病情下，身体的效应子机理，例如，NK-细胞-介导的杀伤的耗竭，可导致此MAb的免疫治疗功效的实质性减小。而且，具有慢性淋巴细胞白血病和高水平的循环B细胞的患者的利妥昔单抗治疗可导致CD20自细胞移出，由此允许它们持续及抵抗清除。基于利妥昔单抗和阿仑珠单抗的成功和限制，尤其是用利妥昔单抗治疗的抗性和复发现象，需要靶向B细胞上的替代性的抗原的替代性的抗体的鉴定。⑶19是免疫球蛋白(Ig)超家族的95kDa糖蛋白成员。⑶19在来自它们的早期前-B细胞阶段的滤泡树突细胞和全部B细胞上表达，直到浆细胞分化的时间。CD19表面表达在B-细胞发育期间紧密调控，更高水平见于更成熟细胞和⑶5+ (B-1) B细胞。⑶19通过B细胞分化的成血浆细胞阶段而晚于⑶20表达。因而，⑶19表达在⑶20差地表达的许多前-B和未成熟的B-成淋巴细胞白血病和B细胞恶性肿瘤中相对高。CD19+成血浆细胞也可在自身免疫疾病的永存中起到作用。⑶19作为与⑶21，⑶81和⑶225的多分子复合物在B细胞的表面上表达。与此复合物一起，CD19涉及与B细胞受体的共信号传导，及在B-淋巴样细胞的分化，活化和增殖的控制中起到作用(Sato等人，1997)。
⑶19存在于不同类型的人B细胞恶性肿瘤(包括促-及前-B细胞急性成淋巴细胞白血病(ALL)，儿童和年轻成年的常见的ALL (cALL)，NHL, B-CLL和多毛-细胞白血病(HCL))的胚细胞。其未自恶性肿瘤细胞脱落，及在一些抗体结合之后内化(Press等人，1989)。抗原密度，在健康外周B细胞上，为10000 30000个分子/细胞，及在来自各种淋巴样癌的恶性肿瘤细胞上，为7000 30000个分子/细胞(Olejniczak等人，1983)。相比⑶20，⑶19在B-细胞发育中更广泛地和更早表达，其由销售的抗癌MAbRituxan 靶向，且如此可用于更宽范围的癌包括非-霍奇金氏淋巴瘤和急性成淋巴细胞白血病以及CLL。⑶19已20年为免疫治疗开发的焦点，但用针对⑶19的单克隆抗体的初始临床试验未导致耐久效应，尽管在一些患者中作为单剂或组合其他治疗剂展示应答(Hekman等人，1991; Vlasved 等人,1995)。已在小鼠模型，及在临床试验中评价几种⑶19-特异性抗体用于体外治疗B-系恶性肿瘤。这些包括了靶向⑶19和⑶3或⑶16的未修饰的抗-⑶19抗体，抗体-药物缀合物和双特异性抗体，以着手细胞毒性淋巴细胞效应子功能。本文所用的术语“单克隆抗体”指称自一群基本上均质抗体获得的抗体，即，包含群的个体抗体是同一的，除非可以少数量存在的可能的天然存在的突变或替代性的翻译后修饰，无论自杂交瘤或重组DNA技术产生。抗体是蛋白，其呈现对特异性抗原的结合特异性。天然抗体通常是约150，OOODa的异源四聚体糖蛋白，由2个同一轻(L)链和2个同一重(H)链组成。各轻链由一个共价二硫键连接到重链，而二硫键数在不同 免疫球蛋白同种型的重链之间变化。各重和轻链也具有规则链内二硫键桥。各重链在一端具有可变结构域(Vh)之后是许多恒定区。各轻链在一端具有可变结构域(')和在其另一端具有恒定区；轻链的恒定区与重链的第I恒定区对齐，及轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。术语‘变体’指称可变结构域的特定部分在抗体间在序列上广泛地不同，且负责对其特定抗原的各特定抗体的结合特异性。但是，变异性通过抗体的可变结构域未均匀地分布。其在轻链和重链可变结构域二者中被称为互补决定区(CDR)的3段中浓缩。可变结构域的更高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重和轻链的可变结构域各包含4个FR区，大地采用β-折叠片构型，由3个CDR连接，其形成环连接，及在一些情况中，形成折叠片结构的部分。在各链中的CDR由FR区紧密保持在一起，且自其他链的⑶R，贡献于抗体的抗原结合位点的形成(Kabat等人，1991)。恒定区未直接涉及抗体结合抗原，但呈现各种效应子功能。依赖于它们的重链的恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白可分为不同类。有5种主要类的免疫球蛋白:IgA，IgG, IgD, IgE和IgM，及这些中的几种可还分为亚类(同种型)，例如。IgGl, IgG2，IgG3和IgG4 ；IgAl和IgA2。对应于不同类的免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α，δ，ε，Y和μ。在各种人免疫球蛋白类中，仅IgGl，IgG2，IgG3和IgM已知活化补体。已显示贡献于抗体-介导的细胞毒性的免疫效应子功能包括抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)，抗体-依赖性细胞-介导的吞噬(ADCP)，及补体-依赖性细胞毒性(CDC)。
细胞毒性也可经抗增殖效应介导。尚不清楚肿瘤细胞增殖的抗体调节机理。但是，对抗体与免疫效应细胞上的Fcg受体(FcgR)的相互作用的理解的发展允许了具有显著地改善的效应子功能的抗体的加工。MAb的作用机理是复杂的，且呈现对不同MAb而改变。有MAb导致靶细胞死亡的多种机理。这些包括凋亡，⑶C，ADCC和信号转导的抑制。研究最多的是ADCC，其由自然杀伤(NK)细胞介导。此涉及抗体的Fab部分与癌细胞上的特定表位的结合和抗体的Fe部分与NK细胞上的Fe受体的随后结合。此引发穿孔素,及导致DNA降解的粒酶的释放，诱导凋亡及导致细胞死亡。在对MAb的Fe部分的不同受体之中，FcgRIIIa在ADCC中起到主要作用。之前研究显示，FcgRIIIa基因的多态性在氨基酸158编码苯丙氨酸(F)或缬氨酸(V)。缴氨酸同种型的表达与增加的亲和性关联及结合MAb (Rowland等人，1993; Sapra等人，2002;Molhoj等人，2007)。一些临床研究用对患非-霍奇金氏淋巴瘤的显示V/V多态性的患者中利妥昔单抗的更大临床应答支持了此发现(Cartron等人，2002，Bruenke etal.2005, Hekmann 等人，1991，Bargou 等人，2008)。W01999051642描述了在第270或329位，或在第270，322，329和331位的2个或更多包含氨基酸取代的变体人IgG Fe区。这些修饰旨在增加⑶C和ADCC效应子功能。W02002080987描述了治疗受试者中的B细胞恶性肿瘤的方法，包括施用抗-⑶19免疫毒素，更特别是人源化的或人，单克隆抗体。B细胞恶性肿瘤可为包含不表达CD20的B细胞的恶性肿瘤。W02007024249涉及人IgG Fe区的修饰，以便赋予由Fe Y R介导的增加效应细胞功能，尤其ADCC。Fe区在各氨基酸位铬包含特定修饰。
W02008022152也与靶向⑶19的抗体相关，其中抗体包含对Fe受体的修饰及改变抗体介导一种或更多效应子功能，包括ADCC，ADCP和⑶C的能力。例证了 ADCC测定。其他相关于抗-CD19抗体的专利申请包括W02009052431，W02009054863,W02008031056, W02007076950, W02007082715, W02004106381, W01996036360,W01991013974, US7, 462，352，US20070166306 和 W02005092925。US20090098124也涉及用含有IgG2，3或4的Fe区，具有一个或更多氨基酸修饰的变体重链加工抗体。建议了 Fe区之内的许多突变和突变组。它们之一是在第243位用亮氨酸，在第292位用脯氨酸，在第300位用亮氨酸，在第305位用异亮氨酸，及在第396位用亮氨酸取代(MgFc88)。另外的突变可导入Fe区，以提供用于改变的Clq结合和/或⑶C功能。待修饰的氨基酸位铬通常选自第270，322，326，327，329，331，333和334位。J.B.Stavenhagen等人(Cancer Res.2007, 67(18):8882-8890)公开了治疗性抗体的Fe优化。用突变体18获得最高水平的ADCC(F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L)。公开了具有此突变的Fe的抗-⑶20和抗-⑶32B单克隆抗体。尽管⑶19是在慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞上表达的B细胞特异性抗原，至今⑶19未用治疗性单克隆抗体有效靶向。作者描述了乂11^65574，具有设计为增强？(3￥1 1113的结合的修饰的Fe结构域的新加工的抗-CD19单克隆抗体。它们展示，此抗体介导有力的ADCC,中等直接细胞毒性和ADCP，但无CDC (Awan等人，2010)。而且，糖蛋白介导人类中的许多必要的功能，包括催化，信号传导，细胞间交往和分子识别和关联。已开发许多糖蛋白用于治疗性目的。蛋白的寡糖组分可影响与治疗性糖蛋白的功效关联的性质，包括物理稳定性，对蛋白酶攻击的抗性，与免疫系统的相互作用，药代动力学和特定生物学活性。该性质不仅可依赖于寡糖的存在或缺失，而且依赖于寡糖的特定结构。例如，特定寡糖结构介导糖蛋白通过与特定碳水化合物结合蛋白相互作用而自血流快速清除，而其他可被抗体结合及引发不期望的免疫反应(Jenkins等人，1996)。已许可及开发为医疗剂的多数既有的治疗性抗体具有人IgGl同种型，其分子量是约150kDa。人IgGl是带有结合到抗体恒定区(Fe)的2N-联双触角复合物-型寡糖的糖蛋白，其中大多数寡糖是核心岩藻糖基化的，及其通过Fe与白细胞受体(Fe Y R)或补体的相互作用训练抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)和补体-依赖性细胞毒性(CDC)的效应子功倉泛。最近，治疗性抗体已显示改善总体存活以及各种人恶性肿瘤，诸如乳腺，结肠和血液癌中疾病进展的时间，及癌患者的Fe Y R多态性的遗传分析展示了 ADCC是负责临床功效的主要抗-肿瘤机理。但是，既有许可的治疗性抗体的ADCC已发现被血清强烈抑制，由于非特异性IgG竞争治疗剂与自然杀伤细胞上的Fe YRIIIa的结合，其导致显著量的药物需求和与该治疗关联的非常闻成本。通过改善的Fe Y RIIIa结合的非-岩藻糖基化的形式的治疗性抗体的增强的ADCC显示被岩藻糖基化的对应物抑制。实际上，在该具有改善的Fe YRIIIa结合的抗体变体之中，非-岩藻糖基化的治疗性抗体，不包括岩藻糖基化的形式，呈现最强和最可饱和的体外和离体ADCC，由于那些带有天然存在的寡糖异质性和人工氨基酸突变，甚至在血浆IgG的存在下。通过在衣霉素的存在下培养来抑制人IgGl的糖基化导致，例如，此抗体对单核细胞和巨噬细胞上存在的Fe YRI受体的亲和性50倍减小(Leatherbarrow等人，1990)。与Fe Y RIII受体结合也受IgG上碳水化合物的损失影响，由于已描述非-糖基化的IgG3不能经NK细胞的Fe Y RIII受体诱导ADCC类型的裂解(Lund等人，1995)。但是，除了含有聚糖的残基的必需存在之外，其更精确地是它们的可导致起始效应子功能的能力的差异的结构的异质性。已进行研究，以研究寡糖残基对抗体生物学活性的功能。已显示，IgG的唾液酸对ADCC无效应(Boyd等人，1995)。几个报道显示，Gal残基增强ADCC (Kumpel等人，1994)。两断GlcNac,其是转移到核心β -甘露糖(Man)残基的β，4_GlcNac残基，已牵涉治疗性抗体的生物学残基(Lifely等人，1995，Shield等人，2002)揭示了岩藻糖基化的寡糖对抗体效应子功能的效应；Fuc-缺陷型IgGl显示了 50倍增加的结合Fe Y RIII及增强的ADCC。今天，用于治疗性应用(即癌，炎性疾病…)的广范围的重组蛋白包括糖基化的单克隆抗体。为治疗和经济的原因，在获得更高特异性抗体活性上有大的兴趣。一种获得大的效力增加，而维持在细胞系中的简单产生过程和潜在地避免显著，不期望的副作用的方式在于增强MAb的天然的，细胞-介导的效应子功能。因而，加工IgG的寡糖可产生优化的ADCC，其被认为是一些治疗性抗体的主要功能，尽管抗体具有多种治疗功能(例如抗原结合，凋亡诱导，及⑶C)。一般而言，嵌合及人源化的抗体通过使用遗传重组技术制备及通过使用CHO细胞作为宿主细胞产生。为了修饰抗体的糖链结构，已尝试各种方法，有针对与糖链修饰相关的酶的抑制物的应用，突变体的选择，或编码与糖链修饰相关的酶的基因的导入。GLYCART BIOTECHNOLOGY AG (Zurich, CH)在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中表达了催化两断GlcNac残基添加到N-联寡糖的N-乙酰-葡萄糖胺基转移酶III(GnTIII),并显示产生的 IgGl 抗体的更大 ADCC (W099/54342;W003/011878;W02005/044859)。通过自抗体的Fe部分移出或代替岩藻糖，KYOffA HAKKO KOGYO (Tokyo,日本)增强了 Fe结合及改善了 ADCC，由此改善了 MAb的功效(US6，946，292)。近来，More recently, Laboratoire Fdu Fractionnement et des
Biotechnologies (LFB)(法国)显示，MAb寡糖中的比Fuc/Gal应是等同或少于0.6,以获得具有高ADCC的抗体(FR2861080)。P.M.Cardarelli 等人(Cancer Immunol.1mmunother.2010, 59:257-265)在编码a I, 6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因缺陷的M-704PF CHO细胞中产生抗-⑶19抗体。此文章中抗体的非-岩藻糖基化需要酶-缺陷型细胞系的加工。此文章考虑了氨基酸突变。John Lund等人(Journal of Immunology, 1996，vol.157，n0.11，pp4963_4969)描述了非糖基化的人嵌合IgG3保留了结合人Clq及引发通过豚鼠C介导的裂解的显著能力。效应子功能诸如⑶C和ADCC是可为对于MAb的临床功效重要的效应子功能。全部这些效应子功能由抗体Fe区介导，及使作者尝试氨基酸修饰，或多或少成功。糖基化，尤其是，Fe区的岩藻糖基化对抗体功效具有显著影响。此使作者修饰CHO细胞中的抗体产生条件，以便在此再次尝试变化糖基化特征，以改善一些效应子功能，再次或多或少成功。增强嵌合MAb抗-CD19MAb4G7的ADCC的方法公开于US2007/0166306。通过使用人哺乳动物293T-细 胞系，在β (1，4)-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶III (GnTIII)酶的存在下，在对于抗体产生有效的条件下产生MAb4G7，由含有(I)至少60%N-乙酰葡萄糖胺双选择寡糖和(2)仅10%的非岩藻糖基化的N-乙酰葡萄糖胺双选择寡糖的Asn297-连接的寡糖表征的Fe片段。H.M.Horton 等人(Cancer Res.2008, 68(19):8049-8057)描述具有 S239D和 I332E突变的Fe-加工的抗-CD19抗体。将此在本文被称为Fcl4的Fe结构域与本发明的被称为chR005-Fc20 (F243L/R292P/Y300L/V305L/P396L)的 Fe 结构域比较。本发明的 Fe 结构域在全血效应细胞的存在下显示ADCC，然而用Fcl4，在相同的条件下，在含有循环天然的免疫球蛋白的全血的存在下未检测到显著ADCC活性。哺乳动物细胞是用于产生治疗性糖蛋白的优选的宿主，由于它们以为人应用最相容的形式糖基化蛋白的能力(Jenkis等人，1996)。细菌非常罕见糖基化蛋白，且如同其他类型的常见的宿主，诸如酵母，丝状真菌，昆虫和植物细胞产生与自血流快速清除关联的糖基化模式。在哺乳动物细胞之中，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞已在最近二十年期间最通常使用。除了给出适合的糖基化模式之外，这些细胞允许遗传稳定的，高产率克隆细胞系的一致的产生。它们可在简单生物反应器中使用无血清的培养基培养到高密度，及允许安全的和可再现的生物过程的开发。其他通常使用的动物细胞包括幼仓鼠肾(BHK)细胞，NSO-及SP2/0-小鼠骨髓瘤细胞。也已测试自转基因动物产生(Jenkins等人，1996)。由于糖链结构在抗体的效应子功能中起到显著地重要作用，且在由宿主细胞表达的糖蛋白的糖链结构中观察到差异，可用于产生具有更高效应子功能的抗体的宿主细胞的开发已经是目的。为了修饰产生的糖蛋白的糖链结构，已尝试各种方法，诸如(I)针对与糖链修饰相关的酶的抑制物的应用，(2)细胞突变体的选择，(3)编码与糖链修饰相关的酶的基因的导入，等。特定例在以下描述。针对与糖链修饰相关的酶的抑制物的例包括:衣霉素，其选择性地抑制GIcNAc-P-P-DoI的形成,这是N-糖苷-连接的糖链的前体的核心寡糖的形成的第I步骤；粟精胺和W-甲基-1-脱氧野尻霉素，其是糖苷酶I的抑制物；溴牛菜醇，其是糖苷酶II的抑制物；1_脱氧野尻霉素和1，4-二氧基-1，4-亚氨基-D-甘露糖醇,其是甘露糖苷酶I的抑制物；苦马豆素，其是甘露糖苷酶II的抑制物；苦马豆素，其是甘露糖苷酶II的抑制物等。特异于糖基转移酶的抑制物的例包括:针对N-乙酰葡萄糖胺转移酶V (GnTV)的底物的脱氧衍生物等。也知道，1-脱氧野尻霉素抑制复合物类型糖链的合成，和增加高甘露糖类型和混合型糖链的比(Glycobiology series2_Destiny of Sugar Chain in Cell,由Katsutaka Nagai, Senichiro Hakomori 和 Akira Kobata, 1993 编辑X主要选择及获得关于与糖链修饰相关的酶的活性的细胞突变体作为耐凝集素的细胞系。例如，已使用凝集素获得具有各种糖链结构的CHO细胞突变体作为耐凝集素的细胞系，所述凝集素诸如WGA (源于小麦(T.vulgaris)的小麦胚凝集素)，ConA (源于直立刀豆(C.ensiformis)的伴刀豆球蛋白A), RIC (源于蓖麻(R.communis)的毒素)，L-PHA (源于菜豆(P.vulgaris)的白细胞凝集素),LCA (源于兵豆(L.culinaris)的扁豆凝集素),PSA(源于豌豆(P.sativum)的豌豆凝集素)等(Genet et al.1986)。作为通过将与糖链修饰相关的酶的基因导入宿主细胞获得的产物的糖链结构的修饰的一例，已报道，许多唾液酸加入糖链的非-还原端的蛋白可通过将大鼠β-半乳糖苷酶-a-5，6-唾液酸转移酶导入CHO细胞来产生。不同类型的糖蛋白-修饰糖基转移酶也可在宿主系统中表达，诸如GnT III，或，替代性地，b(l，4)-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶V (GnTV), β (1，4)-半乳糖基转移酶(GalT)和甘露糖苷酶II (Man II)。W020070166306涉及禽胚胎来源的干细胞系，命名的EBx㊣，用于产生蛋白和更特别糖蛋白，诸如相比用通常的CHO细胞欠岩藻糖基化的抗体的用途。Ramesh Jassal等人用FA243突变或通过使用大鼠a2，6_唾液酸转移酶转染的CHO-Kl细胞系产生抗NIP IgG3抗体的唾液酸化。FA243IgG3具有由补体的靶细胞裂解恢复的a2, 6和a2, 3唾液酸化。John Lund等人(Journal of Immunology, 1996，vol.157，n0.11，pp4963_4969)描述，非糖基化的人嵌合IgG3保留了结合人Clq及引发通过豚鼠C介导的裂解的显著能力。本发明人评价了由未用糖基化抑制物修饰的及未处理的中国仓鼠卵巢细胞CHO/DG44细胞(由ECACC购买的)产生的针对⑶19抗原的人IgGl亚类的各种Fe嵌合变体抗体的糖基化特征。通过分析及比较产生的chR005-lFc0和优化的chR005-lFc20变体抗体的糖链的结构，本发明提供，无任何加工的野生型CHO宿主细胞表达感兴趣的和有价值的糖基化特征，尤其低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型。发明概述本发明提供结合人B细胞标记物的嵌合，人源化的及人抗-⑶19抗体，抗-⑶19抗体融合蛋白，及其片段。优化治疗性抗体功能性(例如.ADCC, CDC)的当前方法聚焦在天然Fe区的氨基酸修饰或糖基化状态的修饰。相反，本发明基于关乎氨基酸修饰和糖基化修饰的同时组合的方法。本发明涉及蛋白的糖基化加工领域。更特定，本发明针对通过使用野生型哺乳动物CHO细胞系的蛋白的糖基化加工，以通过用具有改善的治疗性性质，诸如有效ADCC然而亲本分子(鼠或野生型嵌合抗体)不可检测地呈现此功能的氨基酸突变来提供变体蛋白。本发明的分子仍保留了由亲本鼠抗体赋予的凋亡性效应子功能。更具体而言，本创新涉及用来自IgGl同种型的Fe区修饰免疫球蛋白中的抗体官能性，以具有引发CDC效应子功能的能力。更特别是，本发明的分子呈现ADCC的互补活化和有效诱导二者。本发明的分子对于B细胞病症，诸如但不限于，B细胞恶性肿瘤的治疗，对于自身免疫疾病的治疗和预防，及对于人移植受者中的移植物-抗宿主疾病(GVHD)，体液拒绝和移植后淋巴组织增生性病症的治疗和预防，对于用出治疗性抗体诸如但不限作为抗-CD20抗体治疗的或对于用出治疗性抗体诸如但不限作为抗-CD20抗体的联合治疗难治性的患者特别有用。本工作旨在产生克服这些缺点的具有修饰的Fe区的抗-⑶19抗体。发明人展示，这些抗-CD19抗体的Fe区内的氨基酸修饰可具有不仅对于效应子功能，包括ADCC和/或CDC的结果，而且直接对于抗体的糖基化特征。它们尤其是展示，Fe区内的一些修饰可导致抗-CD19抗体具有感兴趣的和有价值的糖基化特征，尤其当抗体在哺乳动物细胞，包括野生型哺乳动物细胞，尤其是啮齿动物细胞，尤其CHO细胞，诸如野生型dhfr+CHO细胞(由ATCC收集购买的)产生 或表达时，低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型。本发明的第I目的旨在提供赋予感兴趣的和有价值的糖基化特征，尤其对抗-CD19抗体，包括在哺乳动物细胞，尤其啮齿动物细胞，诸如CHO细胞，优选野生型细胞，诸如野生型CHO细胞中产生的或表达的抗体的低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的修饰的Fe区。通过定义，野生型表示细胞未修饰或加工，以便修饰天然细胞的糖基化机理。本发明的第2目的旨在提供给含有此Fe区的抗-⑶19抗体赋予ADCC功能的修饰的Fe区。本发明的第3目的旨在提供给含有此Fe区的抗-⑶19抗体赋予⑶C功能的修饰的Fe区。本发明的第4目的旨在提供给含有此Fe区的抗-⑶19抗体赋予ADCC和⑶C功能的修饰的Fe区。本发明的第5目的旨在提供给含有此Fe区的抗-⑶19抗体赋予ADCC和/或⑶C功能，且此外，当在哺乳动物细胞，尤其是啮齿动物细胞，诸如CHO细胞，包括野生型中产生的或表达时赋予感兴趣的和有价值的糖基化特征，尤其低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的修饰的Fe区。发明详述
本发明的第I对象是抗-⑶19抗体，其被修饰为包含变体人IgGlFc区，其中此变体区在人 IgGlFc 区的各氨基酸第 243，292，300，305，326，396 或 243，292，300，305，326，333，396位包含氨基酸取代。Fe区内的氨基酸残基根据Kabat 的编号系统编号。本发明的重组抗-⑶19抗体在野生型细胞，尤其啮齿动物细胞，诸如尤其是野生型CHO中产生之后具有感兴趣的糖基化特征。尤其是，自转染的细胞，例如野生型CH0，本发明允许表达大比例的重组抗体或其片段，携带包含具有半乳糖基化及非-岩藻糖基化的末端GlcNac的长链的双触角-型的常见的N-联寡糖结构。一种或更多糖型存在于重组抗-⑶19抗体群。糖型是仅关于附接的聚糖的数或类型不同的蛋白的同种型。
在非常令人惊讶的和有价值的实施方式中，抗体具有低岩藻糖水平。此是指在这些细胞，例如野生型CHO中产生的重组抗-⑶19抗体群之中，在此实施方式中，非-岩藻糖基化的抗体的比例占抗体的大致至少40%，优选大致至少60%，更优选大致至少80%或更高，例如至少85%。更具体而言，非-岩藻糖基化关乎Fe。作为CHO 细胞，提及的可为 CHO dhfr-/-，CH0/DG44 和 CHOEasy C。本发明的特定对象是抗-⑶19抗体，其被修饰为包含变体人IgGlFc区，其中此变体区在人 IgGlFc 区的各氨基酸第 243，292，300，305，326，396 或 243，292，300，305，326，333，396位包含氨基酸取代，且其中抗体已在野生型啮齿动物细胞，优选野生型CHO细胞中产生。根据优选的特征，此抗体具有低水平的岩藻糖。本发明的另一对象是抗-⑶19抗体，其被修饰为包含变体人IgGlFc区，其中此变体区在人 IgGlFc 区的各氨基酸第 243，292，300，305，326，396 或 243，292，300，305，326，333，396位包含氨基酸取代，具有低岩藻糖水平。根据本发明，低水平的岩藻糖是指(I)在一抗体，尤其在其Fe中减少的量的岩藻糖或(2)尤其在它们的Fe中具有减少的量的岩藻糖和/或无岩藻糖的组中的大量的抗体。在本说明书中，说到本发明的Fe或2个Fe的抗体。即便不每次提及，有对于每实施方式优选的情况，其中抗体具有2个Fe和各Fe之一具有类似结构(相同的突变)和类似糖基化特征。在一实施方式中，本发明的抗体具有Fe，优选2个不带有(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe。在一实施方式中，本发明的抗体具有Fe，优选2个不带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2 聚糖的 Fe。在一实施方式中，本发明的抗体具有Fe，优选2个不带有(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖和不带有(Gal)! (GlcNAc) 2 (Fuc)丄+ (Man) 3 (GlcNAc) 2聚糖的Fe。在一实施方式中，本发明的抗体包含Fe，优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。在一实施方式中，本发明的抗体包含Fe，优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe和无(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖和 / 或,优选及，无(Gal)! (GlcNAc) 2 (Fuc)丄+ (Man)3(GlcNAc)2 聚糖的 Fe。在一实施方式中，抗体包含Fe，优选2个带有以下聚糖之I种或2种的Fe:
.(Gal)! (GlcNAc) 2 (Fuc)! (NeuAc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2.(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)A(Man)3(GlcNAc)2在一实施方式中，本发明的抗体包含Fe，优选2个带有(Man)5 (GlcNAc)2聚糖的Fe和无(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖和 / 或,优选及，无(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc)丄+ (Man)3(GlcNAc)2聚糖,及I个或2个以下聚糖的Fe:# (Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)A(Man)3(GlcNAc)2# (Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc) j (NeuAc) j+ (Man) 3 (GlcNAc) 2本发明的另一对象是抗-CD19抗体，抗-CD19抗体，其被修饰为包含变体人IgGlFc区，其中此变体区在人IgGlFc区的各氨基酸第243，292，300，305，326，396或243，292，300, 305，326，333，396位包含氨基酸取代，且其中抗体具有Fe，优选2个不带有(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe 和 / 或，优选及，不带有(Gal)工(GlcNAc) 2 (Fuc) J(Man)3 (GlcNAc)2聚糖的Fe。在一实施方式中，本发明的抗体包含Fe,优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。在一实施方式中,抗体包含Fe,优选2个带有以下聚糖之I种或2种的Fe:# (Gal) j (GlcNAc) 2 (Fuc) j (NeuAc) j+ (Man) 3 (GlcNAc) 2# (Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc) j (NeuAc) j+ (Man) 3 (GlcNAc) 2在仍非常令人惊讶的和有价值的实施方式中，抗体具有高寡甘露糖水平。此是指在这些细胞,例如野生型CHO中产生的重组抗-⑶19抗体群之中，特征为更高水平的寡甘露糖的抗体的比例占抗体的大致至少20%，优选大致至少30%，更优选大致至少40%，仍更优选大致至少50%或更高。 在仍非常令人惊讶的和有价值的实施方式中，在这些细胞，例如野生型CHO中产生的重组抗体群之中，特征为更高水平的唾液酸化的糖型的抗体的比例占抗体的大致至少1.5%，优选大致至少2.5%，更优选大致至少5%或更高。在优选的实施方式中，本发明的抗体组合这些特征，尤其低岩藻糖水平和高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的3种。尤其是，本发明的转染的细胞，例如野生型CHO细胞允许表达大比例的抗体或其片段，携带包含具有半乳糖基化及非-岩藻糖基化的末端GlcNac的长链及给抗体赋予强ADCC活性的双触角-型的常见的N-联寡糖结构。在一实施方式中，抗-CD19抗体具有本发明的特定糖基化特征，尤其低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型，所述抗体是在哺乳动物细胞，优选野生型哺乳动物细胞，优选啮齿动物来源，尤其CHO细胞中产生或表达的，或要产生的或表达的。本发明也具有作为根据本发明的对象抗体组(或抗体组合物)，其中其包含抗-⑶19抗体，其被修饰为包含变体人IgGlFc区，其中此变体区在人IgGlFc区的各氨基酸第 243，292，300，305，326，396 或 243，292，300，305，326，333，396 位包含氨基酸取代。根据特征，抗体组已在野生型啮齿动物细胞，优选野生型CHO细胞中产生。根据另一特征，抗体组具有低水平的岩藻糖。根据再一特征，抗体组已在野生型啮齿动物细胞，优选野生型CHO细胞中产生。在第I实施方式中，此组包含少于或等于15%的该抗-⑶19抗体，其包含Fe，优选2个带有(GlcNAc)2(Fuc)A(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或,优选及,该抗体的少于或等于 20%，其包含 Fe，优选 2 个带有(Gal): (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe。糖型
百分率以数％表达。在另一实施方式中，抗体组包含抗体的至少15，20，30，40或50%，其包含Fe，优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。在一实施方式中，值是至少15%。在另一实施方式中，组包含少于或等于15%的该抗-⑶19抗体，其包含Fe，优选2个带有(GlcNAc)2(Fuc)^(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或，优选及，该抗体的少于或等于20%，其包含 Fe，优选 2 个带有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe，及抗体的至少15，20，30，40或50%，其包含Fe，优选2个带有(Man) 5 (GlcNAc) 2聚糖的Fe。在优选的实施方式中抗体组包含全部这些特征。在一实施方式中，寡甘露糖的值是至少15%。在另一实施方式中，抗体组包含:籲抗体的少于1.5或1%，其包含Fe，优选2个带有(Gal)! (GlcNAc) 2 (Fuc)! (NeuAc)^ (Man) 3 (GlcNAc)2 的 Fe (典型为 0.1 1.5%)，和 / 或优选，籲抗体的少于2或1.5%，其包含Fe，优选2个带有(Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAc)i+(Man)3(GlcNAc)2 的 Fe (典型为 0.1 2)。在再一实施方式中，组包含少于或等于15%的该抗-⑶19抗体，其包含Fe，优选2个带有(GlcNAc)2(Fuc)^(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或，优选及，该抗体的少于或等于20%，其包含 Fe，优选 2 个带有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe，及抗体的至少15，20，30，40或50%,其包含Fe，优选2个带有(Man) 5 (GlcNAc) 2聚糖的Fe，及还是籲抗体的少 于1.5或1%，其包含Fe，优选2个带有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAcV(Man)3(GlcNAc)2 的 Fe,和 / 或,优选 抗体的少于 2 或 1.5%，其包含 Fe，优选 2 个带有(Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc): (NeuAc)^(Man)3(GlcNAc)2的？0。在优选的实施方式中，抗体组包含全部这些特征。在一实施方式中，寡甘露糖的值是至少15%。本发明的另一对象是根据本发明的抗体组(或抗体组合物)，其中其包含抗-⑶19抗体，其被修饰为包含变体人IgGlFc区，其中此变体区在人IgGlFc区的各氨基酸第 243，292，300，305，326，396 或 243，292，300，305，326，333，396 位包含氨基酸取代，且其中组包含少于或等于15%的该抗-⑶19抗体，其包含Fe，优选2个带有(GlcNAc)2(Fuc)A(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或,优选及,该抗体的少于或等于20%,其包含 Fe，优选 2 个带有(Gal) I (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe。在另一实施方式中，抗体组包含至少20，30，40或50%的抗体，其包含Fe，优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。在一实施方式中，值是至少15%。在另一实施方式中，组包含少于或等于15%的该抗-⑶19抗体，其包含Fe，优选2个带有(GlcNAc)2(Fuc)^(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或，优选及，该抗体的少于或等于20%，其包含 Fe，优选 2 个带有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe，及抗体的至少15，20，30，40或50%，其包含Fe，优选2个带有(Man) 5 (GlcNAc) 2聚糖的Fe。在优选的实施方式中，抗体组包含全部这些特征。在一实施方式中，寡甘露糖的值是至少15%。在另一实施方式中，抗体组包含:籲抗体的少于1.5或1%，其包含Fe，优选2个带有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAcV(Man)3(GlcNAc)2 的 Fe,和 / 或,优选籲抗体的少于2或1.5%，其包含Fe，优选2个带有(Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAc)j+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 的 Fe。在再一实施方式中，组包含少于或等于15%的该抗-⑶19抗体，其包含Fe，优选2个带有(GlcNAc)2(Fuc)^(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或，优选及，该抗体的少于或等于20%，其包含 Fe，优选 2 个带有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe，及抗体的至少15，20，30，40或50%,其包含Fe，优选2个带有(Man) 5 (GlcNAc) 2聚糖的Fe，及还是籲抗体的少于1.5或1%，其包含Fe，优选2个带有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAcV(Man)3(GlcNAc)2 的 Fe,和 / 或,优选
抗体的少于 2 或 1.5%，其包含 Fe，优选 2 个带有(Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc): (NeuAc)^(Man)3(GlcNAc)2的？0。在优选的实施方式中，抗体组包含全部这些特征。在一实施方式中，寡甘露糖的值是至少15%。在一实施方式中，细胞是啮齿动物细胞，尤其是CHO细胞。在一实施方式中，细胞是野生型啮齿动物细胞，尤其野生型CHO细胞。在一实施方式中，抗-⑶19抗体能产生⑶C或⑶C+ADCC活性。在一实施方式中，此抗-⑶19抗体能产生⑶C或⑶C+ADCC活性及呈现本发明的特定糖基化特征，尤其本发明的低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型。本发明的抗体可在Fe区中包含补充性突变。在一实施方式中，Fe区还在氨基酸第333位包含氨基酸取代。人IgG Fe区可为IgG亚-类的区。其可为IgGl，IgG2，IgG3或IgG4的Fe区。在优选的实施方式中，Fe区是IgGlFc区。根据本发明取代的Fe区的氨基酸可被任何氨基酸取代，条件是取代的氨基酸的全体组能产生此⑶C或⑶C+ADCC活性和/或赋予本发明的特定糖基化特征，尤其本发明的低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型。可能的取代的例给出如下。在一实施方式中，Phe243被Leu取代。在一实施方式中，Arg292被Pro取代。在一实施方式中，Tyr300被Leu取代。在一实施方式中，Val305被Leu取代。在一实施方式中，Lys326被Ala取代。在一实施方式中，Glu333被Ala取代。在一实施方式中，Pro396被Leu取代。在一实施方式中，抗-CD 19抗体包含Fe区，其中Phe243被Leu取代，Arg292被Pro取代，Tyr300被Leu取代，Val305被Leu取代，Lys326被Ala取代和Pro396被Leu取代。在一实施方式中，此Fe区具有示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列(Fc34)。编码此Fe区的核酸示于SEQ ID NO:2。在另一实施方式中，抗-CD19抗体包含Fe区其中，Phe243被Leu取代，Arg292被Pro 取代，Tyr300 被 Leu 取代，Val305 被 Leu 取代，Lys326 被 Ala 取代，Glu333 被 Ala 取代，及Pro396被Leu取代。在另一实施方式中，此Fe区具有示于SEQ ID NO: 3的氨基酸序列(Fc24)。编码此Fe区的核酸示于SEQ ID N0:4。可在本发明的多肽的结构中制造修饰和变化，而仍获得具有如特征的分子。例如，无可同意的活性损失地，序列中的特定氨基酸可用其他氨基酸代替。因为其是多肽的相互作用能力和性质，定义多肽的生物学功能活性，可在多肽序列(或，当然，其成为基础的编码序列的DNA)中制造特定氨基酸序列取代和然而获得具有类似性质的多肽。在制造该变化中，可考虑氨基酸的亲水性指数。本领域通常明白给多肽赋予相互作用生物学功能的亲水性氨基酸指数的重要性(Kyte et al.1982)。已知，特定氨基酸可用具有类似亲水性指数或分值的其他氨基酸代替，而仍导致具有类似生物学活性的多肽。各氨基酸已基于其疏水性和荷电特征分配亲水性指数。认为，氨基酸的相对亲水性表征确定得到的多肽的二级结构，其进而限定多肽与其他分子，例如，酶，底物，受体，抗体，抗原，等的相互作用。如为本领域所知，氨基酸可由具有类似亲水性指数的另一氨基酸取代，和仍获得以生物学方式功能性地相当的多肽。在该变化中，优选其亲水性指数在±2之内的氨基酸的取代，特别优选在±1之内的那些，及甚至更特别优选在±0.5之内的那些。也可基于亲水性制造类似氨基酸的取代，特别当由此创建的生物学功能性地相当的肽或多肽旨在免疫学实施方式中使用。美国专利4，554，101，通过引用在本文合并，说到多肽的最大局部平均亲水性，如由其相邻氨基酸的亲水性管理的，与其免疫原性和抗原性，即与多肽的生物学性质关联。如在美国专利4，554，101中细节化，以下亲水性值已分配给氨基酸残基:精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0 + 1);谷氨酸(+3.0 + 1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(O);脯氨酸(-0.5 + 1);苏氨酸(-0.4);丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。需知，氨基酸可用具有类似亲水性值的另一氨基酸代替，而仍获得生物学相当体，且尤其是，免疫学相当体，多肽。在该变化中，优选其亲水性值在±2之内的氨基酸的取代，特别优选在±1之内的那些，及甚至更特别优选在±0.5之内的那些。如上所述，氨基酸取代通常因此基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性，未水性，电荷，尺寸，等。
权利要求
1.抗-⑶19抗体，其被修饰为包含变体人IgGFe区，优选IgGlFc区，其中此变体区在人IgG Fe区的各第243，292，300，305，326和396氨基酸位和任选地第333氨基酸位包含氨基酸取代，其中Fe区中氨基酸残基的编号是Kabat 的编号。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体已在野生型啮齿动物细胞，优选野生型CHO细胞中产生。
3.前述权利要求之任一项的抗体，其具有Fe，优选2个不带有(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe。
1.前述权利要求之任一项的抗体，其具有Fe，优选2个不带有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)I+ (Man)3(GlcNAc)2 聚糖的 Fe。
2.前述权利要求之任一项的抗体，其包含Fe，优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。
3.前述权利要求之任一项的抗体，其包含Fe，优选2个带有以下聚糖之I种或2种的Fe:#(Gal)j (GlcNAc)2(Fuc)j(NeuAc)j+(Man)3(GlcNAc)2,#(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)j(NeuAc)j+(Man)3(GlcNAc)2。
4.前述权利要求之任一项的抗体，其是ADCC+和⑶C+。
5.前述权利要求之任一项的抗体，其中抗体识别CD19抗原上的非-内化表位，优选包含其VH和VL氨基酸序列以下表所示的抗体mR005-l或mR005_2的CDR的抗体，或更优选，包含那些序列的抗体:
6.前述权利要求之任一项的抗体，其包含Fe区，其中Phe243被Leu取代，Arg292被Pro取代，Tyr300被Leu取代，Val305被Leu取代，Lys326被Ala取代和Pro396被Leu取代，且可能是Glu333被Ala取代。
7.前述权利要求之任一项的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体，人源化的抗体，全人抗体，双特异性酸抗体，抗体药物缀合物或抗体片段。
8.前述权利要求之任一项的抗体，其引发程序性细胞死亡。
9.前述权利要求之任一项的抗体，用于治疗癌的方法。
10.前述权利要求之任一项的抗体，用于治疗难治性或复发抗-CD20抗体治疗的患者的癌的方法。
11.前述权利要求之任一项的抗体组，其中其包含: 该抗体的少于或等于15%，其包含Fe，优选2个带有(GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2聚糖的Fe，和/或 该抗体的少于或等于20%，其包含Fe，优选2个带有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc)2聚糖的Fe。
12.权利要求15的抗体组，其中其包含抗体的至少15，20，30，40或50%，其包含Fe，优选2个带有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。
13.权利要求15或16的抗体组，其中其包含:抗体的少于1.5或1%，其包含Fe，优选2个带有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAc) ^ (Μan) 3(GlcNAc)2 的 Fe,和 / 或抗体的少于2或1.5%，其包含Fe，优选2个带有(Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAc) ^ (Μan)3(GlcNAc)2 的 Fe。
14.药物组合物，其包含前述权利要求之任一项的抗体，及生理学可接受的媒质或赋形齐U，且可能包含针对不同于CD19的肿瘤抗原的抗体，优选针对CD20的抗体。
15.权利要求16的组合物，用于治疗癌或自身免疫疾病的方法。
16.权利要求10的组合物，其用作抗-肿瘤药物或用作用于治疗难治性或复发抗-CD20抗体治疗的患者的癌的抗-肿瘤治疗。
17.权利要求14，15或16的组合物，其包含另一抗-癌剂。
18.核酸序列，其编码变体Fe区，其中Phe243被Leu取代，Arg292被Pro取代，Tyr300被Leu取代，Val305被Leu取代，Lys326被Ala取代和Pro396被Leu取代，且可能是Glu333被Ala取代。
19.表达载体， 其包含编码含有VH核酸序列如SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 34所示的抗体mR005_l或mR005-2的VH⑶R的多肽的核酸序列，或更优选， 核酸序列包含SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 34，及在SEQ ID NO: 1，3所示的各第243，292，300，305，326和396氨基酸位，及任选地第333氨基酸位包含氨基酸取代的人Fe区。
20.表达载体， 其包含编码含有VL核酸序列如SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 36所示的抗体mR005_l或mR005-2的VL⑶R的多肽的核酸序列，或更优选， 核酸序列包含SEQ ID N0:32或SEQ ID N0:36，及人κ区。
21.宿主细胞，其含有权利要求13和/或14的载体，宿主细胞优选是野生型CHO细胞。
全文摘要
本发明涉及抗-CD19抗体，其具有赋予一种或几种有用的效应子功能的相对于野生型Fc区具有一些特定氨基酸修饰的变体Fc区。本发明尤其涉及包含该变体Fc区的嵌合，人源化的或全人抗-CD19抗体。其有利地涉及具有感兴趣的和有价值的糖基化特征，尤其低岩藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和低水平的唾液酸化的糖型的抗体。本发明也涉及这些抗体在疾病或病症，诸如癌，尤其B细胞恶性肿瘤，及自-免疫疾病的治疗，防止或管理中的用途。
文档编号A61K47/48GK103221068SQ201180044951
公开日2013年7月24日 申请日期2011年7月18日 优先权日2010年7月19日
发明者C·韦尔莫-德罗什, B·S·维耶尔莫 申请人:国际药物发展生物技术公司