菌体细胞的破碎方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种菌体细胞的破碎方法。
【背景技术】
[0002]大多数的大肠杆菌基因工程菌属于胞内酶，因此需要先破碎菌体细胞才能使其胞内的酶释出，进而利用该酶的生物催化性能，现有技术中，破碎菌体细胞的方法有很多种，按照外加作用力的施加与否大体上可分为机械法和非机械法两大类:机械法主要有压榨法(固体剪切作用)和高压匀浆法(液体剪切作用)；非机械法主要有化学法、自溶法、酶解法以及冻融法等。实际生产中，无论是采用哪种破碎方法都需要确保对目标产物酶的活性影响降至最低，目前，适合大规模工业应用的破碎技术主要是机械法，然而其剪切力高，易造成敏感性酶的失活，另外，化学法破碎菌体细胞主要在实验室内小规模应用，且该方法易引入杂质，而酶解法成本又较高，因此这两种方法也不适于产业化应用，相比而言，经生产验证，冻融法更适用于破碎菌体细胞的大规模应用，但是，冻融法破碎菌体细胞普遍采用冷藏库进行冷冻破碎，具体来说，就是将待破碎的菌体细胞置于冷藏库先冷藏，再融解，这样菌体细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高，即可引起细胞溶胀破碎，但是该方法不仅耗费大量人力，而且破碎成本高，因此，寻求一种成本低、能够快速实现菌体细胞破碎的方法，这对于利用菌体细胞内的酶实现催化来说至关重要。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种成本低、能够有效保证酶活的菌体细胞的产业化破碎方法。
[0004]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种菌体细胞的破碎方法，其步骤如下:
[0005]a)冷冻:收集菌体发酵液，泵入片冰机的分水盘，分水盘上的菌体发酵液洒落在片冰机内的结冰面上结成冰层；
[0006]b)融解破碎:菌液冰片通过冰刀从结冰面上刮离并落入冰仓先在-5?_90°C条件下冷冻l-10h，再在10-60°c条件下融解，即得破碎的菌体细胞液。
[0007]上述技术方案应用片冰机破碎菌体细胞，其产生的有益效果在于:通过片冰机将菌体发酵液进行冷冻，使得菌体发酵液与片冰机内的结冰面进行大面积接触，如此不仅实现了菌体发酵液的快速制冰形成片状的冰层，而且得到的冰层菌体发酵液极易融解，有效提高了菌体细胞的破碎效率，具体的，经申请人分析验证，将冰层状的菌体发酵液先置于冰仓冷冻1-10h，然后再进行融解处理，这样使得酶活能够得到显著提升。
[0008]实际上，本申请所述的片冰机也就是现有技术中常见的片冰机，其制成的片冰广泛用来冷冻食品。本申请公开的上述方法在实际应用时，根据菌体细胞的细胞壁结构的不同，可以选择一次或者反复多次将菌体细胞进行上述的冷冻和冻融步骤，比如，经试验验证，针对细胞壁比较脆弱的革兰氏阴性菌来说，其菌体发酵液通过一次冷冻和融解即可实现细胞破碎，与现有技术相比，本申请采用片冰机进行冷冻的方法成本低，能够有效保证菌体细胞内酶的释出，另外，本申请公开的技术方案是菌体发酵液的冷冻和融解步骤分别在片冰机和冰仓内进行，这样可以防止冷冻装置内部的温度上下起伏，影响冷冻装置的使用效果。
[0009]作为进一步的方案:所述步骤a还包括以下步骤:先将收集的菌体发酵液在不超过50°C条件下浓缩10-100倍，然后将得到的浓缩菌液泵入片冰机结成冰片，分离或过滤浓缩菌体发酵液的装置为膜、离心机中的一种。具体的，膜过滤条件:温度控制在50°C以下，膜孔径为50nm_0.8 μπι，压力为0.1-0.5Mpa ;离心机离心条件:分离因数在6000-12000之间，温度控制在40°C以下。因菌体发酵液过滤或者离心得到的清液中主要为菌体杂蛋白，因此在进行菌体细胞破碎前可先将其中的杂蛋白去除并喷雾干燥制成饲料蛋白，而将浓缩的菌体发酵液进行冷冻和融解处理，这样可以有效提高菌体细胞的破碎效率。
[0010]进一步的，步骤a的片冰机中的制冰剂温度为-5 50°C,制冰系统温度为_5—-50°C;步骤a中发酵液泵入分水盘的方式采用软管泵。采用软管泵作为输送菌体发酵液的管体可以避免普通离心泵的剪切力对酶的破坏，如此可确保酶活保留率高达99%。
[0011]更为具体的方案:所述步骤b中片冰机的结冰面上包含冰状和液状的菌体发酵液，其中冰状的菌体发酵液从片冰机的落冰口落入冰仓，液状的菌体发酵液落至片冰机的接水盘并回流至分水盘上重新进行冻融破碎处理。现有技术的片冰机主要是用来将水制成片冰用于冷冻食品，而考虑其使用效果，对于少量未结成冰的水来说，其落入储冰仓之前就会经滤水板流入接水盘，再经过管道输送重新到达分水盘进行制冰，基于片冰机的上述功能，本申请可将结冰面上冰状和液状的菌体发酵液沿不同的路径送出，前者直接进入冰仓冷冻待融解，后者回送至分水盘处重新冷冻，如此可以有效保证菌体细胞的破碎率，进而提高菌体发酵液的酶催化性能。
[0012]进一步的，所述步骤b中冰层状的菌体发酵液的厚度不超过10mm。冰仓内冰层状的菌体发酵液先用0-10°C冷冻水进行换热，再用25-35?循环水换热，这样利用小温差换热可防止冰片粘连在一起，难以溶解；溶解后期，通水使片冰温度升到-5°C至0°C，加速溶解。
【具体实施方式】
[0013]以下通过1-3实施例对本发明公开的技术方案作进一步的说明:
[0014]实施例1:菌体细胞的破碎
[0015]a)发酵液预处理:收集5m3的L-天冬氨酸-α -脱羧酶发酵液，采用分离因数为9000的蝶式离心机进行离心分离，获得250kg浓缩的菌体发酵液，离心分离得到的清液通过喷雾干燥制成饲料蛋白，所述的L-天冬氨酸- α -脱羧酶发酵液申请人采用假单孢菌培养得到，该发酵液是申请人用来催化L-天冬氨酸以合成L-丙氨酸产品，具体的，所述的假单孢菌属于革兰氏阴性菌；
[0016]b)冷冻:将浓缩的菌体发酵液泵入片冰机的分水盘，分水盘上的菌体发酵液通过洒水管洒落在片冰机内的结冰面上结成厚度为3_的冰层，其中片冰机内制冰剂的制冰温度为_35°C，制冰系统温度为_30°C，具体的，所述的制冰剂为R22型；
[0017]c)融解破碎:冰层状的菌体发酵液通过冰刀从结冰面上刮离并落入冰仓，先在-20°C条件下冷冻3h，再在20°C的水循环条件下融解，即得破碎的菌体细胞液。经检测，该菌体细胞液的破碎率达95%，酶活保留率达97%。
[0018]实施例2:菌体细胞的破碎
[0019]a)发酵液预处理:收集5m3的L-天冬氨酸-β -脱羧酶发酵液，采用孔径10nm的陶瓷膜进行菌体分离，获得500kg浓缩的菌体发酵液，过滤分离得到的清液通过喷雾干燥制成饲料蛋白；
[0020]b)冷冻:将浓缩的菌体发酵液泵入片冰机的分水盘，分水盘上的菌体发酵液通过洒水管洒落在片冰机内的结冰面上结成厚度为5_的冰层，其中片冰机内制冰剂的制冰温度为-20°C，制冰系统温度为-40°C，具体的，所述的制冰剂为R22型；
[0021]c)融解破碎:冰层状的菌体发酵液通过冰刀从结冰面上刮离并落入冰仓，先在_30°C条件下冷冻2h，再在30°C的水循环条件下融解，即得破碎的菌体细胞液。经检测，该菌体细胞液的破碎率达96%，酶活保留率达98%。
【主权项】
1.一种菌体细胞的破碎方法，其步骤如下: a)冷冻:收集菌体发酵液，泵入片冰机的分水盘，分水盘上的菌体发酵液洒落在片冰机内的结冰面上结成冰层； b)融解破碎:菌液冰片通过冰刀从结冰面上刮离并落入冰仓先在-5?-90°C条件下冷冻Ι-lOh，再在10-60°C条件下融解，即得破碎的菌体细胞液。
2.根据权利要求1所述菌体细胞的破碎方法，其特征在于:所述步骤a还包括以下步骤:先将收集的菌体发酵液在不超过50°C条件下浓缩10-100倍，然后将得到的浓缩菌液泵入片冰机结成冰片，分离或过滤浓缩菌体发酵液的装置为膜、离心机中的一种。
3.根据权利要求2所述菌体细胞的破碎方法，其特征在于:膜过滤条件:温度控制在500C以下，膜孔径为50nm-0.8 μ m，压力为0.1-0.5Mpa。
4.根据权利要求2所述分离或过滤浓缩菌体发酵液的装置，其特征在于:离心机离心条件:分离因数在6000-12000之间，温度控制在40°C以下。
5.根据权利要求1或2所述菌体细胞的破碎方法，其特征在于:步骤a的片冰机中的制冰剂温度为_5--50 °C，制冰系统温度为-5--50 °C。
6.根据权利要求1所述菌体细胞的破碎方法，其特征在于:步骤a中发酵液泵入分水盘的方式采用软管泵。
7.根据权利要求1或2所述菌体细胞的破碎方法，其特征在于:所述步骤b中片冰机的结冰面上包含冰状和液状的菌体发酵液，其中冰状的菌体发酵液从片冰机的落冰口落入冰仓，液状的菌体发酵液落至片冰机的接水盘并回流至分水盘上重新进行冻融破碎处理。
8.根据权利要求3所述菌体细胞的破碎方法，其特征在于:所述步骤b中冰层状的菌体发酵液的厚度不超过10mm。
【专利摘要】本发明公开了一种菌体细胞的破碎方法，其步骤如下：a)冷冻：收集菌体发酵液，泵入片冰机的分水盘，分水盘上的菌体发酵液洒落在片冰机内的结冰面上结成冰层；b)融解破碎：菌液冰片通过冰刀从结冰面上刮离并落入冰仓先在-5～-90℃条件下冷冻1-10h，再在10-60℃条件下融解，即得破碎的菌体细胞液。本发明通过片冰机将菌体发酵液进行冷冻，使得菌体发酵液与片冰机内的结冰面进行大面积接触，实现了菌体发酵液快速制成冰片且极易融解，首次将片冰机应用于生物发酵行业，有效提高了菌体细胞的破碎效率，破碎率达95％，酶活保留率达97％。
【IPC分类】C12N1-06
【公开号】CN104531531
【申请号】CN201410766776
【发明人】郭恒华, 张冬竹, 吴照和, 刘洁, 唐思青, 刘洋
【申请人】安徽华恒生物科技股份有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月11日