一种重组毕赤酵母表达外源蛋白过程的专家控制系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组毕赤酵母表达外源蛋白过程的专家控制系统，属于生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 国内外有关诱导阶段重组毕赤酵母优化和控制的研宄报道主要集中于单变量 (因素）控制强化目标蛋白的合成积累，而对发酵过程的整体优化（发酵性能提高+缓解 操作能耗）基本没有考虑。但在毕赤酵母表达蛋白体系中，几个重要的控制变量，温度、DO、 山梨醇流加速度（共混诱导）等与细胞生理状态间存在非常复杂的关系，单靠优化控制一 个操作变量是难以取得满意效果的。只有在分析各操作变量对发酵性能的单独影响的基础 上，对它们进行合理的耦联、组合和复合控制，才可能使整个表达体系以适度的代谢/能量 供给水平、高能量再生效率、较低的细胞衰亡速度的方式操作运转，真正实现蛋白的高效生 产表达。针对毕赤酵母诱导生产外源蛋白过程一类的、多控制/状态变量、控制变量间存在 相互干涉、控制变量和被控（状态）变量之间定量关系不明、性能指标难以独立控制的复杂 过程，专家控制系统是一个解决问题的有效手段。专家控制系统是一个内含有专家知识与 经验的智能型计算机控制系统，它通过构建、实施和调整专家指令和规则，可以解决复合型 优化控制过程的有关问题。
[0003] 在毕赤酵母发酵中，低温诱导和山梨醇/甲醇共混诱导公认的作用就是抑制蛋白 酶的分泌、减少目标蛋白的降解、缓解细胞衰亡。另外，低温（20°C )诱导可以改变甲醇代 谢中的代谢流分布、加大蛋白合成支路的碳代谢通量、提高能量（ATP)再生效率和目标蛋 白的浓度。而山梨醇/甲醇共混诱导缓解了甲醇作为唯一能源对细胞工作运转所造成的压 力、有益于缓解目标蛋白的降解和提高细胞合成蛋白的活性，同时还对醇氧化酶具有一定 程度的可逆性抑制作用、可以对甲醇消耗速度进行适度调控。本发明以节能的方式将发酵 温度、山梨醇流加速度、溶氧同时在线控制于最优水平，提高外源蛋白产量、降低操作成本 和能耗。
【发明内容】
[0004] 毕赤酵母诱导期的甲醇代谢和目标蛋白合成是一个非常复杂的过程，单靠优化控 制一个操作变量是难以取得满意效果的，本发明提出了一种重组毕赤酵母表达外源蛋白过 程的专家控制系统，发酵过程多变量在线计量和控制图如图1所示。其中，状态变量甲醇浓 度通过甲醇在线测量电极（浓度水平固定）单独控制。专家型复合控制系统对采集的状态 数据进行在线计量得到NADH消耗速率r (e)_、ATP再生效率R，并对NADH消耗速率r?_、 ATP再生效率R和溶氧浓度DO这三个状态变量进行逻辑分析，从而对山梨醇流加速度rSQK、 温度T和搅拌转速r Ae三个操作变量进行调节。
[0005] 本发明提供一种重组毕赤酵母表达外源蛋白过程的专家控制系统，所述控制系统 包括发酵装置、信息采集装置、控制装置、执行装置；所述信息采集装置包括甲醇在线测量 电极、尾气分析仪、溶氧电极、温度检测电极、甲醇称重装置、山梨醇称重装置；所述信息采 集装置将采集的信息传给控制装置；控制装置对信息进行计算和逻辑处理后，控制执行装 置；所述执行装置包括山梨醇流加装置、甲醇流加装置、控温装置、搅拌电机。
[0006] 所述信息采集装置采集甲醇浓度、摄氧率OUR、二氧化碳释放率CER、溶氧浓度DO、 搅拌转速r Ae、发酵液温度T、甲醇消耗速度、山梨醇流加速度rSOT。
[0007] 所述摄氧率OUR、二氧化碳释放率CER通过尾气分析仪分析得到。
[0008] 所述甲醇消耗速度r_和山梨醇流加速度r SOT，在本发明的一种实施方式中，是通 过电子天平在线计量流加瓶的重量损失得到。
[0009] 所述甲醇浓度通过甲醇在线测量电极检测，在本发明的一种实施方式中，是由控 制器单独控制甲醇流加装置，使发酵液中甲醇浓度处于固定水平。
[0010] 所述甲醇浓度，在本发明的一种实施方式中控制在5-15g/L。
[0011] 所述控制装置在线计量状态变量NADH消耗速率r?_H、ATP再生效率R并经逻辑 分析后控制执行装置，从而控制山梨醇流加速度r SOT、温度T和搅拌转速rAe三个操作变量。
[0012] 所述控制装置在线计量状态变量NADH消耗速率r(e)NADH、ATP再生效率R，在线计量 方法如公式（1)、（2)、（3)、（4)所示：
【主权项】
1. 一种重组毕赤酵母表达外源蛋白过程的专家控制系统，所述控制系统包括发酵装 置、信息采集装置、控制装置、执行装置；所述信息采集装置包括甲醇在线测量电极、尾气分 析仪、溶氧电极、温度检测电极、甲醇称重装置、山梨醇称重装置；所述信息采集装置将采集 的信息传给控制装置；控制装置对信息进行计算和逻辑处理后，控制执行装置；所述执行 装置包括山梨醇流加装置、甲醇流加装置、控温装置、搅拌电机。
2. 根据权利要求1所述的专家控制系统，其特征在于，所述信息采集装置采集甲醇浓 度、摄氧率OUR、二氧化碳释放率CER、溶氧浓度D0、搅拌转速r Ae、发酵液温度T、甲醇消耗速 度ι·ΜΛΙ、山梨醇流加速度rSOT。
3. 根据权利要求1所述的专家控制系统，其特征在于，所述控制装置在线计量状态变 量NADH消耗速率r?_、ATP再生效率R并经逻辑分析后控制执行装置，从而控制山梨醇流 加速度温度T和搅拌转速r Ae三个操作变量。
4. 根据权利要求1或3所述的专家控制系统，其特征在于，所述控制装置在线计量状态 变量NADH消耗速率r(e)_ H、ATP再生效率R，在线计量方法如下：
5. 根据权利要求1或3所述的专家控制系统，其特征在于，所述控制装置对NADH消耗 速率r(G)_、ATP再生效率R和溶氧浓度DO三个状态变量进行分析；所述溶氧浓度DO划分 成"高"、"中"和"低" 3个不同水平，其中大于60 %代表"高"、20-60 %代表"中"、小于20 % 代表"低";所述NADH消耗速率划分成"高"、"中"和"低" 3个不同水平，ATP再生效 率R划分成"高"、"低"2个不同水平；其中r?NADH& mmol/L/h为单位计，大于90代表"高"、 60-90代表"中"、小于60代表"低"且ATP再生效率R大于90 %代表"高"、小于90 %代表 "低"，或者是，r(G)_为80-100代表"高"、60-80代表"中"、40-60代表"低"且ATP再生效 率R大于80 %代表"高"、60-80 %代表"低"。
6. 根据权利要求3所述的专家控制系统，其特征在于，所述控制装置对三个状态变量 NADH消耗速率r(G)_、ATP再生效率R、溶氧浓度DO进行逻辑处理，处理方法如下： 如果DO、R和r(G)NADH都高，那么增加 T和r SQK，同时降低rAe; 如果DO和R高，r(G)_H中，那么T和r SQK不变，同时降低r Ae; 如果DO和R高，r(G)_H低，那么T、r SQK和r AG都降低； 如果DO高，R低，r?_高，那么降低T，增加 r SQK，同时降低rAe; 如果DO高，R低，r?_中，那么降低T，r SQK不变，同时降低r Ae; 如果DO高，R低，r?_低，那么T、r SQK和r Ae都降低； 如果DO中，R和，那么增加 T和r SQK，同时rAe不变； 如果DO中，R高，ι·ω_Ηφ，那么T、r s。,和r AG都不变； 如果DO中，R高，r(G)NAIJg，那么降低T和r SQK，同时rAe不变； 如果DO中，R低，r?_高，那么降低T，增加 r SQK，同时rAe不变； 如果DO中，R低，r(G)_中，那么降低T，同时r ^和r Ae不变； 如果DO中，R和r (°_低，那么降低T和r SQK，同时rAe不变； 如果DO低，R和r(G)_H高，那么T、r SQK和r AG都增加； 如果DO低，R高，r?_中，那么T和r SQK不变，同时增加 r Ae; 如果DO低，R高，r(G)NADH低，那么降低T和r SQK，同时rAe; 如果DO和R低，r(G)NADH高，那么降低T，同时增加 r ^和r Ae; 如果DO和R低，r(G)_H中，那么降低T，r SQK不变，同时增加 r Ae; 如果DO、R和r(G)NADH都低，那么降低T和r SQK，同时增加 rAe。
7. 根据权利要求1或3或6所述的专家控制系统，其特征在于，所述三个操作变量的调 节量由以下公式计算得到： T (t) = T (0) (1+ δ 1 a ) Tfflin^ T (t) ^Tfflax (5)
其中δ2、33分别代表T、rSOT和rAe的更新步长，它们的范围分别为l-5、0.05-0. 5 和10-50 ; (0)代表各控制变量的初始值且初始值不等于0,（t)代表各控制变量的t时刻的 值；α、β、γ分别代表温度T、山梨醇流加速度r SOT和搅拌速度r Ae的调节方向，其中+1代 表增加，〇代表不变，-1代表降低。
8. 根据权利要求1所述的专家控制系统，其特征在于，所述专家控制系统的控制周期 为 0· 1-0. 5h。
9. 根据权利要求7所述的专家控制系统，其特征在于，所述δ ηδ2、δ3分别为1、〇.1、 10 或者 1、0· 15、20。
10. 权利要求1所述专家控制系统在重组毕赤酵母表达外源蛋白过程中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种重组毕赤酵母表达外源蛋白过程的专家控制系统，属于生物技术领域。毕赤酵母表达外源蛋白时，几个重要的控制变量如温度、DO、山梨醇流加速度(共混诱导)等与细胞生理状态间存在非常复杂的关系。针对这种控制变量相互干扰、控制变量和被控变量间定量关系不明、性能指标难以独立控制的复杂过程，本发明提出了一种专家控制策略。专家控制系统是一个内含专家知识与经验的智能型计算机控制系统，它通过构建、实施和调整专家指令和规则，解决复合型优化控制过程的有关问题。控制系统以节能的方式将发酵温度、山梨醇流加速度、溶氧同时在线控制于最优水平，提高目的蛋白活性和浓度、降低操作成本和能耗。
【IPC分类】C12P21-00, C12M1-38, C12M1-02, C12R1-865
【公开号】CN104531522
【申请号】CN201410767928
【发明人】高敏杰, 詹晓北, 史仲平, 丁健, 杨帅
【申请人】江南大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月12日