专利名称：细胞间粘附分子-3及其配体的制作方法
本申请涉及美国专利申请系列号07/045，963(申请日1987年5月4日)、07/115，798(申请日1987年11月2日)、07/155，943(申请日，1988年2月16日)、07/189，815(申请日1988年5月3日)、07/250，446(申请日1988年9月28日)、07/454，294(申请日1989年12月22日)和PCT申请号PCT/US91/02942及PCT/US91/02946(在美国受理局的申请日为1991年4月27日)，这些申请都列为本文参考文献。
本发明涉及一种新的定名为ICAM-3的细胞间粘附分子，该分子参予识别淋巴细胞群体及粘附于细胞基质上的过程。ICAM-3介导炎症部位和免疫部位之淋巴细胞和巨噬细胞的细胞相互作用。
本发明还涉及单独使用ICAM-3或与ICAM-1和/或ICAM-2联合使用，以抑制粒细胞、淋巴细胞或巨噬细胞谱系的细胞间粘附。使用上述分子提供了一种治疗特异性和非特异性炎症的方法。
本发明还涉及单独使用ICAM-3或联合使用ICAM-1和/或ICAM-2抑制HIV特别是HIV-1对淋巴细胞的感染，以治疗或预防接触了HIV或感染了HIV之个体的方法。因而其可用于治疗例如由HIV病毒引起的爱滋病(获得性免疫缺陷综合症)等疾病。
本发明还涉及单独使用ICAM-3，或联合使用ICAM-3与ICAM-1和/或ICAM-2抑制T细胞死亡和“合胞体”形成，以治疗被HIV感染之个体的方法。因此其可用于治疗疾病，如由HIV-1病毒引起的爱滋病(获得性免疫缺陷综合症)。
本发明涉及单独使用ICAM-3，或联合使用ICAM-3与ICAM-1和/或ICAM-2治疗哮喘。
另外，本发明还涉及能够与ICAM-3结合的分子(以下称为抗ICAM-3)。抗ICAM-3分子与ICAM-3结合旨在调节与ICAM-3有关的生物学功能。本发明的结合分子可以是能够与ICAM-3结合的抗体、肽或碳水化合物。这些结合分子可用于调节ICAM-3的生物学功能。
本发明还涉及单独使用抗ICAM-3，或联合使用抗ICAM-3与抗ICAM-1和/或抗ICAM-2以抑制粒细胞、淋巴细胞或巨噬细胞谱系的细胞间粘附。使用这些分子提供了治疗特异性或非特异性炎症的方法。
本发明还涉及通过单独使用抗ICAM-3或联合使用抗ICAM-3与抗ICAM-1和/或抗ICAM-2，抑制接触了HIV之个体内淋巴细胞被HIV特别是HIV-1感染的治疗和预防方法。因此其可用于治疗疾病，如由HIV病毒引起的爱滋病(获得性免疫缺陷综合症)。
本发明还涉及单独使用抗ICAM-3或联合使用抗ICAM-3与抗ICAM-1和/或ICAM-2，以抑制HIV-1感染的细胞由循环系统中迁移的治疗方法。因此其可用于治疗疾病，如由HIV-1病毒引起的爱滋病(获得性免疫缺陷综合症)。
本发明进一步涉及单独使用抗ICAM-3，或联合使用抗ICAM-3与抗ICAM-1和/或抗ICAM-2治疗气喘。
A.白细胞附着及功能为了使宿主适当地抵御细菌或病毒等外来病原因子的侵入，白细胞必须能够附着在细胞基质上(参见Eisen，H.W.，Microbiology，3rdEd.，Harper&Row，Philadelphia，PA(1980)，pp.290-295and381-418)。白细胞必须能够附着在内皮细胞上才能从循环中迁移到炎症部位。此外，它们必须附着于抗原呈现细胞上才能发生正常特异性免疫反应。最后，它们必须附着在适当靶细胞上才能溶解受到病毒感染的细胞或肿瘤细胞。
最近，已使用杂交瘤技术鉴定了参予介导上述附着作用介导之功能的白细胞表面分子。简单地说，已鉴定了抗人T细胞(Davignon，D.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78∶4535-4539(1981))和小鼠脾细胞(Springer，T.etal.，Eur.J.Immunol.9∶301-306(1979))的单克隆抗体，这些单克隆抗体可结合于白细胞表面并抑制上述粘附相关功能(Springer，T.etal.，Fed.Proc.44∶2660-2663(1985))。由这些抗体鉴定的分子被称为Mac-1和白细胞功能相关抗原-1(LFA-1)。Mac-1是见于巨噬细胞、粒细胞和大颗粒淋巴细胞上的杂二聚体。LFA-1是见于大多数淋巴细胞上的杂二聚体(Springer，T.A.etal.，Immunol.Rev.68∶111-135(1982))。这两种分子，加上第三种分子，即p150.95(它具有与Mac-1相似的组织分布)，均在细胞粘附中起作用(Keizer，G.etal.，Eur.J.Immunol.，15∶1142-1147(1985))。
已发现上述白细胞分子是糖蛋白相关家族的成员(Sunchez-Madrid，F.etal.，J.Exper.Med.158∶1785-1803(1983);Keizer，G.D.etal.，Eur.J.Immunol.15∶1142-1147(1985))，称为糖蛋白的“CD-18家族”。该糖蛋白家族由具有一个α链和一个β链的杂二聚体组成。虽然各抗原间的α链彼此不同，但β链却是高度保守的(Sanchez-Madrid，F.etal.，J.Exper.Med.158∶1785-1803(1983))。发现糖蛋白家族的β链分子量为95kd，而α链分子量则由150至180kd不等(Springer，T.，Fed.Proc.44∶2660-2663(1983))。虽然膜蛋白的α亚基并不分享由β亚基共有的延伸同源性，但最近对糖蛋白α亚基的分析表明它们之间具有实质上的相似性。Sanchez-Madrid，F.等人(J.Exper.Med.158∶586-602(1983);J.Exper.Med.158∶1785-1803(1983))评述了IFA-1相关糖蛋白之α和β亚基间的相似性。
已鉴定了一组不能以正常量在其白细胞表面上表达该粘附蛋白家族之任何成员的个体(Anderson，D.C.etal.，Fed.Proc.44∶2671-2677(1985);Anderson，D.C.etal.，J.Infect.Dis.152∶668-689(1985))。这些个体被认为患有“白细胞粘附缺陷性疾病”(“LAD”)(Anderson，D.C.，etal.，Fed.Proc.44∶2671-2677(1985);Anderson，D.C.，etal.，J.Infect.Dis.152∶668-689(1985))。LAD病人的特征性表现包括软组织损伤、脓腔形成和伤口不易愈合，以及体外粘附依赖性白细胞功能异常并对慢性及再发性细菌感染敏感。得自这些LAD病人的粒细胞的体外行为与它们的相应正常对照细胞于抗CD18单克隆抗体存在时有同样的缺陷性表现。即是说，它们不能执行集聚或附着于内皮细胞上等粘附相关功能。但更重要的是，观察到这些病人因为其粒细胞没有附着在细胞基质上的能力而不能产生正常炎症反应。最显著的是观察到由于这些LAD病人的粒细胞没有附着在接近炎症损伤部位之血管内皮细胞上的能力，故不能达到炎症部位如皮肤感染部位。这种附着是浸润的必要步骤。
这些病人的淋巴细胞表现的体外缺陷与那些CD-18分子家族已被抗体拮抗的正常对应细胞之缺陷相似。另外，由于这些个体的粒细胞不能粘附到细胞基质上，所以他们没有能力产生正常免疫反应(Anderson，D.C.etal.，FedProc.44∶2671-2677(1985);Anderson，D.C.etal.，J.Infect.Dis.152668-689(1985))。这些资料表明，当淋巴细胞由于缺少CD-18家族的功能性粘附分子而不能以正常方式粘附时，即表现减缓了免疫反应。
总之，白细胞为维持动物健康和存活能力，它们必须能够粘附在其他细胞(如内皮细胞)上。已发现这种粘附作用需要有白细胞表面上之特异性受体分子参予的细胞-细胞接触。这些受体能使白细胞粘附到其他白细胞、内皮细胞及其他非脉管细胞上。已发现LFA-1、Mac-1和p150，95等细胞表面受体分子是彼此间高度相关的。白细胞缺乏这些细胞表面受体的人易患慢性和再发性感染，以及包括缺陷性抗体反应在内的其他临床综合症。
此外，因为白细胞粘附参予了识别和排斥外来组织的过程，所以深入了解这一过程在实质性器官(如肾)移植、非实质性器官(如骨髓、组织)移植、变态反应及肿瘤学领域中有着重要价值。
HIV感染是爱滋病的病因。已描述了许多HIV变种两个主要变种是HIV-1和HIV-2。HIV-1流行在北美和欧洲，HIV-2在亚洲流行。病毒有相似的结构，并且编码有相似功能的蛋白质。据信HIV感染是通过病毒蛋白质(称为“gp120”)结合到存在于T4(“T辅助”)淋巴细胞表面上的受体分子(称为“CD4”)上而发生的(Schnittman，S.M.etal.，J.Immunol.141∶4181-4186(1988)，该文献列为本文参考文献)。当结合到该受体上后，病毒即进入细胞并复制，在此过程中杀死T细胞。因此个体之T4细胞群的破坏是HIV感染的直接结果。
T细胞的破坏使被感染病人抵抗机会感染的能力受到损害。虽然感染了受滋病的人常常成为肿瘤患者，但这些肿瘤与HIV感染之间的关系在大多数情况下尚不清楚。
虽然HIV病毒的复制对于被感染的细胞是致死性的，但只在一小部分被感染者的T4细胞中检测到这种复制。最近的研究结果提示，病毒血症的发生率比以前估计的要高，而且T细胞感染频率可高达1%。
几项研究工作阐明了HIV病毒介导T4群体破坏的其他机制。
除了HIV复制外，还可通过胞毒性杀伤细胞来破坏受HIV感染的细胞。杀伤细胞一般都存在于人体内，起到监视宿主及破坏可能遇到的外来细胞(如错配的输血或器官移植等)的作用。在感染HIV后，T细胞在其细胞表面上呈现gp120分子。杀伤细胞将这些T4细胞识别为外来细胞(而不是固有细胞)，进而破坏之。
HIV感染也可导致对未受感染之健康细胞的破坏。被感染细胞可向血液系统中分泌gp120蛋白质。然后游离的gp120分子便可结合到未受感染之健康细胞的CD4受体上。这种结合可使细胞呈现HIV感染之细胞的外表特征。胞毒性杀伤细胞识别已结合在未感染之T4细胞上的gp120，故认为此细胞是外来的，并介导细胞的破坏。
还有一个对于本发明特别有用的机制，该机制中，HIV是通过合胞体细胞形成引起T4细胞死亡。“合胞体细胞”是有多个核的巨大细胞，是由多达几百个T4细胞融合而形成的。感染HIV后使得被感染的细胞获得了与其他T4细胞(包括HIV感染的或未受感染的健康细胞)相融合的能力。合胞体细胞不能发挥正常功能，而且会很快死亡，从而导致HIV感染的和未感染的T4细胞的破坏。这一过程是本发明特别感兴趣的，因为它导致了T4细胞间的直接细胞-细胞接触。HIV感染之细胞形成合胞体的能力表明这些细胞需要有一种与健康细胞融合的手段。
HIV感染，特别是HIV-1感染，似乎影响白细胞整合素(integrins)的细胞表面表达，以及由这些杂二聚体介导的细胞粘附反应(Petit，A.J.，etal.，J.Clin.Invest.79∶188(1987);Hildreth，J.E.K.，etal.，Science244∶1075(1989);Valentin，A.，etal.，J.Immunology144∶934-937(1990);Rossen.，R.D.，etal.，Trans.Assoc.AmericanPhysicians102∶117-130(1989)，所有这些文献均列为本文参考文献)。在遭受HIV-1感染后，因CD18和CD11b的细胞表面表达而增加了U937细胞的同型聚集(Petit，A.J.，etal.，J.Clin.Invest.79∶188(1987))。HIV-1感染的U937细胞以比未受感染的U937细胞以更大的频率粘附到IL-1刺激的内皮细胞上;这一行为可在用抗CD18或抗CD11a单克隆抗体处理被感染细胞或用抗ICAM-1抗体处理内皮细胞基质后受到抑制(Rossen，R.D.，etal.，Trans.Assoc.AmericanPhysicians102∶117-130(1989))得以证实。也已发现抗CD18或CD11a单克隆抗体能够抑制涉及植物凝血素(PHA)刺激之淋巴母细胞和实质上被感染的CD4阴性T细胞的合胞体形成(Hildreth，J.E.K.，etal.，Science244∶1075(1989))。已发现只有用抗CD18或抗CD11a单克隆抗体处理的病毒感染细胞对合胞体形成几乎没有影响，这一点提示这些抗体基本上可保护未感染的靶细胞免受感染(Hildreth，J.E.K.etal.，Science244∶1075(1989);Valentin，A.etal.，J.Immunology144∶934-937(1990))。最近，Valentin等人(J.Immunology144∶934-937(1990))进一步证实了上述观察结果，发现当将连续的T细胞系与HIV-1感染U937细胞共培养时，对CD18特异的单克隆抗体可抑制合胞体形成。
虽然CD18或CD11a特异性单克隆抗体保护敏感细胞免于与HIV感染的细胞发生融合的机制尚不清楚，而且有关机制对于评价本发明也不是必要的，但用放射标记的gp120所作的研究提示，含有CD18的杂二聚体并不提供病毒的结合位点(Valentin，A.，etal.，J.Immunology144∶934-937(1990)。因此，HIV感染包括了细胞-细胞相互作用，和/或模拟这种细胞-细胞相互作用的病毒-细胞相互作用。细胞-细胞相互作用可导致无细胞病毒的运输或病毒感染的细胞穿越内皮屏障输送。模拟细胞-细胞相互作用的病毒-细胞相互作用可有利于或能够使游离病毒附着和/或感染健康细胞。
因此，本发明在一定程度上是基于HIV感染特别是HIV-1感染可提高CD11a/CD18杂二聚体及其结合配体的表达这一观察结果。这种表达的提高是很有意义的，因为它增强了HIV感染的T细胞彼此粘附或聚集的能力(即发生“同型聚集”)。因为在静止的正常白细胞间未见有这种同型聚集，所以这一发现表明CD11/CD18受体和/或配体如ICAM-1的表达是发生这种聚集所必需的。为了发生同型聚集，LFA-1必须结合到ICAM-1上。如本文所述，ICAM-3只是在静止T细胞上以高水平表达的ICAM分子家族的成员。除非T细胞是“被活化”的，否则只有抗ICAM-3抗体能够阻断T细胞在LFA-1上的粘附。因此，抗ICAM-3抗体可用于抑制T细胞的聚集。
此外，抗ICAM-3抗体可用于阻断被感染之T细胞的粘附过程，进而允许HIV-1由被感染细胞转递到病人的健康细胞，还允许或有利于游离病毒感染健康细胞。
C.HIV感染之细胞的迁移白细胞的迁移和散布对于保护个体免于进一步感染是很重要的。然而，这些过程也造成被病毒感染之白细胞的迁移和散布。特别引人关注的是被HIV感染的白细胞的迁移和散布。这些细胞的迁移导致血管外病灶的形成，并可引起肿瘤及其他异常。
受损器官的组织学检查显示有局部血管外单核细胞的浸润。试图鉴定中枢神经系统中浸润的病毒感染细胞，结果发现浸润物中存在HIV-1感染的细胞。这些研究表明，HIV-1病毒主要存在于单核细胞和巨噬细胞中，以及该谱系的其他细胞中(R.T.Johnson，etal.，FASEBJ.，2∶2970(1988);M.H.Stoleretal，J.Amer，Med.Assn.，256∶2360(1980);S.Gartneretal.，Science233∶215(1986))。
以前还没有确定刺激HIV-1感染之单核样细胞形成血管外浸润的机理。该机制可能涉及游离病毒的运输，或病毒在被感染之单核细胞胞浆内穿过内皮屏障的运输。
因为HIV-1感染刺激分子的细胞表面表达有利于白细胞在血管内皮细胞上粘附，而且有利于白细胞从血管中转移到血管外组织部位(C.W.Smithetal.，J.Clin.Invest.82∶1746(1988)，列入本文参考文献)，所以已有人提出使用抑制细胞迁移的抗体来防止HIV感染之细胞的扩散(WO90/13316)。
D.哮喘临床特征哮喘是一个异源的疾病家族，其特征是支气管对刺激物有高反应性(Kay，A.B.，AllergyandInflammation，AcademicPress，NY(1987);该文已列为本文参考文献)。临床上，可见有支气管普遍狭窄，有粘稠的分泌物，病人出现阵发性呼吸困难、咳嗽及喘鸣音等征象。虽然还不知道这些病征的相对后果，但总的结果是通气阻力增加，肺和胸部高度膨胀，以及换气及肺血流的异常分布。该病表现在无症状期间间或出现急性期症状。急性期可发生供氧不足并可导致死亡。全世界人群约有3%患哮喘病。
已描述了两种类型的哮喘变应性哮喘和特应性哮喘。变应性哮喘通常与可遗传的变态反应性疾病如鼻炎、荨麻疹、湿疹等有关。特征在于出现对皮下注射的空气传播抗原(如花粉、环境和职业污染物等)呈阴性风团-潮红反应，并且出现血清IgE水平增高。许多病人发展为变应性哮喘在病因上似乎与存在IgE抗体有关。未表现有上述特征的哮喘病人被认为是患有特应性哮喘。
据信变性性哮喘依赖于IgE反应，后者是由T和B淋巴细胞控制，并由空气传播抗原与结合肥大细胞之预形成IgE分子的相互作用而激活的。为使个体致敏，抗原须长期积聚以致达到足可导致IgE产生的浓度。一旦致敏，哮喘病人即可在对极低抗原水平的反应中出现症状。
哮喘可因足量触发抗原、环境因素、职业因素、体力劳动及情绪激动等因素而加重。
可以用甲基黄嘌呤(如茶碱)、β肾上腺素能激动剂(如儿茶酚胺、间苯二酚、水杨醇及麻黄素等)、糖皮质激素(如氢化可的松)、肥大细胞脱颗粒抑制剂(即色酮，如色甘酸钠)以及胆硷能拮抗剂(如阿托品)进行治疗。
据信哮喘包括了嗜伊红细胞向肺组织中流动(Frigas，E.etal.，J.AllergyClin.Immunol.77∶527-537(1986)，该文献列为本文参考文献)。
已根据支气管肺泡灌洗研究(Godard，P.etal.，J.AllergyClin.Immunol.70∶88(1982))的结果和对剥去上皮细胞之呼吸道平滑肌组织的研究(Flavahan，N.A.etal.，J.Appl.Physiol.58∶834(1985);Barnes，P.J.etal.，Br.J.Pharmacol.86∶685(1985))结果深入了解了哮喘的免疫学基础。虽然这些研究并没有最终阐明哮喘的免疫学机理，但它们已发展了一般可接受的涉及该病之免疫病因学的假说(参见Frigas，E.etal.，J.AllergyClin.Immunol.77∶527-537(1986))。
哮喘病的病理学特点是嗜伊红细胞对肺实质的大量浸润，以及粘膜纤毛容量的损害。“嗜伊红细胞假说”提示嗜伊红细胞被吸引到支气管上以中和由肺肥大细胞释放的有害介导物。根据这一假说，嗜伊红细胞被吸引到支气管上，在这里脱颗粒以释放胞毒性分子。脱颗粒后，嗜伊红细胞释放出酶，如组胺酶、芳基硫酸酯酶和磷酯酶D用以酶促中和肥大细胞的有害介导物。然而，这些分子也促进对粘膜纤毛组织的破坏，从而防碍了对支气管分泌物的清除并造成哮喘病的肺损伤性特征性改变。
因为哮喘涉及到细胞的迁移，故有人提出使用抑制这种迁移的抗体来缓解变应原对病人的影响(WO90/10453)。
本发明是基于发现了称为细胞间粘附分子3(ICAM-3)的新的细胞粘附分子。本发明还涉及ICAM-3的功能性衍生物，抗ICAM-3抗体、成为人抗ICAM-3抗体的所说抗体的片段，以及能够结合并抑制ICAM-3之生物学功能的其他分子。
本发明还包括所有上述分子的诊断及治疗应用。
具体地说，本发明包括基本上没有天然污染物的ICAM-3或其功能性衍生物。
本发明提供了获得能够编码、或表达ICAM-3或其功能性衍生物的重组或合成DNA之分子的方法。
本发明还提供了能够结合到选自ICAM-3及其功能性衍生物的分子上的抗体，特别是单克隆抗体。
本发明还提供了能够产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞。
本发明包括产生所需杂交瘤细胞的方法，所说的杂交瘤细胞能产生可与ICAM-3或其功能性衍生物结合的抗体，该方法包括下列步骤a)用选自实质上纯的ICAM-3、表达ICAM-3的细胞、表达ICAM-3的细胞的膜、与载体结合的ICAM-3、ICAM-3的肽片段或与载体结合之ICAM-3的肽片段的免疫原免疫动物，b)将从所说被免疫动物体内分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，
c)使已融合的脾和骨髓瘤细胞形成能分泌抗体的骨髓瘤细胞，d)筛选能产生抗ICAM-3抗体的杂交瘤细胞。
本发明还提供了调节ICAM-3介导的细胞生物学功能的方法，所说的方法包括给需要这种处理的对象使用有效量的ICAM-3调节剂，其中所说的ICAM-3调节剂选自能与ICAM-3结合的抗体、所说抗体的能够与ICAM-3结合的片段、ICAM-3、ICAM-3的功能性衍生物、以及除ICAM-1、ICAM-2或CD-18分子家族成员外的非免疫球蛋白拮抗剂。
本发明还提供了治疗人及其他哺乳动物的特异性炎症的方法，所说的方法包括给需要这种治疗的对象使用足可抑制炎症量的抗炎剂，其中抗炎剂选自能够与ICAM-3结合的抗体，所说抗体的能够与ICAM-3结合的片段，实质上纯的ICAM-3、ICAM-3的功能衍生物或ICAM-3的非免疫球蛋白拮抗剂，其中所说的炎症是由实质性器官移植(如肾)、非实质性器官移植(如骨髓)或组织移植引起的。
本发明还提供了治疗人及其他哺乳动物的非特异性炎症的方法，所说的方法包括给需要这种治疗的对象使用足以抑制炎症量的抗炎剂，其中抗炎剂选自能够与ICAM-3结合的抗体、所说抗体的能够与ICAM-3结合的片段、基本上纯的ICAM-3、ICAM-3的功能性衍生物、或ICAM-3的非免疫球蛋白拮抗剂。
本发明进一步包括上述治疗炎症的方法，其中炎症是与选自下列的各病理条件有关的成年人呼吸窘迫综合症;继发于败血症、出血或创伤的多器官损伤综合症;心肌或其他组织的再灌注损伤;急性肾小球肾炎;反应性关节炎;伴有急性炎症的皮肤病;急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎性疾病，如中风;热损伤;血液透析;白细胞异型症;溃疡性结肠炎;克罗恩氏病;坏死性小肠结肠炎;粒细胞输注相关综合症以及细胞活素诱导的毒性。
本发明还包括抑制造血肿瘤细胞(该细胞迁移时须利用CD-18的成员，特别是LFA-1)转移的方法，所说的方法包括给需要这种治疗的病人提供足可抑制上述转移量的制剂，其中所说的制剂选自能够与ICAM-3结合的抗体、所说抗体的毒素相关衍生产物、所说抗体的能够与ICAM-3结合的片段、所说片段与毒素的衍生物、ICAM-3的功能性衍生物、所说ICAM-3之功能性衍生物的毒素相关衍生产物、或除CD-18分子家族成员外的ICAM-3的非免疫球蛋白拮抗剂。
本发明还包括抑制表达ICAM-3之肿瘤细胞生长的方法，所说的方法包括给需要这种治疗的病人提供足可抑制生长的制剂，其中所说的制剂选自能够与ICAM-3结合的抗体，所说抗体与毒素的衍生产物、所说抗体的能够与ICAM-3结合的片段、所说片段与毒素的衍生产物、CD-18分子家族的毒素衍生的成员、或CD-18分子家族成员的毒素衍生的功能性衍生物。
本发明还提供了检测是否存在表达ICAM-3之细胞的方法，所说的方法包括a)在能够与ICAM-3mRNA杂交的核酸分子存在下培养细胞或细胞提取物，以及b)检测已与存在于所说细胞或细胞提取物内的互补核酸分子杂交的核酸分子。
本发明还提供了检测生物体液样品中是否存在ICAM-3的方法，该方法包括a)用能够与ICAM-3结合的抗体或其片段与所说的样品一起保温，以及b)检测所说的抗体是否结合了所说的样品。
本发明还提供包括下列成分的药物组合物a)选自下列一组的制剂能够与ICAM-3结合的抗体;所说抗体的能与ICAM-3结合的片段，基本上纯的ICAM-3，ICAM-3的功能性衍生物，或除CD-18分子家族成员外的ICAM-3的非免疫球蛋白拮抗剂;以及b)一种免疫抑制剂。
图1显示细胞系(A)和淋巴细胞(B)对由ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3代表的纯化之LFA-1的粘附。(A)在对IFA-1、ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3特异的封闭MAb存在下，BCECF标记的细胞结合在IFA-1包被的微量滴定孔上。对照孔没有用LFA-1包被。
图2显示对细胞之ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3表达的流动细胞计数分析结果。(A)用饱和量的MAbRR1/1(抗ICAM-1)、MAbCB-IC2/1(抗ICAM-2)、MAbCBR-IC3/1(抗ICAM-3)或非结合的对照MAbX63(细线)标记淋巴母细胞系，然后加入FITC抗小鼠免疫球蛋白。(B)按上述方法分析静止人淋巴细胞和PHA活化3天的淋巴细胞的ICAM表达。
图3显示ICAM-3的免疫沉淀。(A)用MAb CB-IC3/1(抗ICAM-3)的非结合对照X63免疫沉淀的125I抗标记的细胞溶胞产物;(B)用(+)或不用(-)N-聚糖酶处理的、并用非结合对照MAb X63、MAb W6/32(抗HLA-A、B、C)、MAb RR1/1(抗ICAM-1)、MAb CBR-IC2/1(抗ICAM-2)或MAb CB-IC3/1(抗ICAM-3)免疫沉淀的125I标记的SKW3细胞溶胞产物。
图4显示对从不同来源分离之ICAM-3的Western印迹分析。按实施例中所述方法从淋巴细胞及嗜中性白细胞中分离ICAM-3。经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析已分离的ICAM-3并使用不同的抗体进行Western印迹分析。
图5显示PMA对SKM3结合ICAM-1和ICAM-3的影响。按以前所述方法试验SKW3细胞结合纯化之ICAM-1和ICAM-3的能力，以及PMA刺激对这种结合的影响。
图6显示抗体阻断及PMA刺激的SKW3细胞粘附情况。按以前所述方法试验各种抗体阻断PMA刺激的SKW3细胞与纯化的ICAM-1或ICAM-3结合的能力。
图7显示COS细胞转染体与纯化之ICAM的结合情况。按以前所述方法用LFA-1表达载体转染COS细胞。然后检测已转染细胞在加或不加抗LFA-1抗体(TS1/22)时与固相化ICAM-1和ICAM-3结合的能力。
图8显示PMA刺激的SKW3结合ICAM的温度依赖性。按以前所述方法在4、16、22和37℃条件下检测PMA刺激的SKW3细胞与纯化的ICAM-1和ICAM-3结合的能力。
图9显示温度对PMA刺激的T细胞与ICAM-3结合的影响。在17、22和37℃下检测PMA刺激的T细胞结合纯化之ICAM-3的能力。
图10显示抗体阻断PHA刺激的T细胞分化。按以前所述方法检测各种抗体阻断PHA刺激之T细胞分化的能力。
图11显示抗ICAM抗体对混合的淋巴细胞反应的影响。按以前所述方法试验各种抗体阻断混合的淋巴细胞反应的能力。
图12显示ICAM-3肽片段的气相层析结果。纯化并用Lys-C消化ICAM-3。按以前所述方法经高效液相层析分析肽片段。
图13显示克隆11.2的酶切图。其中指出了NK10和NK17肽、如此得到的各种DNA序列及跨膜区的位置。
图14对NK10蛋白质与人ICAM-1的序列作了比较。使用GAP程序鉴定NK-10蛋白质及人ICAM-1蛋白质的序列同源性。
图15比较了RM13引发的序列与人ICAM-1的序列。使用GAP程序鉴定RM13引发之序列与人ICAM-1的序列同源性。
图16比较了RM13引发的序列与人ICAM-2的序列。使用GAP程序鉴定RM13引发之序列与人ICAM-2的序列同源性。
图17比较了T7引发的序列与人ICAM-1的序列。使用GAP程序鉴定T7引发之序列与人ICAM-1的序列同源性。
图18比较了T7引发的序列与人ICAM-2的序列。使用GAP程序鉴定T7引发之序列与人ICAM-2的序列同源性。
图19显示ICAM-3的部分序列。使用标准方法检测克隆11.2的DNA序列。
A.从ICAM-3的5′端得到的序列。这些序列是用T7引物引发而得到的。
B.在ICAM-3基因内得到的序列。这些序列是用NK-10探针引发克隆11.2而得到的。
C.从ICAM-3的3′端得到的序列。这些序列是用反向RM13引物引发克隆11.2而得到的。
本发明基于发现了以前尚未鉴定的与LFA-1结合的配体。如那些参予了分子粘附过程并被称为“粘附分子”的CD-18家族的分子。
Ⅰ.LFA-1在免疫和炎症过程中，白细胞粘附分子LFA-1介导白细胞、单核细胞、天然杀伤细胞及粒细胞等多种细胞与其他细胞的相互作用(Springer，T.A.etal.Ann.Rev.Immunol.5∶223-252(1987))。
LFA-1是ICAM-1、ICAM-2和新近鉴定的ICAM-3(如本文所公开的)的受体。这些表面分子在某些组织上得以表达并在炎症过程中在其他组织上被诱导产生(Marlin，S.D.etal.，Cell51∶813-819(1987);Dustin，M.L.etal.，J.Immunol.137∶245-254(1986);Dustin，M.L.etal.，Immunol.Today，9∶213-215(1988);美国专利申请序号07/019，440(申请日1987年2月7日)和美国专利申请序号07/250，446(申请日1988年9月28日)，此两份专利文献均列为本文参考文献)。
LFA-1在抗原特异性和抗原非依赖性T胞毒性细胞、T辅助细胞、粒细胞及单核细胞与其他类型细胞的相互作用中发挥作用(springer，T.A.etal.，Ann.Rev.Immunol.5∶223-252(1987);Kishimoto，T.K.etal.，Adv.Immunol.(1988，待出版))。
Ⅱ.ICAM-1ICAM-1是存在于不同细胞上分子量可由76至114KD不等的单链糖蛋白，并且是有5个类C区域的Ig超家族的成员(Dustin，M.L.etal.，Immunol.Today9∶213-215(1988);Staunton，D.E.etal.，Cell52∶925-933(1988);Simmons，D.etal.，Nature331∶624-62)(1988))。ICAM-1可很容易地被包括IFN-g、TNF及IL-1在内的细胞活素诱导，在多种不同类型细胞上产生(Dustin，M.L.etal.，Immunol.Toady9∶213-215(1988))。在内皮细胞、上皮细胞及成纤维细胞上诱导产生的ICAM-1可介导淋巴细胞的LFA-1依赖性粘附(Dustin，M.L.etal.，J.Immunol.137∶245-254(1986);Dustin，M.L.etal.，J.Cell.Biol.107∶321-331(1988);Dustin，M.L.etal.，J.Exp.Med.167∶1323-1340(1988))。可在用LFA-1MAb预处理淋巴细胞或用ICAM-1MAb预处理其他细胞后阻断粘附作用(Dustin，M.L.etal.，J.Immunol.137245-254(1986);Dustin，M.L.etal.，J.CellBiol.107321-331(1988);Dustin，M.L.etal.，J.Exp.Med.1671323-1340(1988))。在人工膜中或平皿上用纯化之ICAM-1鉴定的结果证明，LFA-1和ICAM-1互为受体(Marlin，S.D.etal.，Cell51∶813-819(1987);Makgoba，M.W.etal.，Nature331∶86-88(1988))。为了清楚起见，本文中将它们分别称为“受体”和“配体”。美国专利申请序号07/045，963、07/115，798、07/155，943、07/189，815或07/250，446(所有这些专利申请文献均全文列为本文参考文献)中对ICAM-1作了进一步的描述。
Ⅲ.ICAM-2已推测了不同于ICAM-1的其他LFA-1配体(Rothlein，R.etal.，J.Immunol.137∶1270-1274(1986);Makgoba，M.W.etal.，Eur.J.Immunol.18∶L637-640(1988);Dustin，M.L.etal.，J.CellBiol.107∶321-331(1988))。所鉴定的第二种LFA-1配体被定名为“ICAM-2”。
ICAM-2在细胞分布及缺少细胞活素诱导两方面不同于ICAM-1。ICAM-1是具有2个类Ig区域的整合膜蛋白，而ICAM-2则具有5个类Ig区域(Staunton，D.E.etal.，Cell52∶925-933(1988);Simmons，D.etal.，Nature331∶624-627(1988))。更重要的是，ICAM-2与ICAM-1的两个最N末端区域的关系要比ICAM-1或ICAM-2与Ig超家族其他成员的关系更为密切，证明了类Ig配体的亚家族结合了同一整合因子家族受体。美国专利申请序号07/454，294中对ICAM-2作了进一步的描述(该专利申请列为本文参考文献)。
Ⅳ.ICAM-3本发明涉及发现了称为“ICAM-3”的第三种LFA-1配体。
发展抗ICAM-2的MAb可得以分析几个以前观察到的LFA-1依赖性、ICAM-1非依赖性现象，并提示存在LFA-1的第三种配体。联合使用ICAM-1和ICAM-2MAb可完全阻断上皮细胞及内皮细胞等几种类型细胞与纯化之IFA-1的结合，而包括T细胞淋巴瘤细胞系SKW3在内的许多淋巴样细胞系上则存在有针对LFA-1的ICAM-1、ICAM-2非依赖性粘附途径(图1)。
为了阐明这一粘附途径，产生了与抗ICAM-1和抗ICAM-2MAb相一致的抗SKW3MAb，并根据其抑制该细胞系与纯化之LFA-1相结合的能力筛选之。选择出的一种MAb，即CBR-IC3/1可完全抑制这一新的粘附途径(图1)。联合使用阻断性抗ICAM-1和抗ICAM-2MAb只能轻度抑制SKW3对纯化之LFA-1的粘附。当单独加入抗ICAM-3MAb(CB-IC3/1)时可显著地抑制粘附，并且当与阻断性抗ICAM-2MAb合用时可达到完全抑制。因此，SKW3对纯化之LFA-1的粘附在很大程度上是由ICAM-3介导的，且一部分是由ICAM-2介导的。如根据MAb的不同抑制曲线所证明的，在对LFA-1的粘附中，四个细胞系分别在不同程度上利用这三种ICAM。B淋巴母细胞系JY的粘附主要是通过ICAM-1途径，且ICAM-2和ICAM-3也有一定的贡献。另一个B淋巴母细胞系SLA则利用了ICAM-1和ICAM-3两者，因为单独用ICAM-1或ICAM-3MAb不能抑制粘附，只有合用两种MAb时才能完全抑制。胸腺瘤细胞系Jurkat粘附时使用了ICAM-2和ICAM-3途径，且ICAM-1也有较小的贡献。还研究了静止T淋巴细胞及用植物凝血素(PHA)激活之T淋巴细胞的粘附作用(图1B)。以前的研究显示静止淋巴细胞可与纯化的LFA-1强有力地结合(Dustinetal.，Nature341∶619-624(1989))，而且发现这种结合在很大程度上是依赖于ICAM-3的。在用PHA激活后，诱导了ICAM-1表达并主要通过ICAM-1，且部分地通过ICAM-3发生对LFA-1的粘附。在静止和激活的T细胞中，虽然粘附的ICAM-2成分因ICAM-1和ICAM-3的存在而受到掩盖，但仍是可以检测的。因为对于每种细胞来说，为达到基本抑制至少需要抗两种ICAM的抗体，所以在使用ICAM中可相当多的剩余有关成分。值得注意的例外是，静止淋巴细胞对LFA-1的粘附在很大程度上是由ICAM-3介导的。在所有情况下，合用三种抗ICAMMAb排除与LFA-1的结合，并与在抗LFA-1MAb存在下所达到的水平差不多。
可以比较三种ICAM对结合LFA-1的贡献(如上面检测的)与用免疫荧光流动细胞计数法测得的它们的细胞表面表达情况，以确定三种ICAM对LFA-1的相对亲和性(图2)。比较ICAM的表面表达及它们对LFA-1粘附的贡献，揭示ICAM-1对LFA-1具有更大的亲和性，ICAM-2和ICAM-3则具有相似的、但较低的亲和性。例如，Jurkat细胞能以相似水平表达ICAM-和ICAM-3，并各自对与LFA-1的结合作出贡献。当ICAM-2表达大于ICAM-3的表达时(如在JY细胞上)，LFA-1粘附的ICAM-2途径即超过ICAM-3。相反，SLA和SKW3表达的ICAM-3要比ICAM-2多2-5倍，这一点是完全可以理解的，因为粘附的ICAM-3途径优于ICAM-2途径。ICAM-3可在静止T淋巴细胞上得到很好的表达，而且没有ICAM-1，对LFA-1的粘附主要是通过ICAM-3介导的。当充分表达ICAM-1时(如在SLA、JY及PHA激活的T细胞的情况下)，ICAM-1便成了粘附的主要途径。
ICAM-3的分布以几种方式有别于ICAM-1和ICAM-2。与ICAM-1和ICAM-2不同，ICAM-3没有在静止或激活的内皮细胞上表达(资料未示出)。这一点与下述发现相符即细胞与静止和受刺激的内皮细胞的LFA-1依赖性结合是一种ICAM-1和ICAM-2依赖性现象。ICAM-3只限于造血细胞谱系，除少数例外，其可在淋巴样细胞及单核细胞系上得以高度表达。但在各种情况下，ICAM-3在细胞系上的表达均与粘附的LFA-1依赖性、ICAM-1、ICAM-2非依赖性途径相一致。单单通过ICAM-1和ICAM-2结合LFA-1的细胞系未显示有ICAM-3的表达，而显示通过该第三粘附途径产生微弱结合的细胞系(JY、U937、SupT)则具有相应低的ICAM-3表面表达(资料未示出)。
就ICAM-3在白细胞上的表达来说，它明显不同于ICAM-1和ICAM-2(图2B)。ICAM-3能以高水平在静止淋巴细胞、单核细胞及嗜中性细胞上表达，但ICAM-1和ICAM-2的表达则要弱得多或没有表达。通过比较，可知单核细胞上能微弱地表达ICAM-1和ICAM-2，且只有ICAM-2存在于静止淋巴细胞上。ICAM-1和ICAM-2均不在嗜中性细胞上表达。在用PHA激活淋巴细胞后，ICAM-3表达增加了2-3倍，而ICAM-1表达则受到显著地诱导(Dustinetal.，J.Immunol.137∶245-254(1986))(图2B)。
得自各种125I标记的细胞系的ICAM-3免疫沉淀物在还原条件下呈现出一条分子量约124，000的清晰带，同时在非还原条件只稍微增加了迁移率(图3A)。用N-聚糖酶处理后产生较低分子量的ICAM-3的带(Mr87，000)，这表明ICAM-3和ICAM-1及ICAM-2一样是高度糖基化的蛋白质(图3B)。ICAM-3的生物化学特性、表达模式及粘附性质均不同于以前描述的粘附分子，包括人“归巢”受体LAM-1(Tedderetal.，Immunol.144∶532-540(1990))、可诱导的内皮细胞粘附分子VACAM-1(Riceetal.，J.Exp.Med.171∶1369-1374(1990);Carlosetal.，Blood(1990，待出版);Osbornetal.，Cell59∶1203-1211(1989))，和VLA家族的基质受体(Hemler，M.E.，Ann.Rev.Immunol.8∶365-400(1990))，以及见于第四白细胞数据库中的具相似细胞分布的非MAb(Gilks，W.R.，etal.，LeukocyteTypingDataBaseⅣ，OxfordUniversityPress，Oxford，England(1990))。
存在三种LFA-1配体这一事实提示对LFA-1依赖性白细胞相互作用之不同方面的特异化。ICAM-1主要是在内皮细胞及许多类型上皮细胞上表达，且在炎症及免疫条件下受到强诱导，以调节细胞定位并有利于特异性抗原识别(Wawryketal.，Immunol.Rev.108∶135-161(1989))。因为ICAM-2是静止内皮细胞上的主要LFA-1配体，所以该粘附途径对于携带LFA-1的淋巴细胞通过组织内皮细胞进行正常再循环具有重要意义(Hamannetal.，J.Immunol.140∶693-699(1988);Mackayetal.，J.Exp.Med.171∶810-817(1990);Palsetal.，J.Immunol.140∶1851-1853(1988);Nunoietal.，Hum.Path.19∶753-759(1988))。ICAM-3在嗜中性细胞上的功能目前仍不清楚。尽管存在LFA-1，但嗜中性细胞的同型聚集似乎主要是依赖Mac-1的(Andersonetal.，J.Immunol.137∶15-27(1986);Patarroyoetal.，Scand.J.Immunol.22∶619-631(1985))。静止T淋巴细胞主要通过ICAM-3粘附LFA-1，而且ICAM-3在单核细胞和静止淋巴细胞上要比其他LFA-1配体能得以更好地表达，这些发现和事实表明其在发动免疫反应中具有重要作用。T细胞与抗原呈现细胞的粘附确实需要有LFA-1∶ICAM相互作用(Dransfieldetal.，Imm.Rev.114∶29-44(1990);Makgobaetal.，Immunol.Today10∶417-422(1989))，而且在静止T细胞上更可能是ICAM-3在起作用，因为该类型细胞上不能很好地表达ICAM-1和ICAM-2。确实，在异源和自体混合淋巴细胞反应中，提示是LFA-1配体而不是ICAM-1在起作用(Bagascoetal.，CellImmunol.128∶362-369(1990))。此外，推测ICAM-3在T和B淋巴细胞间的抗原特异性相互作用应是很重要的，因为此时其中一种尚未被激活。ICAM-3可在依赖于LFA-1但不依赖于ICAM-1的T细胞对某些靶细胞的溶解中起到重要作用(Makgobaetal.，Eur.J.Immunol.18∶637-640，(1988))。
存在多种ICAM，对于使用抗ICAM或ICAM类似物的MAb进行临床治疗具有重要关联。ICAM-1MAb在体内延长肾(Cosimietal.，J.Immunol.144∶4604-4612(1990))和心(Flavinetal.，Transplant.Proc.23∶533-534(1991))同种移植中是有效的。因为ICAM-3MAb可抑制不同亚组细胞类型的LFA-1依赖性相互作用，故可在体内用于抑制特定的和许多交叉的免疫反应。
Ⅴ.ICAM-3的cDNA克隆可用多种方法来克隆ICAM-3基因。其中一种方法是分析cDNA插入物(衍生于ICAM-3表达细胞)的穿梭载体文库，以确定含ICAM-3基因之插入物的存在。可用载体转染细胞，然后检测ICAM-3的表达，以进行这一分析。
最好使用Aruffo和Seed(Seed，B.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84∶3365-3369(1987))的改进方法鉴定ICAM-3cDNA，以鉴定粘附分子的配体。在该方法中，从表达ICAM-3的细胞(如SLA、Jurkat或SKW3淋巴母细胞系)中制备cDNA文库。更好是从T细胞制备cDNA文库。用该文库转染正常情况下不表达ICAM-3的细胞(如Cos或Hela细胞)。将转染的细胞引入预先已用LFA-1或抗ICAM-3抗体包被的平皿内。含有ICAM-3编码序列，并在其细胞表面上表达该配体的被转染细胞将粘附于平皿表面上的LFA-1或抗ICAM-3抗体上。洗掉非粘附细胞，然后从平皿中除去粘附细胞并培养之。然后除去在这些细胞内表达其序列的重组体ICAM-3并进行序列分析。
如用LFA-1包被平皿，可向平皿内加入抗ICAM-1和抗ICAM-2特异性抗体，以防止ICAM-1或ICAM-2表达细胞的粘附。如此可用抗体如RR1/1(抗ICAM-1 MAb)和CBR-1C2/2(抗ICAM-2 MAb)抑制ICAM-1+或ICAM-2+转化体粘附到LFA-1包被的平皿上。ICAM-3转染的细胞与LFA-1包被之平皿的结合可被EDTA和抗LFA-1 MAb抑制，但不能被抗IACA-1或抗ICAM-2 MAb抑制。因此ICAM-1或ICAM-2表达细胞不能粘附到平皿上，故大多数可与所有其他非粘附细胞一起被洗掉，从而富集了表达ICAM-3的细胞。
获得编码ICAM-3之基因序列的其他可选用方法是本领域中已知的，而且本领域技术人员可选用其中一种方法得到所需基因。
获得编码ICAM-3之基因序列的一种方法是使用寡核苷酸探针筛选cDNA或基因组文库。该方法中，可使用本领域中已知的纯化方法纯化ICAM-3蛋白质，并使用本领域中已知的方法测定其末端氨基酸序列。另外，可制备ICAM-3的基因图，并测定内在片段之一的氨基酸序列。
一旦测定了部分氨基酸序列，即可基于生物体展示的优选密码子制备寡核苷酸探针，或者基于所有可能的密码子组合制备简并探针。然后用该探针筛选其序列与探针杂交的基因组或cDNA文库。
另外也可使用基因组得到编码ICAM-3的cDNA克隆(Watson，J.D.，InMolecularBiologyoftheGene，3rdEd.，W.A.Benjamin，Inc.，MenloPark，CA(1977)，pp.356-357)，以确定能编码ICAM-3蛋白质或ICAM-3蛋白质之肽片段氨基酸序列的多聚苷酸探针。然后用此探针检测cDNA文库(从分离自ICAM-3表达细胞的mRNA制备的)中编码ICAM-3蛋白质的成员或检测基因组DNA文库中能与该寡核苷酸杂交的基因组序列。
使用上述技术或上述的相似技术可成功地克隆编码人醛脱氢酶(Hsu，L.C.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82∶3771-3775(1985))，粘连蛋白(Suzuki，S.etal.，Eur.Mol.Biol.Organ.J.4∶2519-2524(1985))、人雌激素受体(Walter，P.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82∶7889-7893(1985))及组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(Pennica，D.etal.，Nature301∶214-221(1983))的基因。
在克隆ICAM-3基因的另一种方法中，可经克隆得自表达ICAM-3之细胞的基因组DNA，更好是cDNA来制备表达文库。然后筛选文库中能够表达与抗ICAM-3抗体结合之蛋白质的成员。
可将按上述任一方法制得的克隆的ICAM-3基因可操作地连接到表达载体上，并导入细菌或真核细胞中以产生ICAM-3蛋白质。基因操作技术可参见Maniatis，T.等人的上述文献，这些技术都是本领域中已知的。
Ⅵ.本发明的试剂ICAM-3呼基功能性衍生物，激动剂和拮抗剂本发明进一步涉及ICAM-3，其“功能性衍生物”、其“激动剂”和“拮抗剂”。
A.ICAM-3的功能性衍生物ICAM的“功能性衍生物”是与ICAM具有基本上相似之生物学活性(功能或结构的)的化合物。术语“功能性衍生物”包括亲代ICAM-3分子的“片段”、“变异体”和“化学衍生物”。
ICAM-3的“片段”是指分子的多肽亚组。ICAM-3的片段最好是具有ICAM-3活性并且是可溶性的(即没有与膜结合的)。可溶性片段较好是通过删除亲代分子的跨膜区或用亲水氨基酸残基取代疏水残基产生的。鉴定这些残基的方法是本领域中已知的。
ICAM-3的“变异体”是指结构和功能上基本上与整个分子或其片段相似的分子。
如果两分子具有基本上相似的结构或生物学活性，则可以说一个分子“基本上相似”于另一个分子。因此，就本文所用的术语来说，即使一个分子具有另一个分子中没有的结构，或该序列具有不完全相同的氨基酸残基，只要两分子有相似活性，也被认为是变异体。
就本文所用术语来说，当一个分子含有不是天然分子之正常部分的附加化学部分时，则该分子被说成是另一个分子的“化学衍生物”。所说的部分可能改善分子的溶解性、吸附性及生物学半寿期等。该部分也可能降低分子的毒性或消除或减弱分子的有害付作用。Remington′sPharmaceuticalSciences(1980)中公开了能够介导这种作用的分子部分。
“毒素衍生的”分子构成了一类特殊的“化学衍生物”。“毒素衍生的”分子是共价结合到毒素部分上的分子(如ICAM-3或抗ICAM-3抗体)。偶联这些部分的方法是本领域中已知的。
将这样的分子连接到细胞上，可使毒素部分更接近于细胞从而促使细胞死亡。可使用任何适当的毒素部分;但较好是使用蓖麻蛋白毒素、霍乱毒素、白喉毒素、放射性核素毒素或膜通道形成毒素。
可使用常规合成方法在体外制备具有多达100个残基的ICAM-3功能性衍生物。必要时，可用已知方法修饰这样的片段，包括使纯化的或粗制蛋白质的靶氨基酸残基与能够同选择的侧链或末端残基反应的有机化学修饰剂反应。可使用所得共价衍生物鉴定那些对于生物学活性很重要的残基。
可用许多方法产生并分离ICAM-3的片段。可使用双功能试剂将ICAM-3交联到非水溶性载体基质上。另外，可使用溴化氰活化的碳水化合物等反应性非水溶基质及美国专利3，969，287、3，691，016、4，195，128、4，247，642、4，229，537及4，330，440中所述的反应性基质来固定蛋白质。
也可通过突变编码ICAM-3的DNA来制备改变了氨基酸序列的ICAM-3的功能性衍生物。例如，这样的功能性衍生物包括ICAM-3之氨基酸序列内残基的缺失、插入或取代等形式。可利用缺失、插入和取代的任何结合形式产生最后的构建体，只要该构建人有所需活性即可。很显然，将在编码功能性衍生物之DNA中造成的突变一定不能使序列处于读码外，且最好不会造成将产生次级mRNA结构的互补区域(参见EP专利申请公开号75，444)。
可通过对编码ICAM-3的DNA进行定点诱变，以产生编码功能性衍生物的DNA，然后在重组细胞培养物中表达该DNA，从而在基因水平上制备功能性衍生物。
虽然可预先确定在氨基酸序列中引入突变的位点，但突变本身并不需要预先确定。例如，为了使在给定位点上的突变达到最佳效果，可在靶密码子处或靶区域内进行随机诱变如引入扫掠诱变，以产生大量其后能得以表达的衍生物，并筛选有最佳组合的所需活性。在已知DNA序列中的预定位点上造成突变的技术是已知的，例如位定特异性诱变方法。
本发明功能性ICAM-3衍生物的制备，最好通过对编码ICAM-3或较早制备的ICAM-3之功能性衍生物的DNA进行定点诱变来完成。定点诱变技术是本领域中已知的，如参见Maniatis，T.etal.，MolecularCloning，ALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，NY(1982)，该文献列为本文参考文献。定点诱变允许我们通过编码所需突变之DNA序列的特定寡核苷酸序列产生ICAM-3的功能性衍生物。
可使用位点特异性诱变方法产生氨基酸缺失、插入或取代。氨基酸序列缺失一般是大约1-30个残基，较好是1-10个残基，而且一般是连续的。最优选的缺失是那些可产生可溶性ICAM-3的缺失。最好通过缺失ICAM-3的跨膜区域或ICAM-3内的疏水残基来产生可溶形式的ICAM-3。
氨基酸插入包括在ICAM-3编码序列内插入单个或多个氨基酸残基以及与基本上不限长度之多肽进行末端融合。序列内插入(即在完整ICAM-3分子序列内插入)的序列范围一般为1-10个残基，更好是1-5个残基。末端插入的一个例子包括将单个异源或同源于宿主细胞的序列融合到分子的N末端上，以利于从重组宿主内分泌衍生物。
第三组功能性衍生物是那些已去掉了ICAM-3分子中之一个或多个氨基酸残基并在该位置插入了不同残基的衍生物。如期望更精确地调整ICAM-3分子的特征，可按下表进行优选取代。
表1原始残基举例的取代可选择比表1中所示氨基酸有更少保守性的取代，即选择那些对于保持(a)取代区域中多肽骨架结构，如片层或螺旋构象，(b)靶位点上带电性或分子疏水性，或(c)侧链大小起到明显不同作用的残基，以对分子的功能或免疫学性质进行实质性改变。一般说来，较少保守的取代是那些其中(a)甘氨酸和/或脯氨酸被另一氨基酸取代，或缺失或被插入;(b)用亲水残基取代疏水残基;(c)以半胱氨酸取代(或被取代)任何其他残基;(d)以具有正电荷侧链的残基取代(或被取代)具有负电荷的残基;或(e)以带有大侧链的残基取代(或被取代)带有这样一个侧链的残基的取代。
最优选的是能够影响ICAM-3之溶解度的取代，且最好是通过用亲水氨基酸取代疏水氨基酸而产生的。
为提高ICAM-3的亲和性，可按照引入存在于ICAM-1或ICAM-2中之同源位置上的氨基酸残基的指导思想来设计突变。同样，可以制备这类在IACM-1或ICAM-2听同源位置上缺少N连接之CHO的突变体ICAM-3分子。
在进行这些工作之前，很难于预测任何特定的取代、缺失或插入将对ICAM-3的生物学活性产生的准确影响。但本领域技术人员会理解到，可借助常规筛选方法来估计其作用。例如，典型地可通过对编码天然ICAM-3分子的DNA进行接头扫掠定点诱变来制得衍生物。然后在重组宿主内表达该衍生物，并利用例如免疫亲和层析法从细胞培养物中纯化之。
然后以适当的筛选方法根据预期特征筛选细胞溶胞产物或纯化之衍生物的活性。例如，可用竟争性免疫检测法检测功能性衍生物之免疫学特性的改变，如对已知抗体之亲和性的改变。可用本领域普通技术人员公知的方法改变这种蛋白质的性质，如氧化还原或热稳定性、生物学半寿期、疏水性、对蛋白水解降解作用的敏感性，或与载体聚合或聚合成多聚体的倾向等。
B.ICAM-3的激动剂和拮抗剂ICAM-3的“激动剂”是指能提高或增加ICAM-3完成其任何生物学功能之能力的化合物，例如可以提高ICAM-3与细胞受体结合之能力的制剂。
ICAM-3的“拮抗剂”是指能降低或阻止ICAM-3完成其任何生物学功能之能力的化合物。这样的拮抗剂的例子包括ICAM-1和ICAM-2，ICAM-1和ICAM-2的功能性衍生物、抗ICAM-3抗体、抗LFA-1抗体等。
美国专利申请序号07/045，963、07/115，798、07/115，943、07/189，815或07/250，446(这些专利申请均全文列为本文参考文献)中所述的细胞聚集试验能够检测LFA1依赖性聚集，并因此可用于鉴定影响ICAM-3/LFA-3聚集程度的制剂。因此，这些检测法可用于鉴定ICAM-3的激动剂和拮抗剂。拮抗剂可通过恢复LFA-1或ICAM-3介导聚集的能力而发挥作用。另外，可用上述方法检测非免疫球蛋白(即化学)制剂，以确定它们是否为介导聚集之ICAM-3/LFA-1的激动剂或拮抗剂。这种细胞聚集检测法一般是使用以PMA刺激的外周血T细胞完成的。因此，可根据外周血细胞与LFA-1的结合来检测ICAM-3介导的细胞聚集作用。
C.抗ICAM-3抗体本发明优选的免疫球蛋白拮抗剂是本文公开的抗ICAM-3抗体如CBR-1C3/1。可使用各种方法制得其他适用的抗ICAM-3抗体。
抗ICAM-3(或其功能衍生物)的抗体可以是多克隆或单克隆的。另外，可按本领域已知的方法或“TCT/US91/02942和PCT/US91/02946(在美国受理局的申请日为1991年4月22日)中公开的方法使本发明的抗体得有人抗体的特性。
可将ICAM-3或其肽片段引入适当动物体内制得抗ICAM-3抗体。被免疫动物将在对其反应过程中产生多克隆抗体。使用ICAM-3的肽片段可制得只与用于免疫动物之肽片段内所含的抗原决定基起反应的区域特异性抗体。
另外，可使用在淋巴细胞表面上自然表达的ICAM-3制得抗ICAM-3抗体。将这样的细胞引入适当动物体内(如通过腹腔内注射)，将会产生能与ICAM-3或CD-18分子家族的成员结合的抗体。必要时可收获这些动物的血清并用作能够与这些分子结合之多克隆抗体的来源。
再者，可按Selden，R.F.(欧洲专利申请公开号289，034)或SeldenR.F.等人(Science236∶714-718(1987))的方法产生抗ICAM-3抗体。具体地说，可用能够表达完整ICAM-3分子或其片段的载体转染适当动物的细胞。在动物的被转染细胞内产生ICAM-3将在动物体内引发免疫反应，进而由该动物产生抗ICAM-3抗体。
然而，较好是从按上述方法免疫的动物体内除去脾细胞，以产生能结合ICAM-3的单克隆抗体。
可用多种方法鉴定能分泌可与ICAM-3结合之抗体的杂交瘤细胞，以筛选按上述方法得到的杂交瘤。在一优选的筛选方法中，可根据它们抑制ICAM-3表达、ICAM-1和ICAM-2非表达细胞聚集的能力来鉴定这些分子。然后进一步筛选能够抑制这种聚集作用的抗体，以确定它们是否能通过与ICAM-3或CD-18分子家族的成员结合来抑制这种聚集作用。在筛选中可使用能将ICAM-3与CD-18分子家族区分开的任何方法。因此，例如可用免疫沉淀法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析被抗体结合的抗原。有可能根据抗体与表达LFA-1但不表ICAM-3(或相反)的细胞结合的能力，来区分与CD-18分子家族成员结合的抗体和与ICAM-3结合的抗体。可借助本领域普通技术人员常用的方法检测抗体与表达LFA-1但不表达ICAM-3的细胞相结合的能力。这些方法包括免疫检测法(特别是使用免疫荧光)、细胞凝集法、滤膜结合法及抗体沉淀法等。
在此优选方法中，根据其结合表达ICAM-3的细胞，但不结合不表达ICAM-3的细胞的能力来选择抗体。
除了上述ICAM-3的激动剂和拮抗剂外，可根据本发明使用如抗ICAM-3抗体的抗抗体、能结合ICAM-3的受体分子或其片段等其他制剂治疗炎症、HIV感染、哮喘等。
本发明有意义的抗同种基因型抗体应能够与ICAM-3竞争(或排斥)结合。例如，可诱导抗ICAM-3抗体的抗抗体，然后筛选具有结合天然ICAM-3之结合配体之能力的抗体，以得到这样的抗体。
因为CD-18家族的分子能够与ICAM-3结合，所以使用这种分子(如具有α和β亚基的杂二聚体，或只由α或β亚基组成的分子、或具有单一或两种亚基的分子片段)将与细胞竞争结合存在于细胞上的ICAM-3。
可用多种方法鉴定并滴定本发明的抗聚集作用抗体。例如，可以检测能有区别地结合表达ICAM-3的细胞(如T细胞)，而不能结合不表达ICAM-3的细胞的抗体。美国专利申请序号07/045，963、07/115，798、07/155，993、07/189，815或07/250，446中描述了适于检测细胞聚集的方法(所有这些专利申请均列为本文参考文献)。另外，可检测抗体与ICAM-3或ICAM-3的肽片段结合的能力。本领域普通技术人员会很容易地理解到，可以对上述检测法进行改进，或按不同顺序完成之，以提供多种可行的筛选方法，且其中每一方法均可以将能与ICAM-3结合的抗体同能与CD-18分子家族成员结合的抗体鉴别并区分开。
D.本发明制剂的制备可按多种方法制得本发明的制剂天然方法(如诱导动物、植物、真菌、细菌等产生ICAM-3的非免疫球蛋白拮抗剂，或诱导动物产生能与ICAM-3结合的多克隆抗体);合成方法(例如合成ICAM-3、ICAM-3的功能性衍生物或ICAM-3的蛋白质拮抗剂(免疫球蛋白或非免疫球蛋白));杂交瘤技术(如产生能与ICAM-3结合的单克隆抗体);或重组技术(如使用重组质粒或病毒载体在不同的宿主(如酵母、细菌、真菌、培养的哺乳动物细胞等)中产生本发明的制剂)。选用哪种方法将取决于是否方便及产率大小等因素。但不一定只使用上述的一种方法或技术来产生特定的抗炎制剂;为得到特定制剂可联合使用上述方法和技术。
Ⅶ、ICAM-3及其功能性衍生物、激动剂和拮抗剂的应用可使用本发明的制剂调节由ICAM-3介导的多种生物学活性。
A.抑制炎症本发明的一个方法是基于ICAM-3和其功能性衍生物与CD-18家族分子特别是LFA-1之受体相互作用的能力。借助ICAM-3与CD-18糖蛋白家族成员相互作用的能力，其可被用于控制(即阻止或减弱)炎症。
术语“炎症”是指特异性防御系统的反应，以及非特异性防御系统的反应。
本文所用的术语“特异性防御系统”是指对特异性抗原的存在起反应的免疫系统的成份。如果炎症是由特异性防御系统引起介导的，或者是与特异性防御系统相关联的，则该炎症被看作是特异性防御系统之反应的结果。因特异性防御系统的反应而产生的炎症包括对抗原例如风疹病毒的反应、自家免疫病、以及T细胞介导的迟发型超敏反应(如见于Mantaux试验“阳性”者)。特异性防御系统之炎性反应的其他例子包括慢性炎症性疾病及对实体移植组织和器官(如肾和骨贿移植)的排斥反应。
本文所说的“非特异性防御系”的反应是指由不能产生免疫记忆的白细胞介导的反应。这类细胞包括粒细胞和巨噬细胞。如本文中所述，如果炎症是由非特异性防御系统的反应引起或介导的，或者是与非特异性防御系统的反应相联系的，则该炎症即说成是非特异性防御系统反应的结果。至少部分是由于非特异性防御系统的反应引起的炎症的例子包括与下列病理条件有关的炎症成人呼吸窘迫综合症(ARDS)或败血症、创伤或出血后的多器官损伤综合症、心肌或其他组织的再灌注损伤、急性肾小球肾炎、反应性关节炎、带有急性炎性改变的皮肤病、急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎性疾病如中风、热损伤、血液透析、白细胞畸型、溃疡性结肠炎、节段性回肠炎、坏死性小肠结肠炎、粒细胞转输相关综合症及细胞活素诱导的毒性。
如上所述，ICAM-3分子与CD-18分子家族成员的结合在细胞粘附中起关键性作用。通过粘附过程，淋巴细胞能够连续地监视动物体内外来抗原的存在。虽然在正常情况下需要有这些过程，但它们也可引起实质性器官移植物排斥(如肾)、非实质性器官移植物排斥(如骨髓)、组织移植物排斥及许多自家免疫病。因此，进行实质性器官移植(特别是肾移植)、非实质性器官移植(特别是骨髓移植)、组织移植的病人或自家免疫病人特别期望找到能够减弱或抑制细胞粘附的办法。
抗CD-18分子家族成员的单克隆抗体可抑制白细胞的许多粘附依赖性功能，包括与内皮细胞的结合(Haskard，D.etal.，J.Immunol.137∶2901-2906(1986))、同型粘附(Rothlein，R.etal.，J.Exp.Med.163∶1132-1149(1986))、抗原和有丝分裂素诱导的淋巴细胞增殖(Davignon，D.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78∶4535-4539(1981))、抗体生成(Fisher，A.etal.，J.Immunol.136∶3198-3203(1986))、以及所有白细胞的效应物功能，如胞毒性T细胞(Krensky，A.M.etal.，J.Immunol.132∶2180-2182(1984))、巨噬细胞(Strassman，G.etal.，J.Immunol.136∶4328-4333(1986))和所有参予抗体依赖性细胞胞毒性反应之细胞(Kohl，S.etal.，J.Immunol.133∶2972-2978(1984))的溶解活性。在所有上述功能中，抗体可抑制白细胞对适当细胞基质粘附的能力，后者又反过来抑制与上述结合相关联的生物学功能。可根据它们参予ICAM-3/LFA-1相互作用的程度，用抗ICAM-3抗体来抑制这些功能。
因此，可使用能够与ICAM-3结合的单克隆抗体作为哺乳动物的抗炎制剂。这类制剂与普通抗炎剂的明显不同在于它们能选择性地抑制粘附作用、没有常规药剂所常见的其他付作用(如肾中毒)。
因为ICAM-3(特别是可溶形式的ICAM-3)能够以抗CD-18分子家族成员之抗体的同样方式起作用，所以也可用以抑制炎症。另外，还可使用ICAM-3的功能性衍生物和拮抗剂抑制炎症。
1.迟发型超敏反应的抑制剂ICAM-3部分地介导为形成炎症反应如迟发性超敏反应所必需的粘附过程。因此，能够与ICAM-3结合的抗体在减弱或消除这些反应中具有治疗价值。
此外，因为ICAM-3是ICAM-1/LFA-1相互作用的拮抗剂，所以可使用ICAM-3(特别是其可溶形式)或其功能性衍生物抑制迟发性超敏反应。
可按两种方式开发这些潜在的治疗应用。第一，可给实验证实有迟发性超敏反应的病人使用含有抗ICAM-3单克隆抗体或可溶性ICAM-3衍生物的组合物。例如，可给接触过毒常青藤、槲叶毒葛等抗原的病人使用这种组合物。在另一实施方案中，可给病人合用能够结合ICAM-3的单克隆抗体及抗原物质，以防止继发性炎性反应。因此，在抗ICAM-3抗体中附加抗原，可以使病人暂时耐受将再次接触的抗原。
2.治疗慢性炎性疾病因为缺乏LFA-1的LAD病人不能产生炎性反应，所以可以相信LFA-1之天然配体的拮抗作用也将抑制炎性反应。抗ICAM-3抗体抑制炎症的能力为它们在治疗慢性炎症性疾病及红斑狼疮、自家免疫性甲状腺炎、实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)、多发性硬化症、某些类型的糖尿病、雷诺氏综合症、类风湿性关节炎等自家免疫病中的治疗应用提供了基础。也可使用这些抗体治疗牛皮癣。
一般情况下，本发明的抗ICAM-3抗体可以单独给药，也可与抗ICAM-1和/或抗ICAM-2抗体联合使用，用于治疗那些目前可通过类固醇疗法治疗的疾病。
根据本发明，可给需要治疗的对象提供抑制炎症足够量的抗炎剂，用以抑制这种炎性及免疫反应(即阻止或减弱之)。适用的抗炎剂包括能与ICAM-3结合的抗体、所说抗体的能与ICAM-3结合的片段、基本上纯的ICAM-3、ICAM-3的功能性衍生物、ICAM-3的非免疫球蛋白拮抗剂或LFA-1以外之ICAM-3的非免疫球蛋白拮抗剂。特别优选的是由ICAM-3的可溶性功能衍生物组成的抗炎剂。这样的抗炎治疗可包括给病人使用附加有选自下列制剂的组合物能与LFA-1结合的抗体、LFA-1的非免疫球蛋白拮抗剂、基本上纯的ICAM-1和/或ICAM-2或其衍生物，或抗ICAM-1和/或抗ICAM-2抗体或其片段。
本发明进一步包括上述抑制特异性防御系统之炎性反应的方法，其中包括给病人另外提供一种免疫拮抗剂。这种免疫拮抗剂的用量最好比其正常用量小些(即使用“亚最适”剂量)。使用亚最适剂量是因为它可能与本发明的制剂间有协同作用。适用的免疫拮抗剂的例子包括但不仅局限于地塞米松、硫唑嘌呤、ICAM-1、ICAM-2或环孢菌素A。
3.治疗非特异性炎症许多炎性反应是由于“非特异性防御系统”的反应导致的，并且是由不能产生免疫记忆的淋巴细胞介导的。这类细胞包括粒细胞和巨噬细胞。如本文所述，如果炎症是由非特异性防御系统的反应引起或介导的，或者是与非特异性防御系统的反应相关联的，即可以说该炎症是非特异性防御系统反应的结果。至少部分地由非特异性防御系统之反应所致的炎症的例子包括与下列病理条件样关的炎症成人呼吸窘迫综合症(ARDS)或继发于败血症、创伤、或出血的多器官损伤综合症、心肌或其他组织的再灌注损伤、急性肾小球肾炎、反应性关节炎、伴有急性炎症的皮肤病、急性化脓性脑膜炎或中枢神经系统的其他炎性疾病如中风、热损伤、血液透析、白细胞畸型、溃疡性结肠炎、节段性回肠炎、坏死性小肠结肠炎、粒细胞转输综合症及细胞活素诱导的毒性。
本发明的抗炎剂是能够拮抗粒细胞上CD-18复合物与内皮细胞相互作用的化合物。这类拮抗剂包括ICAM-3、ICAM-3的功能性衍生物、除ICAM-1、ICAM-2或CD-18分子家族成员以外的ICAM-3的非免疫球蛋白拮抗剂。
B.器官和组织排斥的抑制剂因为ICAM-3特别是其可溶形式能够以与抗CD-18分子家族成员之抗体相同的方式起作用，所以可用以抑制由任何细胞粘附依赖性功能引起的器官或组织排斥。此外，也可以使用抗ICAM-3抗体、ICAM-3之功能衍生物及ICAM-3的拮抗剂抑制这种排斥反应。
可使用ICAM-3和抗ICAM-3抗体防止哺乳动物中实质性器官或组织(如肾)、或非实质性器官或组织(如骨髓)的排斥反应，或者改善自家免疫反应。重要的是使用能够识别ICAM-3的单克隆抗体，借以能够在HLA失配的个体间进行器官移植。
C.为治疗或诊断目的而使用的便于引入抗原性材料的辅助药物对某些治疗或诊断剂如牛胰岛素、干扰素、组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂或小鼠单克隆抗体的免疫反应可在很大程度上损害这些制剂的治疗或诊断价值，并且在某些情况下可引起疾病如血清病。这种情况可使用本发明的抗体进行治疗。在本发明的这一实施方案中，可将抗ICAM-3抗体与治疗或诊断剂联合使用。加入抗体可防止接受者对上述药剂的识别，从而防止接受者产生抗这些药剂的免疫反应。消除上述免疫反应后即可使病人能够接受外加的治疗或诊断剂。
用于治疗疾病时，ICAM-3(特别是其可溶形式)或其功能衍生物可以单独使用或与ICAM-1或ICAM-2合用，或与能够与LFA-1结合的抗体合用。因此，可使用这种可溶形式的分子抑制器官或移植物排斥反应。为了降低治疗或诊断剂的免疫原性，可以以与抗ICAM-3抗体相同的方式使用ICAM-3或其功能衍生物。
D.肿瘤转移拮抗剂还可以使用本发明的制剂抑制需要CD-18家族的成员参予的造血系统肿瘤细胞的转移。根据本发明的这一实施方案，可给需要这种治疗的病人提供足可抑制所说的转移之量的制剂(如能与ICAM-3结合的抗体、所说抗体的毒素衍生产物、所说抗体的能结合ICAM-3的片段、所说片段的毒素衍生产物、基本上纯的ICAM-3、ICAM-3的功能衍生物、或除ICAM-1或ICAM-2以外的ICAM-3的非免疫球蛋白拮抗剂)。
在本发明的另一实例中，提供了抑制表达ICAM-3之肿瘤细胞生长的方法。具体地说，该方法包括给需要这种治疗的病人提供足够量的治疗剂。适用的治疗剂包括能与ICAM-3结合的抗体、所说抗体的毒素衍生物、所说抗体的能与ICAM-3结合的片段、所说片段的毒素衍生物、CD-18分子家族成员的毒素衍生产物、或CD-18分子家族成员之功能衍生物的毒素衍生产物。
在本发明的另一实例中提供了抑制表达LFA-1之肿瘤细胞生长的方法。具体地说，该方法包括给需要这种治疗的病人提供足可抑制所说的生长量的毒素。适用的毒素包括ICAM-3的毒素衍生物，或者ICAM-3的毒素衍化的功能性衍生物。
E.抑制HIV感染和防止HIV感染的细胞扩散在本发明的另一实施方案中，提供一种抑制HIV感染的方法，该方法包括给受HIV感染者使用有效量的HIV感染抑制剂。虽然本发明具体地涉及到抑制HIV-1感染的方法，但应指出的是该方法也适用于任何可用本发明制剂抑制的以某种方式感染细胞的HIV变异体(如HIV-2)。就本发明的目的来说，这些变异体均为HIV-1的等同物。
本发明的一个方面是基于认识到由于HIV感染而刺激了LFA-1的表达，以及在某些情况下刺激了LFA-1结合配体的表达，从而促进了细胞-细胞粘附反应，得以增加被感染细胞与未感染细胞的接触时间，有利于病毒从被感染细胞向未感染细胞转移。因此本发明能调节LFA-1/配体相互作用的制剂能够抑制由HIV，特别是由HIV-1引起的感染。通过抑制LFA-1/配体相互作用的分子来抑制HIV感染的一种方法是破坏由HIV感染之细胞表达的LFA-1配体结合健康T细胞上之CD11/CD18受体的能力。另外，抑制LFA-1/配体相互作用的分子可以损害由HIV感染之细胞表达的CD11/CD18受体与健康T细胞之LFA-1相结合的能力。为了损坏细胞与CD11a/CD18受体或LFA-1结合配体相结合的能力，有可能使用ICAM-3、ICAM-3的片段、ICAM-3的功能性衍生物或抗ICAM-3抗体。
可按足以抑制HIV感染的量将本发明的制剂提供给接受者。在常规给药情况下，如果所给剂量足以减弱或阻止HIV感染，即可以说给药量足以“抑制”HIV感染。这些制剂被提供给接触过HIV或受到HIV感染的病人。
在处理HIV感染中，本发明的制剂可用于“预防”或“治疗”目的。当用于预防时，可在出现任何病毒感染症状之前(如在感染前，感染时或感染后不久但在出现任何感染症状前)提供该制剂。为预防给药是用于阻止或减弱继后的HIV感染。当用于治疗是，可在检测出受病毒感染的细胞时(或之后不长时间内)提供该制剂。治疗给药旨在减轻HIV的进一步感染。
因此，本发明的制剂可用在病毒感染开始前(用以抑制可能出现的HIV感染)或在真的检出被病毒感染的细胞之后(用以抑制进一步的感染)。
在另一实施方案中，提供了改进的艾滋病治疗方法，以加强抑制HIV特别是HIV-1感染的方法，该方法包括同时给予
(Ⅰ)ICAM-3、可溶性ICAM-3衍生物、CD11(CD11a、CD11b或CD11c)、可溶性CD11衍生物、CD18、可溶性CD18衍生物、或CD11/CD18杂二聚体，或CD11/CD18杂二聚体的可溶性衍生物，和/或(Ⅱ)能够与ICAM-3结合的抗体，及(Ⅲ)与细胞或颗粒相联的CD4或CD4的可溶性衍生物和/或(Ⅳ)能与CD4结合的分子，较好是抗体或抗体片段。
在本发明的另一实施例中，提供了抑制HIV感染的细胞迁移的方法，该方法包括给受HIV感染的个体提供有效量的抗细胞迁移剂。
本发明的抗迁移剂包括能损害HIV感染的T细胞与LFA-1配体结合之能力的ICAM-3、ICAM-3的片段、ICAM-3的功能衍生物、或抗ICAM-3抗体。可结合ICAM-3的抗体将通过损害HIV感染之T细胞表达的ICAM-3与表达CD11/CD18受体之细胞结合的能力来抑制细胞迁移。为了破坏细胞与CD11a/CD18受体结合的能力，有可能使用能结合ICAM-3的抗体。
可以按足以抑制HIV(或其他病毒)感染之T细胞迁移的量给病人提供本发明的制剂。如果按常规途径给药，用药剂量足可减弱或阻止这种迁移，即认为这个量足以“抑制”T细胞的迁移。
可以为“预防”或“治疗”目的使用这些化合物。当用于预防时，可在出现任何感染症状之前(例如在感染前、感染时，或感染后不久但出现任何感染症状之前)提供该制剂。预防给药是用于阻止或减弱继后被病毒感染之细胞的迁移。当用于治疗时，可在检测到病毒感染的T细胞时(或之后不长时间内)提供该制剂。治疗给药是用于减弱这些T细胞进一步迁移的能力。
因此，本发明的制剂可用在病毒感染开始之前(用以抑制可能出现的被感染之T细胞的迁移)或真正检查到这种病毒感染的细胞后。
F.治疗哮喘在本发明的另一实施例中，可使用能调节LFA-1/ICAM-3相互作用的制剂治疗哮喘，该方法包括给需要这种治疗的个体提供有效量的抗哮喘剂。
本发明的抗哮喘剂包括能损害细胞结合LFA-1之能力的ICAM-3、ICAM-3的片段、ICAM-3的功能衍生物、或抗ICAM-3抗体。结合ICAM-3的抗体通过破坏这些细胞上表达的ICAM-3与表达CD11/CD18受体之细胞结合的能力来抑制嗜伊红细胞的迁移。
本发明的抗哮喘剂的用量应足以减小或减缓哮喘症状的严重性及持续时间。
本发明的制剂可以单独使用，也可与一种或多种其他抗哮喘剂(如甲基黄嘌呤，茶碱)、β-肾上腺素能激动剂(如儿茶酚胺、雷锁辛、水杨醇、麻黄碱)、糖皮质激素(如氢化可的松)、色酮(如色甘酸钠)及抗胆碱能药物合用，以减少本发明制剂的用量。
本发明的制剂可用于“预防”或“治疗”目的。当用于预防时，可在哮喘症状出现前使用。该制剂预防给药的目的旨在防止或减轻继发的哮喘症状。当用于治疗时，须在哮喘症状出现时(或其后不久)用药。该制剂治疗使用旨在缓解任何实际出现的哮喘发作。因此，本发明的制剂可在出现哮喘发作前使用(用以缓解发作的严重程度或缩短发作时间)，或者在发作之后使用。
G.诊断和预后应用可使用能够与ICAM-3结合的单克隆抗体作为显现病人体内ICAM-3表达及炎症部位的工具。在这一应用中，可通过放射性核素、亲合标记物(如生物素、抗生物素蛋白等)、荧光素标记物或顺磁原子对抗ICAM-3单克隆抗体进行可检测性标记。然后即可将标记的抗体用于诊断影象法中。Grossman，H.B.(Urol.Clin.NorthAmer.13∶465-474(1986))、Unger，E.C.等人(Invest.Radiol.20∶693-700(1985))和Khaw，B.A.等人(Science209∶295-297(1980))评述了抗体在诊断影象法中的临床应用。
也可通过使用与存在于表达ICAM-3之细胞中的ICAM-3mRNA序列或ICAM-3基因序列结合的杂交探针，如mRNA、cRNA、基因组DNA或合成的寡核苷酸探针来检测ICAM-3的表达。Maniatis，T等人(MolecularCloning，aLaboratoryManual，ColdSpringHarbor，NY(1982))和Haymes，B.D等人(NucleicAcidHybridization，aPracticalApproach，IRLPress，Washington，DC(1985))描述了完成该杂交试验的技术。
使用标记的抗体或核酸探针检测TCAM-3的表达可用来诊断肿瘤。在一诊断实例中，从被检对象体内采集组织或血液样品，在其带有可检测标记的抗体存在下进行保温。在一优选方案中，通过使用磁性成象法、荧光图象摄影法等，以无损伤手段完成这一技术。可利用这一诊断试验监测器官(如肾)移植者有无组织排斥的早期征象。也有可能用这一检测方法确定病人是否易患风湿性关节炎或其他慢性炎性疾病。
例如，通过放射活性标记抗ICAM-3抗体或抗体片段，有可能以放射免疫法检测抗原。有关放射免疫法(RIA)的描述可参见LaboratoryTechniquesandBiochemistryinMolecularBiology，Work，T.S.etal.，NorthHollandPublishingCompany，NY(1978)，具体地可见Chard，T.撰写的题目为“AnIntroductiontoRadioimmuneAssayandRelatedTechniques”一章(该文列为本说明书参考文献)。另外，也可用荧光化合物、酶、或其他适当标记物按已知方法标记抗体。
除了确定炎症部位外，还可使用能与ICAM-3结合的抗体并利用适于作体液分析的常用培养基，检测生物体液中是否存在循环的ICAM-3。体液中存在循环ICAM-3表明有炎症反应或其他ICAM-3介导的生物学功能。另外，羊水中存在ICAM-3与怀孕期间的并发症有关。可对任何生物体液进行这一检测，但所说生物体液最好是血液、血清、血浆、滑液、羊水、脊髓液或尿液。
Ⅷ.本发明组合物的给药方法给病人使用完整的ICAM-3分子或其任何有治疗活性的肽即可获得ICAM-3的治疗效果。其中特别有用的是可溶形式的ICAM-3的治疗活性肽片段。
可用合成方法、DNA重组技术、蛋白水解法或合用上述方法制得ICAM-3及其功能衍生物。可以使用带有附加氨基酸残基(用以提高与载体偶联的能力或增强ICAM-3的活性)的ICAM-3功能衍生物，以提高ICAM-3的治疗效果。本发明还包括缺少某些氨基酸残基、或含有改变之氨基酸残基的ICAM-3的功能衍生物，只要这些衍生物具有或能影响ICAM-3的生物学或药理学活性即可。
如果含有本发明的抗体及本文讨论之ICAM-3分子的制剂中基本上没有天然存在的材料，即可以说这些抗体和ICAM-3分子是“基本上没有天然污染物”的。
本发明扩展到能够与ICAM-3结合的抗体(多克隆或单克隆抗体)，及其生物学活性片段。这些抗体可由动物、组织培养物或重组DNA方法产生。
ICAM-3或由之衍生的分子可以单独使用，也可与ICAM-1和/或ICAM-2合用。抗ICAM-3抗体或能够与ICAM-3或由之衍生的分子结合的其他分子也可以单独使用或与抗ICAM-1抗体和/或抗ICAM-2抗体合用。当给病人使用抗体或能与ICAM-3结合的抗体片段时，或当给病人使用ICAM-3(或其片段、变体或衍生物)时，给药剂量可依据病人的年令、体重、身高、性别、一般医疗状况、既往病史等因素而异。一般情况下，抗体的给药剂量为1pg/Kg-10mg/Kg(病人体重)、但实际用药也可低于或高于这一剂量范围。当使用ICAM-3分子或其功能衍生物时，给药剂量较好在1pg-10mg/Kg(病人体重)范围内，但也可低于或高于这一剂量范围。如以下所讨论的，如果将抗ICAM-3抗体与抗LFA-1抗体、抗ICAM-1抗体和/或抗ICAM-2抗体联合使用，可减少治疗上的有效剂量。如正文所用的概念，当两种化合物的给药时间非常接近以致可同时在病人血清中检出这两种化合物时，即可以说一种化合物与第二种化合物联合给药。
能够与ICAM-3结合的抗体及ICAM-3本身的给药途径可以是静脉内、肌肉内、皮下、肠内、局部或胃肠道外途径。如果抗体或ICAM-3是经注射给药的，则可以是连续注射，或单次或多次注射。
本发明制剂的用药量应足可达到“生理上有效的”剂量。如果该制剂的给药剂量和途径等足以能减弱或阻止ICAM-3的相关生物学效应，则该用量即可说成是生理上有效的。例如，当给病人使用本发明的制剂抑制炎症时，如给药剂量足可“抑制”炎症，则该制剂就是生理上有效的。
另外，抗ICAM-3抗体或其片段可以单独使用或与一种或多种其他免疫抑制剂合用(尤其是当给器官或组织移植受体使用时)。这些化合物可用于“预防”或“治疗”目的。当用于预防目的时，可在炎症反应或症状出现前使用这些免疫抑制化合物(例如，可在器官或组织移植前、移植时或移植后不久但出现任何器官排斥症状前用药)。为预防目的使用这些化合物可阻止或减轻任何继后的炎性反应(如对被移植器官或组织的排斥反应等)。当用于治疗目的时，可在真正出现炎症症状(如器官或组织排斥反应)时(或其后不久)用药。为治疗目的而使用这些化合物的目的在于减轻实际出现的任何炎症(如对被移植之实质性器官或组织(如肾脏)或非实质性器官(或骨髓)的排斥反应)。
因此，本发明的抗炎剂可在炎症发生前使用(用于抑制可能出现的炎症)或在炎症发生后使用。
如果某组合物能够被用药者耐受，则该组合物即是“药理上可接受的”。如果其给药量在生理上是足够的，则可以说该制剂给药量为“治疗有效量”。如果某制剂的存在可在用药者体内检测到生理学改变，则该制剂即是有药理学意义的。
可按照制药领域已知的方法将本发明的抗体和ICAM-3分子，或其功能衍生物与药理学可接受的载体相结合，制成医药上有用的组合物。适用的载体及其配方(包括其他人蛋白质如人血清白蛋白等的配制品)已在Remington′sPharmaceuticalSciences(16thed.，Osol，A.，Ed.，Mack，EastonPA(1980))中作了描述。为了制成适于临床给药的医药上可接受的组合物，这些组合物可含有有效量的本发明制剂连同适当量的载体。另外，可通过嵌合或CDR接枝使本发明的抗体人源化，从而变得更易于被人体接受。英国专利申请9009548.0、9009549.8号和PCT申请PCT/US91/02942号和PCT/US91/02946号(在美国受理局的申请日为1991年4月27日)中描述了制备这种嵌合抗体特别抗ICAM-1抗体的方法。
另外可使用药学方法控制有效作用期。可通过使用复合或吸附本发明制剂的聚合物来控制这些制剂的释放。可通过选择适当的大分子基质并改变所加大分子的浓度将被控制的运输速度和周期调整到一个特定的程度。通过控制制剂释放来控制作用时间的另一种可能的方法是将本发明的制剂掺入到聚合物材料如聚酯、多聚氨基酸、含水凝胶、聚乳酸或乙烯乙酸乙烯酯共聚物的颗粒中。另外，还可以使用凝聚技术或介面聚合、利用明胶或聚(异丙烯酸甲酯)将这些材料包埋在微胶囊中、或者包埋在胶体药物运输系统例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、微小颗粒及微小胶囊或大分子乳剂中。
本发明还包括含下列组分的医药组合物(1)抗炎剂(如能够与ICAM-3结合的抗体、能与ICAM-3结合的所说抗体的片段、ICAM-3、ICAM-3的功能衍生物、或除ICAM-1和ICAM-2以外的ICAM-3的非免疫球蛋白拮抗剂)，以及(b)至少一种免疫拮抗剂。适用的免疫拮抗剂的例子包括地塞米松、硫唑嘌呤及环孢菌素A。
在对本发明所作一般性描述的基础上，现结合下列实施例对本发明的制剂和其制取方法作进一步说明，这些实施例旨在进一步解释而不是限制本发明。
实施例1ICAM-3，一种新的LFA-1的粘附配体的特征按前述方法使细胞系和淋巴细胞粘附到LFA-1包被的平皿上(Dustin et al.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.54∶753-765(1989))。将从JY溶胞产物中纯化的LFA-1以1100位点/μm2的吸附容量吸附到96小孔微量滴定板(Linbro-titertek)上。用1%BSA封闭非特异性结合位点并用PBS/5%FBS/2mM MgCl2/0.5%HSA(检测培养基)洗各孔。向微量滴定孔内加1/200稀释的TS1/22(抗LFA-1α)并于室温下保温30分钟，达到对LFA-1的特异性抑制。经塑料吸附和尼龙棉过滤从全血中分离静止T细胞(为91%CD2+)，同时在10μg/ml植物凝血素(PHA)存在下培养细胞以产生PHA母细胞。用荧光色素BCECF(Molecular Probes Inc.)标记细胞，洗细胞后再悬浮于检测培养基中。在4℃将细胞与1/200稀释的腹水保温45分钟，以对细胞进行MAb预处理，然后在每孔内加入105个细胞。37℃保温1小时，使细胞粘附到固相LFA-1上，用23号针头吸除未粘附细胞(6次)，同时以30xg离心5分钟以沉淀淋巴细胞并于37℃保温30分钟。在每次洗涤之间用100ψ弹击培养基8次，从平板中除去淋巴细胞。如此弹击可更有效地除去因为体积小而难以除去的未结合之T淋巴细胞。使用荧光浓度分析仪(Baxte)直接定量分析96孔平板中的荧光量。所用的所有MAb均为饱和浓度(1/200倍稀释的腹水)，并包含TS1/22(抗CD11a，IgCl)(Sanchen-Madridetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.75∶7489-7493(1982))、RR1/1(抗ICAM-1，IgGl)(Rothleinetal.，J.Immunol.137∶1270-1274(1986))、CBR-1C2/2(抗ICAM-2，IgG2a)(deFougerollesetal.，J.Exp.Med.Submitted(1991)(待出版))、以及CBR-IC3/1(抗ICAM-3，IgGl)。使小鼠骨髓瘤细胞P3×63Ag8.653与得自SKW3免疫之Balb/c小鼠(Gefferetal.，Som.CellGen.3∶231-236(1977))的脾细胞融合，并根据其抑制SKW3与纯化之LFA-1结合的能力筛选出600个骨髓瘤，从而制得CBR-IC3-1。CRB-IC3/1表现不与纯化的LFA-1反应，也不与用ICAM-1、ICAM-2或LFA-1cDNA转染的COS细胞反应(数据未示出)。显示了四个有代表性实验之一的结果，其中误差条形图表示一个标准差。
实施例Ⅱ细胞ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3表达的流动细胞计数分析所用细胞均如以前Hibbs等人(J.Clin.Invest.85∶674-681(1990))所述。按已述的葡聚糖沉淀和Ficoll-Hypaque(1.077)离心法制得外周血单核细胞(PBMC)。由细胞沉淀团中回收嗜中性白细胞并经低渗溶解破坏污染的红细胞。利用向前和垂直光线散射进行细胞计数分析，以将单核细胞同T细胞分开，并用单核细胞和T细胞特异性MAb证实之。用塑料粘附法从PBMC中富集淋巴细胞并在10μg/ml植物凝血素(PHA)存在下培养细胞。用EPICSV流动细胞计数器分析样品，并使用EPICSImmune-Brite荧光珠(Coulter)对荧光进行定量以校准细胞计数器。静止细胞上ICAM-3的表达比CD3或LFA-1大2-3倍，而单核细胞表达的ICAM-3比LFA-1多3-4倍。嗜中性细胞上ICAM-3的表达水平与Mac-1(CD11b/CD18)相等。用磷脂酶C处理细胞表明不存在与PI结合的ICAM-3。
实施例ⅢICAM-3的免疫沉淀按已述方法(Kishimoto et al.，J.Biol.Chem.264∶3588-3595(1989))用碘(125I)对细胞进行表面标记。用Triton X-100(1%)溶解细胞。加牛IgG偶联的Sepharose预澄清溶胞产物，然后与适当MAb结合的Sepharose保温2小时。洗样品小珠并在含有50mM Tris、1%SDS和1% 2-巯基乙醇的样品缓冲液中煮沸。在不含2-巯基乙醇的缓冲液中煮沸非还原的样品，并用20mM硫乙酰胺处理。按已述方法(Laemmli，U.K.，Nature 227∶680-685(1970))在7%垂直板聚丙烯酰胺凝胶上分析样品，并以放射自显影方法显现蛋白质。按以前所述方法(Tarentino et al.，Biochemistry 24∶4665-4671(1985))，使用一定浓度的N-聚糖酶(Genzyme)处理样品(10单位/ml，37℃，18小时)，所用浓度应能从肽主链上最适切掉所有N连接的寡糖。I类MHC不含N连接的碳水化合物，而ICAM-2(分子量600，000，6个N连接位点，主链分子量28，383)则是高度糖基化的。
＊如材料和方法中所述的通过免疫荧光流动血细胞计数确定的膜表达。所得到的值是至少两次实验的结果。用荧光珠校准血细胞计数器，以使1单位大约为103荧光素当量(Coulte Diagnositics，Hialeah，FL)。
＊＊混杂细胞系包括人脐静脉内皮细胞，huvec;人乳腺癌细胞，Hep.G2;人上皮癌细胞系，HeLa;人横纹肌肉瘤，RD3/5;人纤维肉瘤，和FS1，2，3;人恶性胶质瘤。
权利要求
1.基本不含天然污染物的ICAM-3或其功能衍生物。
2.能够编码ICAM-3或其功能衍生物的重组DNA分子。
3.根据权利要求2的重组DNA分子，其中所说的分子还能在细胞中表达ICAM-3或其功能衍生物。
4.能够与选自ICAM-3和其功能衍生物的分子结合的抗体或抗体片段。
5.根据权利要求4的抗体，其中所说抗体与所说分子的结合损害所说分子与受体分子结合的能力。
6.根据权利要求5的抗体，其中所说的受体是LFA-1。
7.根据权利要求5的抗体，其中所说的受体是Mac-1。
8.根据权利要求5的抗体，其中所说的受体是p150，95。
9.能够产生权利要求4之单克隆抗体的杂交瘤细胞。
10.产生所需杂交瘤细胞的方法，所说的细胞产生能与ICAM-3或其功能片段结合的抗体，该方法包括下列步骤(a)用纯化的ICAM-3免疫动物，(b)使该动物的脾细胞与骨髓瘤细胞系融合，(c)使融合的脾和骨髓瘤细胞形成分泌抗体的杂交瘤细胞，并(d)根据所需杂交瘤细胞产生能与ICAM-3结合之抗体的能力筛选该杂交瘤细胞。
11.调节ICAM-3介导的细胞生物学功能的方法，其中所说的方法包括给需要这种治疗的病人提供有效量的ICAM-3调节剂，所说的ICAM-3调节剂选自能与ICAM-3结合的抗体、所说抗体的能与ICAM-3结合的片段、ICAM-3及其功能衍生物、以及除ICAM-1、ICAM-2或CD-18分子家族成员以外的ICAM-3的非免疫球蛋白拮抗剂。
12.根据权利要求11的方法，其中所说的ICAM-3介导的生物学功能是炎性反应，且所说的ICAM-3调节剂是以足可抑制所说之炎症的量提供给所说的病人的。
13.根据权利要求12的方法，其中所说的炎性反应是在对选自下列一组状态反应中出现的特异性炎症迟发性超敏反应、牛皮癣的症状、自家免疫病、器官移植或组织移植物排斥作用。
14.根据权利要求13的方法，其中所说的器官移植是实质性器官移植。
15.根据权利要求14的方法，其中所说的器官移植是肾移植。
16.根据权利要求13的方法，其中所说的器官移植是非实质性器官移植。
17.根据权利要求16的方法，其中所说的器官移植是骨髓移植。
18.根据权利要求13的方法，其中所说的自家免疫病选自雷诺氏综合症、自家免疫性甲状腺炎、EAE、多发性硬化症、类风湿性关节炎及红斑狼疮。
19.根据权利要求13的方法，其中所说的炎症反应是在对选自下面一组的病理状态反应中形成的特异性炎症成人呼吸窘迫综合症(ARDS)，继发于败血症、创伤或出血的多器官损伤综合症，心肌或其他组织的再灌注损伤，急性肾小球肾炎，反应性关节炎，伴有急性炎症的皮肤病，急性化脓性关节炎或其他中枢神经系统炎性疾病如中风，热损伤，血液渗析，白细胞异型症，溃疡性结肠炎，克罗恩氏病，坏死性小肠结肠炎，粒细胞转输相关综合症及细胞活素诱发的毒性。
20.根据权利要求11的方法，其中所说的TCAM-3介导的生物学功能是造血肿瘤细胞的转移，所说的细胞迁移时需要CD-18家族的功能性成员，且所说的制剂对是以足可抑制所说之转移的量提供给所说的病人的。
21.根据权利要求11的方法，其中所说的ICAM-3介导的生物学功能是病毒感染的白细胞的血管外迁移，且所说的ICAM-3调节剂是以足可抑制所说的白细胞迁移的量提供给具有这样的白细胞的病人的。
22.根据权利要求11的方法，其中所说的病毒感染的细胞是被HIV感染的。
23.根据权利要求11的方法，其中所说的ICAM-3生物学功能是与哮喘反应相关的细胞的迁移，且所说的ICAM-3调节剂是以足可抑制与哮喘相关之细胞迁移的量提供给所说的病人的。
24.抑制白细胞遭受HIV感染的方法，其中所说的方法包括给接触过或受到HIV感受的病人使用有效量的HIV-1感染抑制剂，所说制剂选自能够与ICAM-3结合的抗体、所说抗体的毒素衍生产物、所说抗体的能够与ICAM-3结合的片段、所说片段的毒素衍生产物、ICAM-3的功能衍生物、;除ICAM-1、ICAM-2或CD-18分子家族之成员以外的ICAM-3的非免疫球蛋白拮抗剂，以及CD-18分子家族之成员的毒素衍生的功能性衍生物。
25.根据权利要求24的方法，其中所说的HIV是HIV-1。
26.抑制表达ICAM-3之肿瘤细胞生长的方法，该方法包括给需要这种治疗的病人提供足可抑制所说的生长量的毒素，所说的毒素选自能够与ICAM-3结合的抗体，所说抗体的毒素衍生产物，所说抗体的能与ICAM-3结合的片段，所说片段的毒素衍生产物，CD-18分子家族成员的毒素衍生产物，以及CD-18分子家族之成员的毒素衍生的功能性衍生物。
27.抑制表达LFA-1之肿瘤细胞生长的方法，所说的方法包括给需要这种治疗的病人提供足以抑制所说的生长量的毒素，所说的毒素选自毒素衍生的ICAM-3以及毒素衍生的ICAM-3的功能性衍生物。
28.根据权利要求11-27中任一项的方法，其中所说的方法还包括使用选自下面一组中的一种或多种制剂能够与LFA-1结合的抗体，所说抗体的能够与LFA-1结合的片段，LFA-1的非免疫球蛋白拮抗剂，能够与ICAM-1结合的抗体，所说抗体的能够与ICAM-1结合的片段，能够与ICAM-2结合的抗体，所说抗体的能够与ICAM-2结合的片段。
29.根据权利要求11-27中任一项的方法，其中所说的ICAM-3调节剂经肠道内、胃肠道外、局部、吸入或鼻内途径给药。
30.根据权利要求11-27中任一项的方法，其中所说的ICAM-3调节剂用于预防目的。
31.根据权利要求11-27中任一项的方法，其中所说的ICAM-3调节剂用于治疗目的。
32.根据权利要求29的方法，其中所说的胃肠道外给药途径是肌肉内、静脉内或皮下给药。
33.含有选自下列一组之制剂的医药组合物能够与ICAM-3结合的抗体，所说抗体的能够与ICAM-3结合的片段，ICAM-3，ICAM-3的功能衍生物，以及除ICAM-1、ICAM-2或CD-18家族之成员以外的ICAM-3的非免疫球蛋白拮抗剂。
34.根据权利要求33的医药组合物，其另外还含有免疫抑制剂。
35.含有与医药上可接受的载体结合的根据权利要求11、24、26、27或28中任一项之ICAM-3调节剂的医药组合物。
36.根据权利要求35的医药组合物，其中结合有至少一种其他的免疫抑制剂。
37.含有根据权利要求4的抗体分子或其片段的，并结合有医药上可接受的稀释剂、赋形剂或载体的治疗组合物。
38.含有呈可检测之标记形式的根据权利要求4的抗体分子或其片段的诊断组合物。
39.检测是否存在表达ICAM-3之细胞的方法，该方法包括(a)在一种核酸分子存在下保温所说的细胞或所说细胞的提取物，所说的核酸分子能够与ICAM-3mRNA杂交;以及(b)确定所说的核酸分子是否已与存在于所说细胞或所说细胞提取物中的互补核酸分子杂交。
40.诊断哺乳动物体内表达ICAM-3之肿瘤细胞的方法，该方法包括(a)给所说的诊断对象使用含有可检测之已标记抗体或其能够与ICAM-3结合之片段的组合物，并(b)检测与所说的ICAM-3结合的所说抗体。
41.诊断哺乳动物体内之炎症的方法，该方法包括(a)将所说诊断对象的组织样品与含有能与表达ICAM-3之细胞结合之抗体或其片段的组合物一起保温，并(b)检测与所说的细胞结合的所说的抗体。
42.诊断哺乳动物体液样品中是否存在ICAM-3的方法，该方法包括(a)将所说诊断对象的生物体液样品与含有能与ICAM-3结合之抗体或其片段的组合物一起保温，并(b)检测与所说体液结合的抗体。
43.根据权利要求42的方法，其中所说的体液选自血液、血清、血浆、滑液、羊水、脑脊液或尿液。
全文摘要
本发明涉及细胞间粘附分子(ICAM-3)，该分子参予淋巴细胞识别并迁移到炎症部位，以及在炎症期间附着到细胞基质上的过程。本发明涉及这样一些分子，鉴定这些分子的筛选方法及能够与这些分子结合的抗体。本发明还涉及粘附分子以及能够与之结合的抗体的治疗和诊断应用。
文档编号C07K16/00GK1069522SQ9210512
公开日1993年3月3日 申请日期1992年6月11日 优先权日1991年6月11日
发明者A·R·德伏格罗利斯, T·A·斯普灵格 申请人:血液研究中心