专利名称：吡咯烷羰基氨基环状二硫化物的制作方法
技术领域：
本发明广义上涉及在炎性疾病治疗中用作有效治疗剂的吡咯烷基环状二硫化物类化合物。
血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)是免疫球蛋白(Ig)超基因家族的一员，其表达在活化的内皮上。整联蛋白VLA-4(α4β1)是VCAM-1的主要受体。VLA-4表达在多种细胞类型上，包括循环淋巴细胞、嗜曙红细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞。VCAM-1还结合第二整联蛋白LPAM-1(淋巴集结粘附分子)并且表达在B和T细胞上。整联蛋白LPAM-1也可以结合另一种称作粘膜定址细胞粘附分子(MadCAM)的细胞粘附分子。整联蛋白VLA-4和LPAM-1与细胞粘附分子VCAM-1或MadCAM的结合在正常情况下允许大分子和循环细胞从血液通过到达组织。然而，整联蛋白与细胞粘附分子的结合可能导致所不期望的炎症，其中上述种类的细胞会浸润组织并导致组织损伤。
因此，那些抑制整联蛋白与细胞粘附分子的结合的细胞粘附分子/整联蛋白拮抗剂能够预防不期望的炎症。例如，需要上述拮抗剂来预防炎性肠病引起的组织损伤、关节炎中T细胞迁出、嗜曙红细胞积聚和哮喘中支气管收缩，并且延长组织同种异体移植物的存活时间。
所以，本发明的目的在于提供下面通式I的化合物
其中R2和R3各自独立地是低级烷基，或与其所连的碳原子一起构成含有4-6个碳原子的脂族碳环；R5是氢、低级烷基、R-SO2-、R6-(CH2)m-CO-或R8-X-(CH2)y-CO-；R是低级烷基；R6和R8是氢或低级烷基；X为-O-或-NH-；m是1-7的整数，y是0-7的整数，和n是1-3的整数；同时a、b、c和d表示不对称碳原子；和及其可水解酯或醚。
R2和R3与其所连的碳原子一起构成含有4-7个碳原子的环烷基或环烯基，例如环戊烷、环戊烯、环丁烷、环丁烯、环己烷或环己烯。
下面是本发明的优选实施方式(i)式I的化合物，其中R2和R3与其所连的碳原子一起构成含有4-6个碳原子的脂族环烷环或其药学可接受的盐。
(ii)按照(i)的化合物，其中R2和R3与其所连的碳原子一起构成环戊烷环或其药学可接受的盐。
(iii)按照(ii)的化合物，具有下式结构 或其药学可接受的盐。
(iv)按照(iii)的化合物，其是(8R，13R)-13-[[[3-(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]羰基]氨基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸或其药学可接受的盐。
(v)按照(iii)的化合物，其中R5是R6-(CH2)mCO-或其药学可接受的盐。
(vi)按照(v)的化合物，其是(8R，13R)-13-[[[1-乙酰基-3-(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]羰基]氨基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸或其药学可接受的盐。
(vii)按照(v)的化合物，其是(8R，13R)-13-[[[1-(2，2-二甲基-1-氧代丙基)-3-(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]-羰基]氨基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸或其药学可接受的盐。
(viii)按照(iii)的化合物，其中R5是R8-X-(CH2)y-CO-或其药学可接受的盐。
(ix)按照(viii)的化合物，其中X是氧或其药学可接受的盐。
(x)按照(iii)的化合物，其中R5是氢或其药学可接受的盐。
(xi)按照(x)的化合物，其是(8R，13R)-13-[[[3-(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]羰基]-2-(S)-吡咯烷基]羰基]氨基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸或其药学可接受的盐。
(xii)按照(iii)的化合物，其中R5是R-SO2-或其药学可接受的盐。
(xiii)按照(iii)的化合物，其中R5是低级烷基或其药学可接受的盐。
(xiv)按照(xii)的化合物，其是(8R，13R)-13-[[[1-甲磺酰基-3(R)-(4-羟苯基)-2(S)-吡咯烷基]羰基]氨基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-[4.12]十七烷-8-甲酸或其药学可接受的盐。
(xv)按照(i)的化合物，其中R2和R3与其所连的碳原子一起构成环己烷环或其药学可接受的盐。
(xvi)按照(xv)的化合物具有下式结构
(xvii)按照(xvi)的化合物，其是(9R，14R)-14-[[[3-(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]羰基]氨基]-7，15-二氧代-11，12-二硫杂-8，16-二氮杂螺[5.12]十八烷-9-甲酸或其药学可接受的盐。
(xviii)按照(xvi)的化合物，其中R5为R6-(CH2)m-CO-或其药学可接受的盐。
(xix)按照(xviii)的化合物，其是(9R，14R)-14-[[[1-乙酰基-3(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]羰基]氨基]-7，15-二氧代-11，12-二硫杂-8，16-二氮杂螺[5.12]十八烷-9-甲酸或其药学可接受的盐。
(xx)通式″A″的化合物 其中R1与其所连的氧构成可水解酯基；R2和R3各自独立地是低级烷基，或与其所连的碳原子一起构成含有4-6个碳原子的脂族碳环；R9是氨基保护基；R10和R10’是硫基保护基；和n是1-3的整数。
(xxi)按照(xx)的化合物，其中R2和R3与其所连碳原子一起构成环戊烷环。
(xxii)按照(xxi)的化合物，其是2(R)-[[[1-[[2(R)-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-1-氧代-3-[(三苯甲基)硫代]丙基]氨基]乙基]环戊基]羰基]氨基-3-[(三苯甲基)硫代]丙酸1，1-二甲基乙酯。
(xxiii)通式″B″的化合物 其中R1与其所连的氧构成可水解酯基；R2和R3各自独立地是低级烷基，或与其所连的碳原子一起构成含有4-6个碳原子的脂族碳环；R9是氨基保护基；和n是1-3的整数。
(xxiv)按照(xxiii)的化合物，其中R2和R3与其所连的碳原子一起构成环戊烷环。
(xxv)(xxiv)的化合物，其是(8R，13R)-13-[[(1，1-二甲基-乙氧基]羰基]氨基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸1，1-二甲基乙酯。
(xxvi)通式″C″的化合物 其中R1与其所连的氧构成可水解酯基；R2和R3各自独立地是低级烷基，或与其所连的碳原子一起构成含4-6个碳原子的脂族碳环；和n是1-3的整数；和其可水解酯和醚。
(xxvii)按照(xxvi)的化合物，其中R2和R3与其所连的碳原子一起构成环戊烷环。
(xxviii)按照(xxvii)的化合物，其是(8R，13R)-13-氨基-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸1，1二甲基乙酯。
本发明的化合物是有效的抗炎剂。根据本发明，该环状二硫化物通过抑制α4整联蛋白表达细胞与内皮的粘附作用达到抗炎。环状二硫化物的一般性机理是抑制α4整联蛋白表达细胞与内皮的细胞粘附分子的结合。此类化合物还可以抑制这些细胞在炎症位点如肺部的局部活化。本发明的化合物特别适合炎症的治疗，例如与慢性炎性疾病有关的炎症，其包括肺炎、哮喘、类风湿关节炎、多发性硬化症(MS)和炎性肠病(IBD)。
本申请中所用的术语“低级烷基”包括含有1-7个碳原子的直链和支链烷基，例如甲基、乙基和丙基，优选甲基。在此所用的术语“低级烷氧基”包括具有1-7个碳原子的直链或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基等。在此所用的术语“低级链烷酸”包括2-7个碳原子的链烷酸，例如丙酸和乙酸。在此所用的术语“卤素”或“卤代”除非另外说明，包括氟、氯、溴和碘。
术语“取代低级烷基”是指被一个或多个独立选自羟基、卤素、氰基、低级烷氧基、低级烷酰基、低级烷硫基、低级烷基亚磺酰基、低级烷基磺酰基和取代氨基的基团取代的低级烷基。取代低级烷基的实例包括2-羟基乙基、2，2，2，-三氟乙基、氰基甲基和2-硝基丙基。
术语“低级烷酰基”或“酰基”表示由2-7个碳原子的脂族羧酸衍生的基团，例如乙酰基、丙酰基等。术语“酰基”除了是指“低级烷酰基”以外还包括芳酰基，如苯甲酰基。
在此所用的术语“芳基”表示单环芳香烃基，例如苯基、甲苯基等，其可以未取代或在一个或多个位置被低级亚烷基二氧基、卤素、硝基、低级烷基或低级烷氧基取代基取代；和多环芳基，如萘基、蒽基、菲基、薁基等，其可以被一个或多个上述基团取代。优选该芳基是取代和未取代的单环芳基，特别是苯基。术语“芳烷基”表示烷基，其烷基为低级烷基，其中一个氢原子被芳基取代，芳烷基的实例是苄基、2-苯基乙基、3-苯基丙基、4-氯-苄基、4-甲氧基苄基等。
在此所用的术语“可水解酯或醚基”表示任何可以水解生成羟基和/或羧基的酯或醚。适于此目的的示例酯基为其中酰基衍生自低级链烷酸、芳基低级链烷酸或低级烷二羧酸的那些。其中，可以用来生成上述酯基的活化酸是酸酐和酰卤化物，优选由芳基或低级链烷酸衍生的酰氯化物或酰溴化物。酸酐的实例包括乙酸酐、己酸酐、苯甲酸酐、低级烷二羧酸酐，例如琥珀酸酐。此外，可水解酯可以由氯甲酸酯生成，例如氯甲酸三氯乙酯。
适用的醚保护基例如是四氢吡喃基醚或4-甲氧基-5，6-二氢-2H-吡喃基醚。其他是芳基甲基醚类化合物，如苄基、二苯甲基或三苯甲基醚；或α-低级烷氧基低级烷基醚，例如甲氧基甲基或烯丙基醚，或烷基甲硅烷基醚，如三甲基甲硅烷基醚。
此外，术语“可水解酯基”表示可以水解生成羧基的酯。通常，烷氧基部分衍生自低级醇或取代低级醇。其中，可以用来构成所述酯基的链烷醇是取代或未取代的伯、仲和叔链烷醇，例如乙醇、甲醇、异丙醇、叔丁醇和2-(二甲基氨基)乙醇。
术语“硫基保护基”表示任何可以裂解生成自由硫基的基团。其中，优选的硫基保护基是三芳基甲烷、三烷基甲烷、芳烷基如苄基。优选的酰基是低级烷酰基和芳酰基，特别是苯甲酰基。一般地，优选采用酸可裂解的硫基保护基，例如三芳基甲基，例如尤其优选三苯甲基。
术语“氨基保护基”表示任何可以裂解生成游离氨基的基团。氨基保护基可以是任何肽合成所用的常规氨基保护基。一般地，优选氨基保护基是能够在约pH 2.0-3.0的温和酸性条件下裂解的那些氨基保护基。特别优选的氨基保护基是叔低级烷基、低级烷基和三低级烷基甲基。
术语“药学可接受的盐”包括无机和有机药学可接受的盐的盐，例如盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、甲酸、马来酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、甲磺酸、对甲苯磺酸等。所属领域技术人员利用标准技术可以相当容易地制得上述盐。
在本申请所提供的化合物的图示中，深色锥形线()表示取代基位于不对称碳所属环的平面上方，虚线(---)表示取代基位于不对称碳所属环的平面的下方，和波浪线(～)表示取代基可以位于分子的平面的上方或下方。应理解本说明书提供化合物的图示目的在于方便，而且可以推断包含其他形式，包括立体异构体、对映异构体和消旋体，并且不限于所示的具体形式。
式1的化合物及其药学可接受的盐，和式1的化合物的中间体表现出立体异构现象。本发明的化合物可以是式1化合物的任何异构体或这些异构体的混合物。本发明具有一个或多个不对称碳原子的化合物和中间体可以作为立体异构体的消旋混合物得到，其可以在本发明方法的适当步骤中、利用所属领域熟知的方法拆分，得到指定的立体异构体或具有预期立体构型的纯对映异构体。另外，利用所属领域的已知方法可以直接合成所需的异构体。
不对称碳原子在本发明化合物中表示为a、b、c和d。表示为a、b、c和d的不对称碳原子的各个立体构型可以根据其所示的具体立体异构体来指定。本发明的化合物包括那些其中表示为“a”的碳原子具有S、R或R，S-构型；表示为“b”的碳原子具有S、R或R，S-构型；表示为“c”的碳原子具有S、R或R，S-构型；和表示为“d”的碳原子具有S、R或R，S-构型。
本发明化合物优选的立体构型是式1化合物的纯立体异构体。具有这种优选立体构型的化合物为式1a的化合物 其中在上述化合物中R2和R3与所连碳原子一起构成环戊烷环，优选构型为下式的化合物 式1的化合物和尤其是由纯的式1化合物的吡咯烷的(+)-反式异构体衍生的类似物作为抗炎剂表现出非常高的效价。一种测定这些抗炎剂效价的方式是通过评估其抑制整联蛋白VLA-4与细胞粘附分子VCAM-1的结合的能力。例如，可以通过VLA-4/VCAM-1结合试验、利用有关抑制半数VLA-4/VCAM-1结合作用时该化合物的浓度(IC50)来测定本发明化合物的效价。本发明的化合物，尤其是基本纯的(+)-反式异构体(即含有小于约5％相应立体异构体的(+)-反式异构体)表现出高于现有已知VCAM/VLA4拮抗剂的效价。
按照本发明，可以利用任何所属领域的已知方法来测定对VCAM-1/VLA-4结合的抑制。例如，固相双重抗体ELISA或基于分枝细胞(Ramos cell)的筛选试验可以用来测定对VCAM-1/VLA-4结合的抑制作用。
尤其优选的式1化合物是(8R，13R)-13-[[[1-乙酰基-3-(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]-羰基]氨基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸；(9R，14R)-14-[[[1-乙酰基-3-(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]-羰基]氨基]-7，15-二氧代-11，12-二硫杂-8，16-二氮杂螺[5.12]十八烷-9-甲酸；(8R，13R)-13-[[[1-甲磺酰基-3-(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]羰基]氨基]6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸；(8R，13R)-13-[[[1-(2，2-二甲基-1-氧代丙基)-3-(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]羰基]氨基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸；和(8R，13R)-13-[[[3-(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]羰基]氨基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸。
本发明的化合物可以经口服、直肠或非肠道如静脉内、肌肉内、皮下、鞘内或经皮给药；经舌下给药；或眼科制剂；或成为治疗肺炎的气溶胶。胶囊、片剂、混悬液或口服给药用溶液、栓剂、注射溶液、滴眼剂、软膏或喷雾溶液为给药形式的示例。
静脉内、肌肉内、口服或吸入给药是优选的给药形式。以有效量施用的本发明化合物的剂量取决于特定活性成分的特性、患者的年龄和需要以及给药的方式。通过常规途径如利用剂量-极限临床试验可以测定出剂量。所以，本发明进一步涉及一种治疗患病或损伤宿主的方法，其中VCAM-1或纤连蛋白与VLA-4-表达细胞结合在该病症或损伤中是一个致病因素，该方法通过施用足以抑制VCAM-1或纤连蛋白结合VLA-4-表达细胞量的本发明化合物由此减轻所说的症状或损伤。一般地，优选剂量为约0.1-100mg/kg体重/天，特别优选剂量为1-25mg/kg体重/天，尤其优选剂量为1-10mg/kg体重/天。
本发明还涉及含有药学有效量的本发明化合物和药学可接受载体的药物组合物。通过任何常规方式可以配制该组合物。片剂和颗粒剂可以含有一系列的粘合剂、填充剂、载体或稀释剂。液体组合物可以是例如灭菌水可混溶溶液的形式。胶囊除了含有活性成分以外可以含有填充剂或增稠剂。此外，矫味添加剂以及常用作防腐剂、稳定剂、保湿剂和乳化剂的物质和改变渗透压的盐、缓冲剂和其它添加剂也可以存在于组合物中。
本发明化合物在制备含有所述化合物作为活性剂用于治疗炎性疾病的药物中的应用，尤其是治疗由不利的整联蛋白与细胞粘附分子的结合作用所介导的疾病(如哮喘)的药物中的应用也是本发明的一个目的。
上述载体物质和稀释剂可以含有任何常规药学可接受有机或无机物质，例如水、明胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、阿拉伯胶、聚乙二醇类化合物等。
任何通过本发明的方法制备的化合物也是本发明的一个目的。按照本发明，式1的化合物是通过式13的环状肽核化合物 其中R1与其所连氧构成可水解酯基和R2和R3如上定义与式19的化合物反应制备得到 其中R15为低级烷基、R-SO2-、R6-(CH2)m-CO-或R8-X-(CH2)y-CO-和R、R6和R8如上定义。
适于制备本发明化合物的环状肽核13可以通过式2和3按照下面反应路线I反应制得。
其中R1与其所连的氧构成可水解酯基；R2和R3定义如上；R7与其所连的氧构成可水解酯基；R9为氨基保护基；R10和R10’为硫基保护基；和n如上所述。
式2的化合物中R7由相应的酸通过酯化该酸保护游离羧基生成。R7优选为低级烷基，例如甲基。在式2化合物的制备中，式2的化合物中相应的游离酸与烷基卤化物反应生成保护酯。可以采用任何将式2的相应游离酸基转化为标准可水解酯保护基的常规方法。
在反应路线I中，式2的酯通过式2的化合物与式3的二溴烷反应被烷基化。这种烷基化反应一般通过用强碱如二异丙基氨化锂处理式2的酯、在惰性溶剂如THF中、于维持低温下通常为-40至-78℃下进行，并且此后反应混合物与式3的二溴烷在此温度下反应，得到式4的溴化物。式4的溴化物与碱金属叠氮化物反应生成式5的叠氮化物。在这个步骤的反应中可以采用任何使卤化物转化为叠氮基的常规途径。例如，叠氮化钠在适当惰性溶剂如DMF中、于室温至80℃的温度下生成式5的叠氮化物。
式5的叠氮化物通过由R7构成的酯保护基的水解转化为式6的化合物。这种生成式6化合物的水解反应可以利用任何常规的酯水解方式进行，式6的化合物为式5的叠氮化物的相应游离酸。例如，通过用过量的氢氧化锂在含水甲醇中、于室温至溶剂回流温度下处理可以实现式5的酯基的水解，生成式6的酸。
在下步反应中，式6的游离酸与式7的胺反应在式6的游离酸基和式7的游离氨基之间生成酰胺键，由此得到式8的叠氮化物，可以利用任何常规酰胺形成方法来进行该反应。式6和7的化合物的缩合反应优选采用肽化学中所用的常规偶联剂如HBTU、在叔碱如二异丙基乙基胺的存在下、于适当溶剂如DMF中、在室温下完成。
在式7的化合物中，羧基由R1保护。优选采用叔丁基，因为它在该路线的后续反应中很容易脱除且不影响环上其它保护基。另外，在式7的化合物中，R10是硫基保护基。如本申请所述，可以采用任何适宜的保护基。
具有表示为“d”的不对称碳原子的化合物7可以具有特有的立体构型。另一方面，化合物7可以是立体异构体的混合物。化合物7的立体构型贯穿于该整个反应路线。所以，终产物化合物1的立体构型取决于化合物7的立体构型。也就是说，在表示为“d”的不对称碳原子处，化合物1将具有与化合物7相同的特定立体构型；或者，如果化合物7是立体异构体的混合物，则生成的化合物1也是立体异构体的混合物。
通过把叠氮基还原为相应的伯胺，式8的化合物转化成为式9的化合物。可以利用任何使叠氮化物还原为相应伯胺的常规方法。通常，叠氮化物8转化为式9的胺的还原反应采用常规还原剂优选膦(如三甲基或三苯基膦)、在适当惰性溶剂如在二氯甲烷中、于室温下反应。
在下步的反应中，式9的伯胺与式10的半胱氨酸衍生物的游离碳环酸偶联，生成酰胺键，其得到式11的肽键构成化合物。通过任何常规肽偶联方法如上述方法式9的氨基与半胱氨酸衍生物10的游离酸偶联。在生成式11的化合物中，化合物10的R9可以是肽合成中所用的任何常规氨基保护基。一般地，优选的氨基保护基是那些在约pH 2.0-3.0的温和酸性条件下可裂解的氨基保护基。特别优选的氨基保护基是叔低级烷氧基羰基，例如Boc基团。另外，在式10的化合物中，R10为硫基保护基。如本申请所述，可以采用任何适宜的硫基保护基。
化合物10在其表示为“c”的不对称碳原子可以具有特有的立体构型。另一方面，化合物10可以是立体异构体的混合物。化合物10的立体构型贯穿于该整个反应路线。所以，终产物化合物1的立体构型取决于化合物10的立体构型。也就是说，在表示为“c”的不对称碳原子处，化合物1将具有与化合物10相同的特定立体构型；或者，如果化合物10是立体异构体的混合物，则生成的化合物1也是立体异构体的混合物。
可以进行式9和10的化合物的酰胺偶联，其中化合物9和10两者或之一具有特有立体构型或是其混合物。优选两种混合物均衍生自L-半胱氨酸。当采用立体异构体的混合物时，生成化合物11为整个反应路线所保持的立体异构体的混合物。另外，当化合物11生成为一种立体异构体时，该立体异构体在整个反应路线中始终保持该特定立体构型。
式11的化合物环化生成式12的化合物。一般地，化合物11的环化可以通过在室温下用碘的二氯甲烷溶液处理其0.5-2g/L的稀释溶液来实现，得到式12的环状二硫化物。在这些条件下，脱除式11化合物的硫基保护基R10和R10’使两个硫基偶联，式11的化合物环化生成式12的环状二硫化物。
在下步的反应中，通过选择性脱除环状二硫化物的化合物12上的R9氨基保护基可以得到式13的化合物。环状二硫化物12含有氨基保护基R9和酯保护基R1。所以，应在酸性条件下、于低温下进行，优选0-20℃、在存在于乙酸乙酯内的1N HCl中处理12的化合物以便脱除R9氨基保护基，同时保留不受影响的R1酯保护基，得到适合下面偶联步骤的游离胺衍生物13。在有利的情况中，产物13可以沉淀自反应混合物，在其它情况中，通过加入溶剂如醚或己烷沉淀或通过小心浓缩可以进行分离。
化合物11中不对称碳原子“c”和“d”的特定立体构型被化合物13携带。所以，化合物13的立体构型取决于用于制备化合物11的化合物7和10的立体构型。
化合物19可以按照下面的反应路线2制备。
反应路线2 其中R11是醚保护基；Z是离去基团；R25是低级烷基；R35是R-SO2-；R55是R6-(CH2)m-CO-或R8-X-(CH2)y-CO-；R8-X-(CH2)y-CO-；R、R6、R8、X、y和m如上所述。
式19的化合物首先通过式14的化合物与式15的化合物反应得到式16的化合物来制备。根据该反应，通过1，4烯醇加成将反应化合物15交叉加成在式14化合物的双键上。任何交叉双键的烯醇加成的常规方法均可用来完成该反应。例如，在进行该1，4烯醇加成中，化合物14通过常规方式转化为其烯醇化锂，例如通过式14的化合物与化合物15的R-二内酰亚胺二甲基醚和n-BuLi反应。在-60至-78℃下进行化合物14的反应得到预期产物16。
对于表示为“a”的不对称碳原子，化合物14可以作为两种可能几何异构体之一或那两种几何异构体的混合物存在。同样地，由于表示为“e”的不对称碳原子，化合物15可以作为一种特定立体异构体或立体异构体的混合物存在。所以，根据化合物14和15的特定立体构型，可能产生化合物16的四种可能性立体异构体中的一种或其混合物。化合物18最终具有这些不同的立体构型。
优选的化合物16的立体构型如下所示 其中R11定义如上。
在式16的化合物中，优选R11是甲基。通过把化合物16的羧甲基还原为相应的CH2OH基，并且随后将CH2OH基上的OH转化为离去基团Z，可以令式16的化合物转化为式17的化合物。通常，该还原反应采用锂铝或锂硼氢化物还原剂如LiBH4或LAH在适当惰性溶剂如THF中、于-20℃至室温的温度下进行，得到化合物，该化合物一般不经分离，但其通过与适当试剂反应生成离去基团Z可以直接转化为化合物17，该离去基团Z可以是任何常规离去基团，如甲磺酰氧基或甲苯磺酰氧基。任何使化合物17反应生成离去基团Z的常规方式都可以采用，例如在二氯甲烷中、于叔胺碱如二异丙基乙基胺的存在下用甲磺酰氯处理。
化合物17在碘化钠的存在下在DMF中于60-130℃的温度下通过环化转化为内酰胺18。一般地，该反应适宜通过蒸馏除去低沸点二氯甲烷溶剂同时反应温度升高至完成该反应的温度进行。利用常规方法可以分离内酰胺18，例如硅胶色谱。在制备内酰胺18中，附着在化合物17的杂环含氮环中碳上两个甲氧基转化为羰基。
内酰胺18通过水解转化为式19a的化合物。任何能够同时水解式18化合物中的内酰胺基和由R11构成的保护基的已知方法均可以采用。例如，用存在于乙酸中的48％HBr在100-130℃的温度下处理内酰胺18数小时可以脱除R11基，并且打开内酰胺环得到19a。所以，化合物19a的立体构型得自于制备化合物16所采用的化合物14和15的立体构型。
化合物19的优选立体异构体如下所示 按照本发明，式19a的化合物通过与乙酰氯在弱有机碱如碳酸氢钠的存在下反应，式19a的化合物转化为式19b的化合物。以这种方式，式19b的化合物中的游离氨基得以保护。
通过用存在于甲醇中的无水盐酸在40-80℃的温度下处理式19c的化合物，式19b的化合物可以转化为式19c的化合物。以这种方式，式19b的化合物转化为19c的保护酸现在具有游离氨基。该游离氨基可以独立转化为取代基R25、R55和R35。
在式19c的化合物转化为其中R25为烷基的式22化合物过程中，式19c的化合物处理反应的低级烷基醛形成中间体胺，其随后用适宜还原剂如氰基硼氢化钠处理，一般在弱有机酸如乙酸的存在下进行，得到式22的化合物。通过在碱性条件下水解，例如用碱性碱如氢氧化钠处理，式22的化合物转化为式19g的化合物。
另一方面，式19c的化合物通过与低级烷基磺酰氯反应可以转化为式19e的化合物。以这种方式，式19c转化为式20的化合物。任何能够缩合仲胺和低级烷基磺酰氯的常规方法可以用来把式19c的化合物转化为式20的化合物。式20的化合物通过在碱性条件下例如用碱性碱(如氢氧化钠在含水条件下)水解可以转化为式19e的化合物。以这种方式，可以生成式19e的化合物，其中R35是低级烷基磺酰基。
式19的化合物通过与酰化剂，特别是下面的反应性衍生物反应，式19c的化合物可以转化为式21的化合物 反应性衍生物包括酰卤和酸酐。该方法中可以采用任何用这些酸酐或酰卤化物酰化仲胺的常规方法。以这种方式，可以制备式19f的化合物。
式19的化合物由式19f、19g和19e的化合物组成。该化合物可以通过下面的反应路线3转化为式Ig的化合物 其中R1、R2、R3，、R4、R5、R6和R15如上所述。
如上所示，利用标准酰胺合成可以将式13和19的化合物转化为式1a的化合物，例如用略微过量的HBTU和二异丙基乙基胺在非质子极性溶剂如DMF中室温至+45℃的温度下处理13和19可以得到式1a的化合物。R1与其所连的氧原子构成上述的可水解酯基。在适合可水解酯裂解的酸性条件下进一步处理1a，例如用4N盐酸在二噁烷/二氯甲烷中在室温下处理，并且在该反应结束后，产物用醚沉淀得到本发明的化合物I。
在式1a的化合物向其中R15为叔丁氧基羰基(Boc基)的式1化合物转化中，也就是R15为R8-X-(CH2)y-CO-；和R8是叔丁基，X为0和Y为0，该R15基团通过酸水解从式1a的化合物脱除生成式1的化合物，其中R5是氢。另一方面，通过其中R5为氢的式1化合物与Boc酐、在和从式19c的化合物制备式21的化合物所采用的相同条件下反应，可以使其中R5为氢的式1化合物再次转化为Boc基团。如果在反应路线3中用式19g的化合物代替式19a的化合物作为起始原料，将生成氨基被R25取代的式1化合物。另一方面，如果在反应路线3中用式19f的化合物代替式19a的化合物，将生成具有取代基R55的式1化合物。另一方面，如果在反应路线3中用式19e的化合物代替式19a的化合物，将生成具有取代基R35的式1化合物。
本发明进一步通过下列实施例举例说明。实施例中所用所术语定义如下THF为四氢呋喃，DMF为N，N-二甲基甲酰胺，HOBT为1-羟基苯并三唑，BOP是[(苯并三唑-1-基)氧基]三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐，HATU为O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸，HBTU为O-苯并三唑-N，N，N′，N′，-四甲基脲六氟磷酸，DIPEA为二异丙基乙基胺，DMAP为4-(N，N-二甲基氨基)吡啶，DPPA为二苯基磷酰叠氮化物，DBU为1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯NaH为氢化钠，盐水为饱和氯化钠水溶液，TLC为薄层层析，LiOH为氢氧化锂，LDA为二异丙基氨化锂，BOP-Cl是双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯，NMP为N-甲基吡咯烷酮，
Fmoc为(9-芴基甲氧基)羰基，TFA为三氟乙酸，HOAc是乙酸，HRMS是高分辨质谱，Trityl为三苯甲基，LAH为氢化锂铝，DCM为二氯甲烷Boc为[[(1，1-二甲基)乙氧基]羰基]-，Boc酐为二碳酸二叔丁酯，Boc2O为二碳酸二叔丁酯，HRP为辣根过氧化物酶，DMSO为二甲基亚砜，BSA为牛血清白蛋白，CHO为中国仓鼠卵巢，EDTA为乙二胺四乙酸，PMSF为对甲苯磺酰氟，PBS为磷酸盐缓冲溶液。
0℃和氩气氛下，向甲醇(0.15mL，3.8mmol)在5mL乙酸乙酯中的混合物内加入乙酰氯(0.27mL，3.8mmol)。将该溶液在0℃下搅拌10分钟，室温下搅拌30分钟。向该溶液中加入(8R，13R)-13-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸1，1-二甲基乙酯(130mg，0.25mmol)。将该混合物搅拌7小时。在玻璃料上收集沉淀并且用乙醚洗涤。高真空干燥后，得到92mg的(8R，13R)-13-氨基-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸1，1-二甲基乙酯(收率96％，基于蒸发滤液和洗涤后回收的起始原料)。
将上式油3(R)-[(2S，5R)-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-5-(1-甲基乙基)-2-吡嗪基]-3-(4-甲氧基苯基)丙醇(28)(17.7g)溶于300mL二氯甲烷中。-5℃向该溶液中加入钾磺酰氯(8.02g，5.42mL，70mmol)，随后在约10分钟内滴加二异丙基乙基胺(DIPEA，12mL，70mmol)。该反应在0℃下搅拌2小时。浅黄色溶液用2L乙醚稀释，用水(3×200mL)和盐水(2×200mL)洗涤。硫酸钠干燥后，20℃真空下浓缩该溶液至体积为160mL。TLC在EA/H(＝1∶1)中Rf＝0.74，为主要斑点；Rf＝0.21，为次要斑点。
室温下，向这种酯(3.01g)在15mL干燥二氯甲烷中的溶液内一次性加入含在二噁烷(50mL)中的4N HCl。室温下将所得溶液搅拌4.5小时得到混悬液。混悬液用50mL混合溶剂(3∶7二氯甲烷∶乙醚)稀释，过滤。浅黄色滤饼依次用上述混合溶剂(2×20mL)、乙醚(2×20mL)洗涤。真空下干燥滤饼，得到浅黄色粉末(2.51g，HLPC纯度＞85％)。利用RP-HPLC进行纯化得到(8R，13R)-13-氨基-6，4-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸白色固体(1.55g，2.61mmol)，收率52％。HRMS(M+H)实测值593.209，计算值593.2103。
粗品胺溶于乙酸乙酯(10mL)并且向该混合物中加入Boc2O(1.0g，4.6mmole)。将所得混合物搅拌过夜。将反应混合物倾入含乙酸乙酯(75mL)和水(25mL)的分液漏斗中，分离水层，再用乙酸乙酯(1×50mL)提取。合并的有机层用饱和盐水洗涤，MgSO4干燥，过滤，真空浓缩。通过闪式柱色谱纯化，用己烷-乙酸乙酯(6∶1，随后4∶1)洗脱，得到N-[[(1-[(2-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]乙基]-环己烷]羰基]-S-三苯甲基-L-半胱氨酸甲酯(23)(0.88g，62％)。高分辨质谱m/z 653.3007[(M+Na)+；计算值C37H46N2O5SNa653.3025]。
向实施例15制备的酯23(0.88g，1.4mmole)在二氯甲烷(10mL)中的溶液内加入TFA(5mL)。将该混合物搅拌45分钟，真空浓缩。TFA盐在高真空下干燥2小时。
向粗品TFA盐、Fmoc-Cys(Acm)-OH(575mg，1.4mmol)和二异丙基乙基胺(1mL，excess)在DMF(10mL)中的溶液内加入HBTU(595mg，1.6mmole)。将所得混合物搅拌过夜。将反应混合物倾入含乙酸乙酯(150mL)的分液漏斗中，用0.3M HCl(2×30mL)洗涤。合并水层，再用乙酸乙酯(1×50mL)提取。合并的有机层用饱和NaHCO3(1×30mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤和真空浓缩。通过闪式柱色谱纯化，用己烷-乙酸乙酯(1∶1，随后2∶3)洗脱，得到2(R)[[[1-[2-[[3-[[(乙酰基氨基)甲基]硫基]-2(R)-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-1-氧代丙基]-氨基]乙基]环己基]羰基]氨基]-3-[(三苯基甲基)硫基]丙酸甲酯(24)(1.05g，80％)。HRMS(C53H58N4O7S2)实测值，m/z 949.3636(M+Na)+。计算值949.3645。
向上述胺(50mg，0.07mmol)、(2S，3R)-1-乙酰基-3-(4-羟基)苯基脯氨酸(32)(18mg，0.07mmole)和二异丙基乙基胺(0.05mL，过量)在DMF(1mL)的溶液内加入HBTU(30mg，0.08mmole)。将所得混合物在室温下搅拌3.5小时。将反应混合物倾入含有乙酸乙酯(50mL)的分液漏斗中，用0.5M HCl(2×15mL)洗涤。合并水层，再用乙酸乙酯(1×20mL)洗涤。合并的有机层用饱和NaHCO3(1×15mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤，真空下浓缩，得到50mg粗品25。该物质难以提纯，所以全面的定性是在水解该甲酯后进行。
向(2S，3R)-1-(2，2-二甲基-1-氧代丙基)-3-(4-羟苯基)吡咯烷-2-甲酸(45mg，0.15mmol)和实施例6中制得的(8R，13R)-13-氨基-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸1，1-二甲基乙酯氢氯化物(70mg，0.15mmol)在0.5mL DMF作的混合物内加入DIPEA(58mg，0.45mmol)和HBTU(59mg，0.15mmol)。将该溶液在室温下搅拌3小时，用水稀释至3mL。收集所得白色沉淀，减压下干燥过夜，得到98mg的(8R，13R)-13-[[[1-(2，2-二甲基-1-氧代丙基)-3-(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]羰基]氨基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸1，1-二甲基乙酯，其为白色固体。将该干燥的固体溶于1mL二氯甲烷，溶液用含在二噁烷中的4N HCl(2mL)处理。将该溶液搅拌过夜，浓缩。残余物通过反相HPLC纯化(5-95％的乙腈，存在于含0.75％TFA的水中，约40分钟内线性梯度)，得到(8R，13R)-13-[[[1-(2，2-二甲基-1-氧代丙基)-3(R)-(4-羟苯基)-2(S)-吡咯烷基]羰基]氨基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸，其为白色固体(9mg)。HRMS(M+H)实测值635.2543，计算值635.2573。
方法VLA-4(α4β1整联蛋白)拮抗剂活性被定义为与细胞表面VLA-4竞争结合固定VCAM-1的能力，该活性利用分枝-VCAM-1细胞粘附试验定量分析。带有细胞表面VLA-4的分枝细胞用荧光染料(钙黄绿素-AM)标记，并且允许在试验化合物存在或不存在下结合VCAM-1。与粘着细胞有关的荧光强度的降低(％抑制)反映出试验化合物对VLA-4介导的细胞粘附的竞争性抑制作用。
首先，这需要用重组人VCAM-1(100ng存在于100μlPBS中)涂层96孔平板(Nunc Maxisorp)，密封各平板，随后将平板置于4℃下18小时。VCAM涂层的平板进而用含0.05％Tween-20的PBS洗涤2次，随后用200μl的封闭缓冲液(1％BSA/0.02％硫汞撒)封阻1小时(室温)以结束非特异性结合。随后用封闭缓冲液培育，反转平板，印迹并且吸除残余缓冲液。随后用300μl的PBS冲洗各个平板，反转并且吸除残余PBS。
将试验化合物溶于100％DMSO，随后在VCAM细胞粘附试验缓冲液(4mM CaCl2、4mM MgCl2，存在于50mM TRIS-HCI中，pH 7.5)(最终DMSO＝4％)中1∶25稀释。对各个化合物进行一系列的8次1∶4稀释(一般的浓度范围为1nM-12,500nM)。将100μl/孔的各稀释液加入VCAM涂层的平板中，随后加入100μl的分枝细胞(200,000个细胞/孔，存在于1％BSA/PBS)中。令含有试验化合物和分枝细胞的平板在室温下温育45分钟，此后加入165μl/孔PBS。反转平板除去未粘着细胞，印迹并且加入300μl/孔。再次反转平板，印迹，轻轻吸除残余缓冲液。向各孔中加入100μl溶胞缓冲液(0.1％SDS，存在于50mM TRIS-HCl，pH 8.5)，在旋转震动平台上搅动2分钟。随后在Cytofluor 2300(Millipore)荧光测定系统(激发＝485nm，发射＝530nm)上读取平板的荧光强度。
权利要求
1.通式I的化合物 其中R2和R3各自独立地是低级烷基，或与其所连的碳原子一起构成含有4-6个碳原子的脂族碳环；R5是氢、低级烷基、R-SO2-、R6-(CH2)m-CO-或R8-X-(CH2)y-CO-；R是低级烷基；R6和R8是氢或低级烷基；X为-O-或-NH-；m是1-7的整数，y是0-7的整数，和n是1-3的整数；同时a、b、c和d表示不对称碳原子；和及其可水解酯或醚，或其药物可接受的盐。
2.按照权利要求1的化合物，其中R2和R3与其所连的碳原子一起构成含有4-6个碳原子的脂族环烷环或其药学可接受的盐。
3.按照权利要求2的化合物，其中R2和R3与其所连的碳原子一起构成环戊烷环或其药学可接受的盐。
4.按照权利要求3的化合物，具有下式 或其药学可接受的盐。
5.按照权利要求4的化合物，其是(8R，13R)-13-[[[3-(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]羰基]氨基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸或其药学可接受的盐。
6.按照权利要求4的化合物，其中R5是R6-(CH2)mCO-或其药学可接受的盐。
7.按照权利要求6的化合物，其是(8R，13R)-13-[[[1-乙酰基-3-(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]羰基]氨基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸或其药学可接受的盐。
8.按照权利要求6的化合物，其是(8R，13R)-13-[[[1-(2，2-二甲基-1-氧代丙基)-3-(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]-羰基]氨基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸或其药学可接受的盐。
9.按照权利要求4的化合物，其中8是R8-X-(CH2)y-CO-或其药学可接受的盐。
10.按照权利要求9的化合物，其中X是氧或其药学可接受的盐。
11.按照权利要求4的化合物，其中R5是氢或其药学可接受的盐。
12.按照权利要求11的化合物，其是(8R，13R)-13-[[[(3-(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]羰基]氨基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸或其药学可接受的盐。
13.按照权利要求4的化合物，其中R5是R-SO2-或其药学可接受的盐。
14.按照权利要求4的化合物，其中R5为低级烷基或其药学可接受的盐。
15.按照权利要求13的化合物，其是(8R，13R)-13-[[[1-甲磺酰基-3(R)-(4-羟苯基)-2(S)吡咯烷基]羰基]氨基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸或其药学可接受的盐。
16.按照权利要求2的化合物，其中R2和R3与其所连的碳原子一起构成环己烷环或其药学可接受的盐。
17.按照权利要求16的化合物，具有下式
18.按照权利要求17的化合物，其是(9R，14R)-14-[[[3-(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]羰基]氨基]-7，15-二氧代-11，12-二硫杂-8，16-二氮杂螺[5.12]十八烷-9-甲酸或其药学可接受的盐。
19.按照权利要求17的化合物，其中R5为R6-(CH2)m-CO-或其药学可接受的盐。
20.按照权利要求19的化合物其是(9R，14R)-14-(([1-乙酰基-3-(R)-(4-羟苯基)-2-(S)-吡咯烷基]羰基]氨基]-7，15-二氧代-11，12-二硫杂-8，16-二氮杂螺[5.12]十八烷-9-甲酸或其药学可接受的盐。
21.下面通式的化合物 其中R1与其所连的氧构成可水解酯基；R2和R3各自独立地是低级烷基，或与其所连的碳原子一起构成含有4-6个碳原子的脂族碳环；R9是氨基保护基；R10和R10’是硫基保护基；和n是1-3的整数。
22.按照权利要求21的化合物，其中R2和R3与其所连的碳原子一起构成环戊烷环。
23.权利要求22的化合物，其是2(R)-[[[1-[[2(R)-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-1-氧代-3-[(三苯甲基)硫基]丙基]氨基]乙基]环戊基]羰基]氨基-3-[(三苯甲基)硫基]丙酸1，1-二甲基乙酯。
24.下面通式的化合物 其中R1与其所连的氧构成可水解酯基；R2和R3各自独立地是低级烷基，或与其所连碳原子一起构成含有4-6个碳原子的脂族碳环；R9是氨基保护基；和n是1-3的整数。
25.按照权利要求24的化合物，其中R2和R3与其所的连碳原子一起构成环戊烷环。
26.权利要求25的化合物，其是(8R，13R)-13-[[(1，1-二甲基-乙氧基]羰基]-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸1，1-二甲基乙酯。
27.下面通式的化合物 其中R1与其所连的氧构成可水解酯基；R2和R3各自独立地是低级烷基，或与其所连的碳原子一起构成含4-6个碳原子的脂族碳环；和n是1-3的整数；和其可水解酯和醚。
28.按照权利要求27的化合物，其中R2和R3与其所的连碳原子一起构成环戊烷环。
29.权利要求28的化合物，其是(8R，13R)-13-氨基-6，14-二氧代-10，11-二硫杂-7，15-二氮杂螺[4.12]十七烷-8-甲酸1，1-二甲基乙酯。
30.一种药物组合物，其含有药学有效量的所述权利要求1-20中任一项的化合物或其药学可接受的盐，如果需要还含有药学惰性载体。
31.一种制备权利要求1的化合物的方法，其特征在于式13的环状核化合物 其中R1与其所连的氧构成可水解酯基；并且R2和R3如权利要求1中定义，与式19的化合物反应 其中R15是低级烷基、R-SO2-、R6-(CH2)m-CO-或R8-X-(CH2)y-CO-，和R、R6和R8如权利要求1中定义。
32.按照权利要求31所要求的方法制备的权利要求1-20任一项所要求的化合物。
33.作为治疗剂的权利要求1-20任一项所要求的化合物。
34.权利要求1-20任一项所要求的化合物在制备含有此类化合物作为活性剂的用于治疗炎性疾病、尤其是由整联蛋白和细胞粘附分子的不利结合所介导的疾病如哮喘的药物中的应用。
35.本发明业已描述如上。
全文摘要
本发明描述了式(I)的化合物是具有活性的抗炎剂。提供抑制细胞和内皮结合的环状二硫化物。此类化合物可以有效治疗炎性疾病,例如哮喘,其症状和/或损伤与细胞粘附分子与整联蛋白表达细胞的结合有关。
文档编号C07K5/02GK1347419SQ00806460
公开日2002年5月1日 申请日期2000年4月17日 优先权日1999年4月20日
发明者陈力, 纳德尔·福图希, 达维德·扬·雅克松, 杰斐逊·赖特·蒂利 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司