抗白细胞粘附分子vla-4的人源化抗体的制作方法

专利名称：抗白细胞粘附分子vla-4的人源化抗体的制作方法
背景技术：
本发明涉及对白细胞粘附分子VLA-4的α-4亚单位特异的人源化抗体。
背景技术：
发炎是血管化组织对感染或损伤的反应，是白细胞粘附到血管的内皮细胞且浸润到周围组织中而引起的。发火在正常情况下，浸润的白细胞释放出毒性介质以杀死侵入的有机体，吞噬残片和死细胞，在组织修复和免疫应答中起作用。然而，发炎在病理条件下，浸润的白细胞反应过度并可引起严重的或致命的损害。参见，例如，Hickey，Psychoneuroimmunology II(Academic Press 1990)。
通过内皮细胞和白细胞的细胞表面配体和受体间的相互作用，白细胞附着到内皮细胞上。参见Springer，Nature 346425～433(1990)。配体和受体间的同一性随细胞亚型、解剖部位发炎刺激物的不同而异。VLA-4白细胞细胞表面受体是由Hemler首先鉴定的(Hemler，EP 330,506(1989)，为各种目的在整体上引作参考)。VLA-4是细胞表面受体β1整合蛋白家族的成员，均含有α和β链。VLA-4含有α4和β1链。VLA-4与称作VCAM-1的内皮细胞配体特异地结合。参见Elices等，Cell 60577-584(1990)(该文献在整体上作为参考)。虽然VCAM-1是在活化的人脐静脉细胞上被首次探测到的，但该配体在脑内皮细胞上也已被探测到。参见共同拥有的待审查的美国序号为07/871,223的申请(该文献在整体上引作参考)。
粘附分子，如VLA-4，是治疗剂的潜在的靶位。由于VLA-4受体与位于脑内皮细胞上的配体相互作用，VLA-4受体是特别重要的靶位。由大脑发炎而产生的疾病和症状具有特别严重的后果。例如，一种多样硬化症的疾病(MS)有慢性病程(有或没有病情加重或缓解)，从而导致严重的能力丧失和死亡。据估计该疾病仅在美国就有250,000到350,000的人数受到了影响。
在动物模型中，已在活体内和活体外对抗VLA-4受体抗体的抗炎能力进行测试。参见USSN 07/871,223和Yednock等，Nature 35663～66(1992)(这些文献在整体上引作参考)。活体外的试验证明了抗-VLA-4抗体阻断淋巴细胞附粘于脑内皮细胞。在人工诱导条件(试验自体免疫脑脊髓炎)刺激动物产生多样性硬化病，动物试验测试了抗-VLA-4抗体对所述动物的作用效果。试验表明给药抗-VLA-4抗体可防止动物的脑发炎和随后的麻痹。总之，这些试验证明了抗-VLA-4抗体可用于多样性硬化病和其它炎症疾病及紊乱的潜在的治疗剂。
目前可得到的抗-VLA-4抗体存在的明显的问题是它们都是鼠源的，因此有可能在临床应用中会引起人抗鼠应答(HAMA)。HAMH应答降低了鼠抗体对患者的效果，并阻碍了继续给药。解决这个问题的一个办法即是将鼠抗体人源化。在该办法中，将供体鼠可变区的互补决定区(CPRs)和某些其它氨基酸移植酸人的可变受体区，然后与人的恒定区融合起来。参见，例如，Riechmann等，Nature 332332～327(1988)；Winter，US5,225,539(1993)(每篇文献在整体上引作参考)。
虽然已经制出了几种人源化抗体样本，但将鼠源抗体转变成人源化抗体涉及竞争考虑的折衷，其解决办法也因抗体的不同而异。为减小免疫原性，免疫球蛋白应该尽可能多地保留人受体序列。然而，为保留可靠的结合性质，免疫球蛋白框架应含有人受体序列的充分取代以保证其CDR区的三维构象尽可能地接近于原初的鼠供体免疫球蛋白的构象。作为竞争考虑的结果，目前生产的衍生于小鼠抗体的许多人源化抗体与相应的小鼠抗体相比表明丧失了一些结合亲合性。参见，例如，Jones等，Nature 321522～525(1986)；Shearman等，J.Immunol.1474366～4373(1991)；Gorman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 884181～4185(1991)；Tempest等，Biotechnology 9266～271(1991)。
基于以上所述，很明显要求人源化抗-VLA-4抗体对VLA-4受体具有强亲和力，而同时该抗体产生，即使产生的话，几乎很少的人抗鼠应答。本发明满足了该项和其他要求。
本发明概述本发明提供了能与VLA-4配体特异结合的人源化免疫球蛋白。人源化的抗体含有人源化的轻链和人源化的重链。人源化的轻链含有3个互补决定区(CDR1，CDR2，CDR3)和来自于除自由L45、L49、L58和L69位所组成的第一组中的至少一个位点外的人K轻链可变区框架序列的可变区框架；其中氨基酸的位置由存在于小鼠21.6免疫球蛋白轻链可变区框架相应位置上的同样的氨基酸占据。所述的互补决定区的氨基酸序列相应于小鼠的21-6免疫球蛋白的互补决定区。人源化的重链含有三个互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)和来自于除选自由H27、H29、H30、H44、H71组成的组中的至少一个位点外的人重链可变区框架序列的可变区框架，其中氨基酸的位置由存在于小鼠21-6免疫球蛋白重链可变区框架相应位置的同样的氨基酸所占据。该免疫球蛋白与VLA-4特异性的结合。其亲和力的下限为大约107M-1，上限为大约5倍于小鼠21-6免疫球蛋的亲和力。
通常，人源化的轻链和重链可变区框架分别来自于RE1和21/28′CL可变区框架序列。当人源化轻链可变区框架来自于RE1时，至少有二个框架氨基酸被替代了。一个氨基酸来自上面所述的第一组。另一个氨基酸来自由L104、L105、L107组成的第3组。这个位置由存在于人免疫球蛋白而不是RE1的K轻链相应位置的氨基酸所占据。
某些人源化的免疫球蛋白具有在图6中所示为La或Lb的成熟的轻链可变区序列，或在图7中示为Ha、Hb的成熟的重链可变区序列。优选的人源化免疫球蛋白包括那些具有La轻链和Ha、Hb或Hc重链。
本发明还提供前面述及的抗VLA-4人源化免疫球蛋白的结合片段。
另一方面，本发明提供编码上面所述的抗VLA-4的人源化免疫球蛋白的核酸序列。
还提供了编程来显示上面所述的小鼠21.6抗体或人源化免疫球蛋白的三维构象的计算机。
另一方面，本发明提供药物组合物及用其进行治疗的方法，该药物组合物含有上面所述的人源化免疫球蛋白或结合片段，及药物学可接受的载体。在某些治疗方法中，给患有炎症疾病，如多样性硬化症的患者给药治疗有效剂量的药物组合物。
还提供了用前面述及的人源化免疫球蛋白和结合片段来探测VLA-4抗原的方法。在这些方法中，对患者或从其身上取下的组织样品给药人源化的抗体或结合片段。检测了由抗体或片段和存在于样品中的VLA-4特异性结合所形成的复合体。
附图的简略描述

图1小鼠21.6轻链可变区的DNA(SEQ.ID NO1)和氨基酸(SEQ.ID NO2)序列。
图2小鼠21.6重链可变区的DNA(SEQ.ID NO3)和氨基酸(SEQ.ID NO4)序列。
图3用于产生具有在哺乳动物细胞中的人κ轻链和人γ-1重链的嵌合和整形的人抗体的轻链(A)和重链(B)表达载体。
图4与L细胞结合的嵌合的和小鼠21.6抗体的ELISA比较，L细胞在其表面表达人α4β1整合蛋白。
图5小鼠21.6抗体可变区的分子模型。标记了特别令人感兴趣的残基。
图6小鼠和整形的人21.6(SEQ.ID NO5)轻链可变区的氨基酸序列的比较。用星号标记的氨基酸残基是CDR环结构的Chothia经典序列的部分。REI(SEQ.ID NO6)表示来自于REI轻链的VL区的FRs和CPRs。La(SEQ.IDNO7)和Lb(SEQ.ID NO8)是整形人21.6区的两种形式。下画线的残基是不同于REI序列中的那些的La的FRs。在Lb中，只示出了与REI不同的那些框架区残基。
图7小鼠和整形的人21.6(SEQ.ID NO9)重链可变区的氨基酸序列的比较。用星号标记的氨基酸残基是Chothia CDR环结构的经典序列部分。2*CL(SEQ.ID NO10)表示来自于人21/28′CL抗体VH区的FRs和CDRs。Ha(SEQ.ID NO11)、Hb(SEQ.ID NO12)和HC(SEQ.ID NO13)是整形的人21.6VH区的三种形式。下画线的残基是Ha的FRs与21/28′CL序列中的那些不同的部分。在Hb和Hc中，只示出了与21/28′CL不同的那些框架区残基。
图8基于PCR的“a”型整形的人21.6轻链可变区的构造。斜线表示在引物间的至少21个碱基的互补序列。
图9基于PCR的“a”型整形的21.6重链可变区的构造。
图10第一型(“a”)的整形的人21.6轻链可变区的cDNA和氨基酸序列(SEQ.ID NOS14和15)。
图11第一型(“a”)的整形的人21.6重链可变区的DNA和氨基酸序列。
图12嵌合的和整形的人21.6抗体与L细胞结合的ELISA比较，所述的L细胞在其表面上表达α4β1整合蛋白。
图13小鼠21.6抗体与不同的抗-VLA- 4抗体，L25的比较。图A比较了在有和无Mn2+存在时，为纯化VCA-1抗体阻断U937单核细胞结合的能力。图B比较了为提高VCAM-1的浓度，抗体阻断Jurkat细胞结合的能力。
图14用小鼠或人21.6抗体处理动物体重减少的延迟。
图15用小鼠或人21.6抗体处理动物，其临床症状的逆变。
图16用小鼠或人21.6抗体处理动物，其体重减少的逆变。
定义对天然存在的20个氨基酸的简称可沿用惯用法(Immunology-A Synthesis(2nd ed.，E.S.Golub & D.R.Gren，eds.，Sinauer Associates，Sunderland，MA，1991))。该20种常规氨基酸，非天然氨基酸如α、α-双取代氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸，和其他非常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)对本发明的多肽来说也是合适的组份。非常规氨基酸的例子包括4-羟基脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N-乙酰基赖氨酸，O-磷酸丝氨酸，N-乙酰基丝氨酸，N-甲酰基蛋白氨酸，3-甲基组氨酸，5-羟基赖氨酸，ω-N-甲基精氨酸，和其他类似的氨基酸及亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。此外，氨基酸可被糖基化、磷酸化等进行修饰。
在此所用的多肽，根据标准用法和常规，左侧是氨基末端右侧是羧基末端。类似地，除非特别指出，单链多聚核苷酸序列的左手端是5′端；双链多聚核苷酸序列的左手侧指的是5′方向。新生RNA转录物的5′→3′方向的是转录方向；DNA链的与RNA具有同样序列的区域及5′端至RNA转录的5′端称为“上游序列”；DNA链的与RNA具有同样序列的序列区及3′端至RNA转录的3′称为“下游序列”。
术语“多聚核苷酸序列”指的是从5′→3′端阅读的单链或双链脱氧核糖核酸或核糖核酸的聚合体。它包括自体复制的质粒，有侵染性的DNA或RNA的聚合体和非功能的DNA或RNA。
下列术语用来描述两个或多个多聚核苷酸间的序列关系“参考序列”、“比较窗框”(comparison window)、“序列一致性”、“序列一致性的百分数”、和“基本上一致性”。“参考序列”定义为用作序列比较基础的序列；参考序列可以是较长序列的一部分，例如，本序列表中列出的全长cDNA或基因序列的片段，如图1或图2的多聚核苷酸序列，参考序列也可包含完整的DNA或基因序列。参考序列的长度一般为至少20个核苷酸，通常为至少25个核苷酸，经常为至少50个核苷酸。既然两个多聚核苷酸(1)可能每个均含有在两个多聚核苷酸之间相似的序列(即，完整多聚核苷酸序列的部分)，和(2)也可能还含有在两个多聚核苷酸间不同的序列，两个(或多个)多聚核苷酸间的序列比较，典型地通过比较两个多聚核苷酸的序列而不是通过“比较窗框”来进行鉴定和比较局部区域的序列相似性。在此处所用的“比较窗框”是指至少20个紧邻的核苷酸位置的概念的片段，其中多聚核苷酸序列可与至少20个紧邻核苷酸的参考序列比较；和与参考序列(其不包含增加或缺失)相比，比较窗框中的多聚核苷酸序列部分可包含20％或更少些的增加或缺失有利于两序列的最佳直线排列。对比较窗框的直线排列的序列的最佳直线排列可通过(Smith & Waterman)局部的同源性算法(Adv.Appl.Math.2482(1981))，Needleman & Wunsch的同源性直线排列算法(J.Mol.Biol.48443(1970)，通过Pearson & Lipman的相似性检索办法(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)852444(1988))(每篇文献在整体上均作参考)，通过这些算法的计算机化的实现(GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA in the Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通过检查，和由所选的各种方法所产生的最佳直线排列(即，通过比较窗框而得的最高比例的序列相似性)而实现。术语“序列一致性”意思是指通过比较窗框两个多聚核苷酸序列是一致的(即，基于核苷酸--核苷酸的比较)。术语“序列一致性的百分数”是通过窗框的比较而进行两个最佳直线排列的序列的比较，确定在两个序列中出现的同样核酸碱基(如，A、T、C、G、U、或I)而产生的匹配位置的数目，用比较窗框内(即，窗框的大小)匹配位置的数目除以全部的位置数，和将所得的结果乘以100以得到序列一致性的百分数。在此所用的术语“基本的一致性”，指的是多聚核苷酸序列的特征，其中该多聚核苷酸含有序列，该序列为当通过比较窗框在至少20个核苷酸位置，经常通过在至少25～50个核苷酸的窗框与参考序列相比较时，该序列具有至少85％的序列一致性，经常为至少90～95％的序列一致性，更经常为至少99％的序列一致性；其中序列一致性的百分数是通过将参考序列与多聚核苷酸序列相比较而计算出的，所述的多聚核苷酸序列包括通过窗框比较占参考序列20％或更少些的缺失或增加。参考序列可能是较大的一部分序列，例如，示于图1或2的序列。
当用于多肽时，术语“序列一致性”是指肽在相应位置具有同样的氨基酸。术语“序列相似性”是指肽在相应位置具有同样的或相似的氨基酸(即保持性置换)。术语“基本的一致性”是指当最佳直线排列时，如使用系统间歇重量(default gapweight)通过GAP或BESTFIT程序时，两个肽序列，具有至少80％序列一致性，优选至少90％的序列一致性，更优选至少95％或更高的序列一致性(如，99％的序列一致性)。优选地，不相同的残基位置是由于保守氨基酸的取代产生的差异。术语“基本的相似性”是指两个肽序列具有相应百分数的序列相似性。
术语“基本纯”是指目标成份(object species)是主要存在的成份(即，以摩尔计，该成分的含量比组合物中的任何其它单独的组分的含量都要高)，和优选地基本纯化的级分是组合物，其中目标成份含有至少大约50％(以摩尔计)的大分子成份。通常，基本纯的组合物包含多于80～90％的组合物中的所有大分子成份.。优选地，目标成份被纯化至基本均一(用常规的检测方法不能检出污染成分)，其中组合物实质上由单一的大分子成分组成。
为将氨基酸置换分为保持的或非保持的，将氨基酸分成以下几组组I(疏水侧链)正亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；组H(中性疏水侧链)半脱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；组III(酸性侧链)天冬氨酸、谷氨酸；组IV(碱性侧链)天冬酰胺、谷氨酰酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；组V(残基影响链的方向)甘氨酸、脯氨酸；和组VI(芳香族侧链)色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。保持性置换包括在同类氨基酸间的置换。非保持性置换包括将这些类中的一类成员变成另一员。
来自于免疫球蛋白成熟重链和轻链可变区的氨基酸分别以Hx和Lxx指定，其中x是按照Kabat等的方案指定氨基酸位置的数目(Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，MD(1987))和(1991))(在以后均表示为“Kabat等”，并在整体上该文献在此引作参考)。Kabat等列出了每个亚类的抗体的许多氨基酸序列，和列出了在该亚类每个残基位置上最经常发生的氨基酸。Kabat等，使用了在所列序列中给予每个氨基酸一个残基号码的方法，该给予残基号码的方法已变成本领域的标准。Kabat等的方案可延及并未包括在其方案概要中其它抗体，即通过把怀有疑问的抗体与在Kabat等中的一个一致序列进行直线排列。Kabat等的编号系统使用使在不同抗体的等同位置的氨基酸易于被识别。例如，人抗体L50位置的氨基酸占据小鼠抗体L50氨基酸位置的等同位置。
详细描述I.特异于VLA-4的人源化抗体在本发明的一个实施方案中，提供了特异于VLA-4的α-4亚基的人源化免疫球蛋白(抗体)。人源化免疫球蛋白具有不同的主要来自人免疫球蛋白(称为受体免疫球蛋白)的框架区和主要来自称为mu MAb 21.6的小鼠免疫球蛋白(指的是供体免疫球蛋白)的互补决定区。恒定区，如果有的话，也主要来自人免疫球蛋白，人源化抗体表现出对VLA-4至少107、108、109或1010M-1的结合亲和力。通常，人源化抗体VLA-4的结合亲和力的上限在mu MAb21.6对VLA-4结合亲和力(大约109M-1)的3或5指数之内。结合亲和力的下限也经常在mu MAb21.6的结合亲和力的3或5指数之内。
A.免疫球蛋白的一般特征已知基本的抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻链(大约25KDa)和一条重链(大约50～70kDa)。每条链的氨基末端部分包括大约100至110或更多的氨基酸的可变区，其主要负责抗原的识别。每条链的羧基末端部分定义于恒定区，主要起效应器的功能。
轻链被分成K或λ。重链被分成γ，μ，α，δ或ε，且将抗体的同型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在重链和轻链内，可变区和恒定区由大约12个或更多氨基酸的“J”区连接起来且重链还包括大约10个或更多氨基酸的“D”区。(参见Fundamental Immunology(Paul，W.，ed.，Raven Press，N.Y.，1989)，Ch.7(整体上该文献引作参考))。
每个轻/重链对的可变区形成抗体的结合位点。所有的链均具有三个高可变区，也被称为互补决定区或CDRs连接的相对保持的框架区FR相同的一般结构。来自每对两条链的CDRs被框架区排列成直线，能与特定的表位结合。按上述的Kabat等定义的标准序列描述CDR和FR残基。Chothia等建议了可选择的结构定义(J.Mol.Biol.196901～917(1987)；Nature 342878～883(1989)；和J.Mol.Biol.186651～663(1989)(此后均称其为Chothia等，它们在整体上均引作参考)。当框架位置，如上述的Kabat等所定义的，组成了如上述的Kabat等所定义的结构环位置时，小鼠抗体内氨基酸被经常掺入到人源化抗体中。
B.人源化抗体的产生(1)、小鼠MAb 21.6用于产生人源化抗体的起始材料是mu MAb21.6。该抗体的分离和特性被描述于USSN 07/871,223。简言之，mu MAb21.6是对VLA-4的α-4亚基特异的，已表明它能抑制人淋巴细胞结合到用肿瘤坏死因子刺激的大鼠脑细胞的组织培养物。实施例1描述了编码mu MAb21.6抗体重链和轻链可变区的cDNA的克隆和测序并且核苷酸及氨基酸序列示于图1和图2，这些图也描述了氨基酸编码序列并进一步分成框架和互补决定区。从N末端到C末端轻链和重链均含有FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4域。将每个域的氨基酸根据上述Kabat等的编码系统分配到每个域。
(2)提供框架残基的人抗体的选择如果人可变区框架的构象与小鼠的相同或相似(CDRs来源于小鼠的可变区框架)，将小鼠的CDRs替换到人可变区框架很可能导致它们正确的空间方向的保留。这可通过获取人抗体的人可变区而实现，所述人抗体的框加序列与小鼠可变框架区(CDRs即产生于此)表现出序列的高度一致。可从相同或不同的人抗体序列产生重链和轻链的可变框架区。人抗体序列可以是天然生成的人抗体序列或者是几种人抗体的一致性序列。参见Kettleborough等，Protein Engineering 4773(1991)；Kolbinger等，Protein Engineering 6971(1993)。
将小鼠可变区的氨基酸序列与已知的人抗体序列进行计算机比较，鉴定适当的人抗体序列。对重链和轻链分别进行独立的比较，但规则是相似的。比较提示mu21.6轻链与κ1亚型的人轻链表现出极大的序列一致性，且mu21.6重链与被上述Kabat等定义为亚型1的人重链表现出极大的序列一致性。因此，轻链和重链的人框架区经常来源于这些亚型的人抗体，或来源于这些亚型的一致性序列。优选的人轻链和重链可变区，即与来自mu MAb21.6相应区表现出最大序列一致性的可变区分别来自抗体RE1和21/28’CL。
(3)计算机模拟小鼠CDR区与人可变区框架的非天然并列能导致非天然构象的限制，除非通过某些氨基酸残基置换的修正，它将导致结合亲和力的丧失。部分地通过计算机模拟决定氨基酸残基置换的选择.能产生免疫球蛋白分子三维图像的计算机硬件和软件可广泛得到。一般，从开始分析免疫球蛋白链或其域的结构来产生分子模型。比较需模型化的链的氨基酸序列与已分析过三维结构的链或区的相似性，选择表现出最大相似性的链或区作为构建分子模型的起始点。例如，对mu MAb21.6轻链来说，框架区，CDR1和CDR2区模型的起点为人轻链RE1。对CDR3来说，起点是来自于不同人抗体HyHEL-5的轻链的CDR3区。对已解决的起始结构进行修饰，使在已模拟的免疫球蛋白链或域内的氨基酸与那些起始结构内的氨基酸不同。然后将修饰过的结构装配进复合免疫球蛋白。最后，通过能量最小化和使所有的原子彼此之间均在适当的距离之内，链长和链角也均在化学可接受的限度之内对模型进一步精加工。实施例4更详细地讨论了对mu MAb21.6的可变区产生三维计算机模型的步骤，且该模型示于图5。反过来，该模型可作为预测会有被替换进入框架结构内的mu MAb21.6互补决定区的抗体的三维结构。还如其它的氨基酸置换引入讨论时，可构建代表结构的另外的模型。
(4)氨基酸残基的替代如上所指出的，本发明的人源化抗体含有主要来自人免疫球蛋白的可变框架区和主要来自称为mu MAb21.6的小鼠免疫球蛋白的互补决定区。已经确定了muMAb21.6的互补决定区和适当的人受体免疫球蛋白，需要决定的下一步，如果有的话，即确定在这些组份中需要替换的残基，以便所得的人源化抗体具有最佳的性质。一般，应使鼠源残基替代人氨基酸残基最小化，因为鼠源残基的引入将增加抗体在人体内产生HAMA应答的危险。基于它们对CDR构象和/或对抗原的结合的可能的影响来选择氨基酸的替换。通过模拟、特定位置氨基酸特性的检验、或特定氨基酸替换或突变效应的经验观察来调查上述可能的影响。
在mu MAb21.6可变框架区和相应的人可变框架区之间氨基酸不同时，如果能合理地预期此氨基酸(1)直接非共价结合抗原(例如，mu MAb 26.1 L49、L69位的氨基酸)，(2)与CDR区邻近，是上述Chathia等建议的可选择定义的CDR区的一部分，或否则与CDR区相互作用(如，在CDR区大约3之内)(如，mu MAb 21.6的L45、L58、H27、H28、H29、H30和H71位的氨基酸)，或(3)参与VL-VH介面(如，mu MAb 21.6的H44位的氨基酸)，其它的可候选的取代是受体人框架氨基酸，对人免疫球蛋白来说在该位该氨基酸是不寻常的(如，mu MAb 21.6的L104、L105和L107位的氨基酸)。这些氨基酸可被来自较典型人免疫球蛋白的相应位置的氨基酸所取代。可选择地，当它们是人免疫球蛋白等同位置的典型的氨基酸时小鼠MAb 21.6内等同位置的氨基酸可引入人框架区。
通常，需要将符合上述标准的氨基酸作全部或大部分取代。然则有时地，对特定的氨基酸是否符合上述标准存在一些双重的看法，且生产出了可选择的变异体免疫球蛋白，其中一个具有特定的取代，而另一个却没有。本发明的人源化抗体通常包含人轻链框架的取代，即用至少1、2或3，且常常为4个如，mu MAb 21.6的相应的残基在下列位置L45、L49、L59和L69进行取代，至少含有1、2、3、4或5，且有时是6个在下列位置H27、H28、H29、H30、H44和H71进行的取代。在优选的实施方案中，当人轻链受体免疫球蛋白是RE1时，轻链也包含至少1或2，且通常3个在下列位置L104、L105、和L107进行的取代。用来自具有较典型氨基酸残基的人免疫球蛋白等同位置的氨基酸对这些位置进行取代。图6和图7显示了合适的取代氨基酸。
人源化抗体内CDR区与相应的mu MAb 21.6抗体内的CDR区通常基本上一致，且更经常地一致。然而有时地，需要在CDR区进行一个残基的改变。例如，实施例5鉴别了在mu MAb 21.6 CDR3和VCAM-1配体间的氨基酸的相似性。这一结果提示，将重链CDR3区重新设计成与VCAM-1更为接近可提高人源化抗体的结合亲和力。结果，CDR3区内的一个或多个氨基酸可被VCAM-1结合区内的氨基酸所取代。虽然通常不希望进行保守氨基酸的取代，有时在不影响所得人源化免疫球蛋白结合亲和力的情况下，对CDR残基也可进行一个或多个保守氨基酸的取代。
不象上面所讨论的特定氨基酸的取代，人源化免疫球蛋白的框架区与它们从其中衍生的人抗体的框架区通常是基本一致的，更经常是一致的。当然，框架区的许多氨在酸对抗体的特异性和亲合性几乎不或不产生直接的贡献。因此，在所得的人源化免疫球蛋白的特异性和亲合性不发生可觉察的变化时，可进行框架区残基的许多单个的保守取代。然而，通常，这样的取代是不希望的。
(5)可变区的产生已经对人源化免疫球蛋白CDR和框架区进行了概念性地选择，可得到生产这样抗体的各种方法。由于存在密码的简并，许多核酸序列能编码每种免疫球蛋白氨基酸序列。可通过de novo固相DNA合成法或通过对所要获得的多聚核苷酸的早期制备的变异体进行PCR诱变在产生所要的核酸序列。寡聚核苷酸介导的诱变是优选的对靶多肽DNA进行取代、缺失和插入变异体的方法。参见Adelman等，DNA 2183(1983)。简言之，通过将编码所希望突变的寡核苷酸与单链DNA模板杂交来改变靶多肽DNA。杂交后，用DNA聚合酶合成完整的该模板的第二互补链，其中掺入了寡聚核苷酸引物，且在靶多肽DNA内编码所选择的变化。
(6)恒定区的选择将上面所述产生的可变的人源化抗体片段典型地与至少免疫球蛋白恒定区(Fc)部分连接起来，典型地与人免疫球蛋白连接起来。从各种人细胞，但优选死亡的B-细胞中按照熟知的方法分离人恒定区DNA序列(参见上述的Kabat等，和WO87/02671)(每篇文献在整体上均引作参考)。通常，抗体含有轻链和重链恒定区。重链恒定区常常包括CH1、绞链、CH2、CH3、和CH4区。
人源化抗体包括具有各种类型恒定区的抗体，包括IgM、IgG、IgA、和IgE，和任何同型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。当希望人源化抗体表现出细胞毒性时，恒定区常常是互补-固定恒定域，且其类为IgG1。当不需要这样的细胞毒性时，恒定域可以是IgG2类。人源化抗体可包含来自不只一类或同型的序列。
(7)表达系统将编码人源化轻链和重链可变区(该区选择地与恒定区连接)的核酸插入表达载体。可将重链或轻链克隆到相同或不同的表达载体上。编码免疫球蛋白链的DNA片段与表达载体的控制序列连接，以保证免疫球蛋白的表达。所述的控制序列包括信号序列、启动子、增强子、和转录终止序列。表达载体在宿主生物体内作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分典型地进行复制。常规地，表达载体含有选择标记，如四环素或新霉素以便检测用所需DNA序列转化的那些细胞(参见，如U.S.Patent 4,704,362.)。
大肠杆菌是很有用的用于克隆本发明多聚核苷酸的一种原核宿主。可用的其它合适的微生物宿主包括杆菌，如枯草杆菌，和其它肠细菌，如沙门氏菌、Serratia，和各种Pseudomonas species。在这些原核宿主内，可构建表达载体，该表达载体典型地含有与宿主细胞相容的表达控制序列(如，复制的起点)。另外，可使用任何数目的各种各样熟知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-乳糖酶启动子系统、或来自噬菌体人的启动子系统。启动子典型地控制表达，选择性地用操纵子序列，且具有核糖体结合位点序列及其它，以进行转录和翻译的起始和完成。
其它微生物，如酵母菌也可用于表达。Saccharomyces是优选的宿主，它具有适当的载体，该载体具有表达控制序列，如启动子，包括3-磷酸甘油酸激酶或其它甘油酵解酶、和复制的起点、终止序列及其它所需要的。
除了微生物外，哺乳动物组织细胞培养物也可用于表达并生产本发明的多肽(参见Winnacker，From Gene to Glones(VCH Publishers，N.Y.，N.Y.，1987)。实际上优选真核细胞，因为在本领域中许多适当的能分泌完整的免疫球蛋白的宿主细胞系已培育出来，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、Hela细胞，优选骨髓瘤细胞系，或转化的B-细胞或杂交瘤。这些细胞的表达载体包含表达控制序列，如复制起点、启动子、增强子(Queen等，Immol.Rev.8949～68(1986))，和必要的加工信号位点，如核糖体结合位点、RNA断裂位点、多聚腺苷酸化位点、和转录终止子序列。优选的表达控制序列是源于免疫球蛋白基因，SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、细胞肥大病毒及其它的启动子。
用已知的方法，根据细胞宿主的类型，将含有目标多聚核苷酸序列(如，重链和轻链编码序列和表在控制序列)的载体转入宿主细胞。例如，氯化钙转染法常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它细胞宿主。(参见Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manul(Cold Spring Harbor Press，2nd.ed.1989)(在整体引作参考)。当重链和轻链分别克隆在独自的表达载体上时，使载体共转染以表达和装配完整的免疫球蛋白。
一旦表达了可根据本领域的标准方法，包括硫酸铵沉淀、亲和层析柱、色谱层析柱、凝胶电泳及其他方法(参见Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.，1982)，对本发明的所有抗体、它们的二聚体、单个的轻链和重链或其他形式的免疫球蛋白进行纯化，在药物学上使用优选具有至少大约90％～95％一致性的基本纯的免疫球蛋白，更优选98～99％或更高一致性的免疫球蛋白。
C.人源化抗体片断在本发明的另一个实施方案中，提供了人源化抗体的片段。典型的，这些片段表现出VLA-4抗原特异结合，其亲和力为至少107M-1和更典型的108或109M-1。人源化抗体片断包括单独的重链、轻链Fab、Fab′F(ab′)2，Fabc，和Fv。通过重组DNA技术，或通过对完整免疫球蛋白的酶学或化学分离，产生片断。II.核酸通常通过核酸的表达来产生人源化抗体杂交片段。在本申请中描述的编码人源化抗体或其片段的所有的核酸均包括在本发明之内。III.计算机本发明的另一方面，提供了在监示器上显示抗体三维图像的编程计算机。例如，在UNIX操作系统下运行的使用分子模拟包QUANTA(Polygen Corp.USA)的Silicon Graphics IRIS 4D工作站Silicon是合适的。计算机有利于人源化抗体变异体的目测模型。通常，本发明的抗体已提供了满意的结合亲和性。然而，通过某些氨基酸残基进一步的变化鉴定出结合亲和力更强的抗体是可能的。三维图象也可鉴定许多非临界(noncritical)氨基酸，这些氨基酸在不影响抗体结合亲和力时，成为保守取代的对象。总之，即使是保守取代也可对免疫球蛋白的性质产生重大影响，然而，许多个别保守取代可能不严重损害免疫球蛋白的性质。IV.人源化抗体测试通过各种分析对本发明的人源化抗体进行测试。这些分析包括用来检测与具有VLA-受体的细胞结合的抗体其存在或力度的简单结合分析。也测试了抗体阻断具有VLA-4受体的细胞与表达VCAM-1配体的内皮细胞间相互作用的能力。内皮细胞可于培养基内生长和刺激，或可能是天然发生的脑组织切片的成份。参见上述的Yednock等和USSN 07/871,223。也测试了人源化抗体对防止或减少具有试验性自动免疫脑脊髓炎(EAE)的实验动物炎症的能力。用对髓鞘质碱性蛋白质特异的CD4+T-细胞注射实验动物，或通过髓鞘质碱性蛋白质对动物直接免疫来诱导EAE。髓鞘质碱性蛋白质定位于中枢神经系统，以在多样性硬化症中刺激免疫应答的方式T-细胞启动含有该蛋白质的鞘的破坏。参见Yednock等，和共申请的待审申请USSN 07/871,223。V.药物学组合物本发明提供用于预防或治疗处理的药物学组合物，其含有活性治疗试剂，即人源21.6抗体或其结合片段，和各种其它组份。优选的形式依赖于给药和治疗应用的方式。组合物也可包括，依据所希望的制剂，药物学上可接受的、无毒性的载体或稀释剂，它们被定义为通常用来形成给动物或人给药的药物组合物的载体。选择稀释剂以便使其不影响组合的生物活性，这样的稀释剂的例子有蒸馏水、生理学磷酸-缓冲盐水，Riger溶液、蔗糖溶液、和Hank溶液。另外，药物组合物或制剂也可包含其它载体，佐剂、或无毒性、作治疗、无免疫源性的稳定剂和其相似物。VI.诊断方法用人源化抗体及其结合片段来检测具VLA-4受体的细胞的存在。这种细胞在脑中的存在是诊断炎症反应并且是需要用下面讨论的方法开始治疗的信号。可通过从患者身上取下细胞样本来完成诊断。然后确定样本每个细胞表达VLA-4抗原的数量。例如通过固定化细胞的免疫组织化学染色，或通过用人源化MAb 21.6抗体或其结合片段，对细胞抽提物进行Western印迹。
诊断也可通过在活体内给药标记的人源化MAb 21.6(或结合片段)和通过活体影像检测来实现。人源化MAb 21.6的给药浓度应是以使具有靶抗原的细胞的结合与背景信号相比是可检测的。诊断试剂可用放射性同位素标记来照像成像或用顺磁同位素来磁性共振或电子自旋共振成像。
来自于个体的细胞样品内的VLA-4蛋白质水平的变化(典型的增加)，该变化在临床学建立的正常水平的范围之外，只是在个体中存在不希望的炎症反应(样品是从该个体得到的)，和/或只是该个体形成(或加剧)这样的反应。VLA-4蛋白质也可用作分化的标记已鉴定和分类某些谱系和发音起点的细胞。这样的细胞型特异的检测可用于不希望的免疫应答的组织病理学诊断。VII.治疗方法本发明也提供了用人源化MAb 21.6来阻断α4-依赖的VLA-4受体的相互反应的能力和治疗方法。VLA-4受体与VCAM-1配体的α4-依赖的相互作用对内皮细胞是许多炎症反应早期事件，特别是中枢神经系统的那些。由中枢神经系统的炎症导致的不希望的疾病和情形包括急性急病，如窒息和中枢创伤，和慢性急病，如多样性硬化症、脑膜炎和脑炎。多样性硬化症是进行性的神经学自动免疫疾病，它在美国影响了大约250000到350000的人。认为多样性硬化症是特异性自动免疫反应的结果，在该反应中，某些白细胞攻击并引起髓鞘质(覆盖神经纤维的绝缘鞘)的破坏。在多样性硬化症的动物模型中，针对α-4-β-1整合蛋白的鼠源单克隆抗体已显示对白细胞和内皮的粘附的阻断，并且因此防止中枢神经系统的发炎和随后的动物麻痹。
本发明的人源化MAb 21.6抗体比小鼠抗体有几个优越性，已在动物模型中有效地表现了出来1)人的免疫系统不应将人源化抗体的框架或恒定区识别为异源，因此抗这样注射抗体的抗体应答应比抗全部是异源的小鼠抗体或部分异源的嵌和抗体的抗体应答要少。
2)因为人源化抗体的效应器是人，它可以和人免疫系统的其他部分更好地相互作用。
3)已经报道注射的小鼠抗体在人体循环中的半衰期比正常人抗体的半衰期要短得多(Shaw et al.，J.Immunol，1384534-4538(1987))。注射的人源化抗体具有与天然生成的人抗体基本相当的半衰期，可以使给药次数较少、给药的剂量较小。
上面所讨论的药物组合物可用于预防或/和治疗处理多样性硬化症或其他炎症紊乱的给药，特别是中枢神经系统的那些。在治疗应用中对怀疑的病人或已经患有如多样性硬化病的疾病的病人给药的量应是以治愈，或至少部分消除该疾病的症状或其并发症。完成上述任务的适当剂量被定义为治疗-或药物学-有效剂量。
在预防应用中对易于，或有危险患某种病的病人给药的量应足以消除或减少该危险或推迟该疾病的发生。这样的剂量被定义为预防性有效剂量。有多样性硬化症的病人在其缓解期可通过NMR成像来估计危险，在一些情况下，通过观察病人的前期症状来估计危险。
可通过肠胃外、局部、静脉内、口服或皮下、肌肉内局部给药如通过气雾剂或经皮，为进行预防性和/或治疗性处理而给药药物组合物。根据给药的方法，药物组合物可以不同的单位剂量形式给药。例如适合于了口服给药的单位剂量形式包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊和锭剂。
本发明组合物的有效剂量在上面所述的条件下进行，将依据许多不同的因素，包括给药的方式、靶位点、患者的生理状态和所给的其他药物而异。因此，需要时处理剂量进行效价测定以获得最大的安全性和有效性。这些组合物可以以与其他治疗剂相似的方式，即以生理学可以接受的载体，对哺乳动物兽医用给药和人类的临床用给药。通常，给药剂量的范围从大约0.0001mg到100mg/kg，更经常为0.01到0.5mg/kg的宿主体重。
VIII.其他用途人源化抗体也可用于VLA-4受体的纯化。将抗体固定到固体支持物上，将分散有蛋白质的溶液通过该支持物。VLA-4结合到支持物上，从而与其它蛋白质分离开。用该方法可制得的纯化的VLA-4或其片段可用作疫苗或用作用于进一步产生抗体的免疫原。
本发明的人源化抗体也可通过，例如，用人源化抗体免疫动物来产生异型抗体。选择出异型抗体，该抗体被VLA-4或其片段抑制同人抗体的结合。因为抗异型抗体和VLA-4或其片段两者都能与人源化免疫球蛋白结合，抗异型抗体可代表表位的“内部影像”，因此可替代VLA-4受体的配体，即VCAM-1。
实施例实施例1小鼠21.6可变区的克隆和测序小鼠抗-VLA抗体21.6已在其有待审申请USSN 07/871,223中描述过。从产生小鼠21.6抗体的杂交瘤细胞中分离总RNA。用试剂盒(Pharmacia BiosystemsLimited)合成cDNA的第一条链。用设计的PCR引物，该引物设计用来与侧翼序列和编码可变区序列以外的序列杂交，因此小鼠可克隆21.6抗体可变区的整个编码区，来获得重链和轻链可变区。有义的PCR引物可与小鼠κ轻链引导序列的5′-端和小鼠重链引导序列的5′-端杂交，所述的引物是基于42个小鼠κ轻链引导序列和55个小鼠重链引导序列的数据而设计的(Jones & Bendig，Bio/Technology988～89)((1991))。(该文献在整体上引作参考)。这些引物用于连接反义PCR引物，该引物可与小鼠恒定区的3′-端杂交(κ或γ)。
在典型地含有10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、200μM dNTPs、1.5mM MgCl2，1个单位的AmpliTaq(Perkin Elmer Cetus)DNA聚合酶、1μl cDNA模板、0.25μM MKV引物和0.25μM小鼠κ轻链反义PCR引物(图1)的50μl的反应液中进行小鼠21.6VH区的PCR扩增(图2)。每个PCR反应在94℃起始融化5分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1小时、和72℃ 2分钟，循环25圈。完成最后一圈的循环后于72℃进行10分钟的最后延伸。在引物退火和延伸步骤之间的斜线时间是2.5分钟。PCR扩增后，从每个反应中取10μl的等分在溴化乙锭染色的琼脂糖胶上进行分析。
用“TA Cloning System”(Invitrogen Corporation)对PCR产物进行克隆。含有正确大小插入片段的载体用双链质粒DNA和测序酶(United States BiochemicalCorporation)进行测序。为避免在PCR扩增中引入任何错误，至少用两个独立的PCR扩增的和克隆的DNA片段进行每个可变区的测序。
将PCR产物的序列与其他小鼠轻链和重链可变区进行比较(参见表1和表2)。该比较提示来源于MKV和MKV引物的PCR产物代表可靠的小鼠21.6可变区，和来自于MHV1和MHV2引入的那些代表可靠的小鼠VH区，并且得出结论是这些产物的序列就是小鼠21.6抗体可变区的那些序列。编码小鼠21.6VL和VH区的cDNA的DNA和氨基酸系列示于图1和图2。
表1小鼠21.6轻链可变区与其它轻链可变区的比较小鼠21.6VL相似百分数一致百分数比较小鼠κVL亚组5的 84.0 72.6一致性序列2人κVL亚组1的一致84.0 69.8性序列2人κVL亚组2的一致65.1 52.8性序列2人κVL亚组3的一致72.6 57.5性序列2人KVL亚组4的一致 72.6 58.5性序列2来自人REI的序列3(人 81.0 72.4VL亚组1的成员)1用University of Wisconsin Genetics Computer Group的“GAP”程序确定的相似百分数。
2来自前面所述的Kabat等的一致性序列。
3通过Palm et al.，Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.356167-191(1975)测序的REI。
表2小鼠21.6重链可变区与其它重链可变区的比较小鼠21.6VH的比较相似百分数一致百分数小鼠VH亚组2C的一致 94.3 91.1性序列2人VH亚组1的一致性序 78.0 65.0列2人VH亚组2的一致性序 70.5 53.3列2人VH亚组3的一致性序 67.5 52.8列2来自人21/281CL的VH76.5 64.7序列3(人VH亚组1的成员)1用University of Wisconsin Genetics Computer Group的“GAP”程序确定的相似百分数。
2来自前面所述的Kabat等的一致性序列。
3通过Dersimonian et al..J.Immunol.1392496-2501(1987).
实施例2嵌合的21.6抗体的构建通过将小鼠21.6VL和VH区的与人恒定工的PCR克隆的cDNA连接起来来构建嵌合型轻链和重链。用特定设计的PCR引物对小鼠cDNA序列的5′-和3′-端进行修饰。设计与编码引导序列的开始部分的DNA杂交的5′-端PCR引物(表3)，来产生进行有效翻译的必要的DNA序列(kozak，J.Mol.Biol.196947-950(1987))，和用来产生将其克隆到表达载体内的HindIII限制性位点。设计引物的3′-端(表3)，该引物可与编码J区的DNA序列进行杂交，来产生与恒定区进行连接的必要的DNA序列，和用来产生将其克隆到表达载体内的BamHI位点。PCR扩增产物用HindIII和BamHI进行消化，将其克隆到pUC19载体，并进行测序以确定在PCR扩增过程中没有错误发生。将适宜的小鼠21.6可变区亚克隆到哺乳动物细胞表达载体内，该载体或者含有人κ或者含有γ-1恒定区(图3)。
表3构建嵌合性21.6抗体的PCR引物A.轻链可变区1.用来构建5’-端的引物(37聚体)(SEQ.ID NO18)5′C AGAAAG CTTGCC GCC ACC ATG AGA CCG TCT ATT CAG 3′HindIII Kozak M R P S I Q一致性序列2.用来构建3’-端的引物(35聚体)(SEQ.ID NO19)5′CC GAG GAT CCACTC ACG TTT GAT TTC CAG CTT GGT 3′BamHI 接合供体位点B.重链可变区1.用来构建5′-端的引物(37聚体)(SEQ.ID NO20)5′C AGAAAG CTTGCC GCC ACC ATG AAA TGC AGC TGG GTC 3′HindIII Kozak M K C S W V一致性序列2，用来构建3’-端的引物(33聚体)(SEQ.ID NO21)5′CC GAG GAT CCACTC ACC TGA GGA GAC GGT GAC T 3′BamHI 接合供体位点实施例321.6嵌合型抗体的表达和分析将编码嵌合的21.6抗体轻链和重链的两个质粒DNA共转染到Cos细胞。2或3周后，用ELISA对来自Cos细胞的介质进行分析，(1)分析人IgG-样抗体的产生和(2)分析这个人-样抗体与L细胞相结合的能力，所述的L细胞在其表面表达人α4β1整合蛋白。图4和图12显示了未纯化的和蛋白A纯化的嵌合的21.6抗体样品对人α4β1整合蛋白的结合的分析结果，该结果与纯化的小鼠21.6抗体对照做了比较。这些图表明嵌合的21.6抗体与抗原结合得很好，并确切地表明正确的小鼠21.6VL和VH区已经被克隆了。
实施例4小鼠21.6可变区结构的模拟小鼠21.6抗体的VL和VH区的分子模型被建立了。该模型是在运行UNIX操作系统，使用分子模拟包QUANTA的Silicon Graphics IRIS 4D工作站建立的(Polygen Corp.，USA)。小鼠21.6VL区的FRs的结构基于已分析过的人Bence-Jones免疫球蛋白REI的结构(Epp等，B徼144943-4952(1975)。
小鼠21.6VH区的FRs的结构基于已分析过的小鼠抗体Gloop 2的结构。保留下相同的残基，不相同的残基在QUANTA内用易化措施进行替代。小鼠21.6VL区的CDR1和CDR2被鉴定为分别属于经典(canonical)结构组1和组2.(Chothiat等，如前所述)。既然REI的CDR1和CDR2属于相同的经典组，在REI的CDR1和CDR2的结构上构建小鼠21.6VL的CDR1和CDR2模型。小鼠的21.6VL区的CDR3看来不与VL区的CDR3的任何经典结构组相对应。然而对数据库的检索提示，小鼠21.6VL区的CDR3与小鼠HyHEL-5VL区的CDR3相似(Sheriff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 840 8075-8079(1987)))。因此，小鼠21.6VL区的CDR3的模型在小鼠HyHEL-5VL区的CDR3结构上构建。小鼠21.6VH区的CDR1和CDR2被鉴定为分别属于经典结构组1和组2。小鼠21.6VH区的CDR1模型在Gloop2 VH区的CDR1上建立，Gloop2VH区与VH区的CDR1的经典组1的成员非常相似.小鼠21.6VH区的CDR2模型在小鼠HyHEL-5的CDR2上建立(Sheriff等)，小鼠HyHEL-5的CDR2也是VH区CDR2的经典2组的成员。对VH区的CDR3来说，没有经典结构。然而，小鼠21.6VH区的CDR3与小鼠R19.9VH区的CDR3相似(Lascombe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86607～611(1989))，其模型通过在这个CDR3上去掉在小鼠R19.9VH区的CDR3环顶端的额外的丝氨酸残基，并通过退火和精加工该缺口而建立。为减小不利的原子接触，并使范德华力和静电相互作用达最佳状态，用在QUANTA内实施的CHARMM潜能(Brooks等，J.Comp.Chem.4187～217(1983)使模型最后形成最后世代并使成分连接能量最小化。
小鼠21.6可变区的结构模型示于图5。该模型用于帮助精加工人源化21.6抗体可变区的设计。
实施例5改型的人21.6可变区的设计(1)框架序列的同源性人抗体的选择表现出与小鼠21.6的可变区具有很高一致性百分数的人可变区，通过氨基酸序列的比较已被鉴定出来。表4和表5将小鼠21.6可变区与所有已知的小鼠可变区，与所有已知的人可变区做了比较。小鼠21.6VL区被鉴定为属于被上述Kabat等所定义的小鼠κVL区。个别小鼠κVL区具有与小鼠21.6κVL区。具有93.4％的一致性(38C13V′CL和PC613′CL)。小鼠21.6VL区与如前面Kabat等所定义的亚组1的人κVL区最相似。个别人κVL区被鉴定出具有与小鼠21.6κVL区72.4％的一致性。来自一个最相似的人可变区，REI，的框架(FRs)被用于改型人21.6VL区的设计。小鼠21.6VH区被鉴定为属于前面Kabat等所定义的小鼠VH区亚组2c。个别小鼠重链可变区被鉴定为具有与小鼠21.6VH区93.3％的一致性(17.2.25′CL和87.92.6′CL)。小鼠21.6VH区与如前面Kabat等所定义的亚组1的人VH区最相似。个别人VH区被鉴定为与小鼠21.6VH区具有64.7％的一致性。来自一个最相似的人可变区，21/28′CL的FRs被用于改型人21.6VH区的设计。
(2)框架的内氨基酸残基的取代(a)轻链对改型人21.6VL区的设计程序的下一步就是将来自小鼠21.6VL区的CDRs同来自人REI的FRs连接起来。(如前所述，Palm等)。在第一形式的改型人21.6VL区(La)中，在人FRs中发生了几个变化(表4，图6)。
在FR4的104位，105位、和107位，来自REI的氨基酸被来自另一个人κ轻链的更典型的人J区氨基酸所取代(Riechmann等，Nature 332323～327)((1988))。
在FR2的45位，在REI内存在的正常的赖氨酸被变成在小鼠21.6VL区发现的组氨酸。认为在这个位置的氨基酸残基在支持小鼠21.6VL区的CDR2环中是重要的。
在FR2的49位，在REI内存在的正常的酪氨基被变成在小鼠21.6VL区的该位发现的组氨基。小鼠21.6VL区的该位的组氨酸在模型中被观察到位于结合位点的中部，且可能在抗体—抗原结合过程中与抗原发生直接接触。
在FR3的58位，在REI内存在的正常的缬氨酸被变成在小鼠21.6VL区的该位发现的异亮氨酸。认为该位的氨基酸残基在支持小鼠21.6VL区的CDR2环中是重要的。
在FR3的69位，在REI内存在的正常的苏氨酸被变成在小鼠21.6VL区的该位发现精氨酸。小鼠21.6VL区的该位的精氨酸在模型中被观察到定位于接近CDR1环，且可能在抗体—抗原结合过程中与抗原发生直接接触。
改型人21.6VL区的第二种形式(称为Lb)被设计成除在REI的RR2的49位不发生变化外，含有与上述相同的替代。(图6)。
(b)重链对改型人21.6VH区的设计的下一步就是将来自小鼠21.6VH区的CDRs与来自21/28′CL的FRs连接起来(Dersimonian等，J.Immunol.1392496～2501(1987))。在第一形式的改型的人21.6V区(Ha)中，在人框架区进行了5个改变(表5，图7).在人FRs内的这5个变化是在27位、28位、29位、30位和71位。
在FR1的27位、28位、29位和30位，在人21/28′CL在的氨基酸被变成在小鼠21.6VH区的这些位置发现的氨基酸。虽然这些位置被指定为位于FR1(如前面所述，Kabat等)，26位至30位是结构环部分，形成了VH区的CDR1环。因此，这些位置的氨基酸可能直接参与了与抗原的结合。实际上，37至30位的氨基酸是如上述Chothia等所定义的VH区的CDR1的经典结构部分。
在FR3的71位，存于在人21/28′CL内的精氨酸被变成在小鼠21.6VH区的该位发现的丙氨酸。71位是如上述Chathia等所定义的VH区CDR2的经典结构部分。在小鼠21.6可变区的模型中，看来71位的丙氨酸是支持VH区CDR2环的重要位置。在该位的精氨酸替换成丙氨酸很可能破坏CDR2环的安置。
含有上面所述的Ha形的5个变化的改型的人21.6VH区的第二种形式(Hb)，在FR2中还增加了一个另外的变化。
在FR2的44位，在人21/28′CL内存在的精氨酸被变成在小鼠21.6VH区的该位发现的甘氨酸。基于已公开的VL-VL区的折叠(Packing)信息和基于小鼠21.6可变区模型，认为在44位的氨基酸残基在VL-VL的折叠中是很重要的(如上所述，Chothia等)。(图5)。
将改型人21.6V.区的HC形设计成使CDR3看起来与人VCAM-1更相似。小鼠21.6抗体和人VCAM-1均能与α4β1整合蛋白质结合。抗体的VH区的CDR3环是6个CDR环中最具多样性的，且一般来讲是抗体—抗原相互作用中抗体的最重要的成份(Chothia等，如前所述；Hoogenboom & Winter，J.Mol.Biol.227381～388(1992)；Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894457～4461(1992))。在小鼠21.6VH区的CDR3和人VCAM-1的86～94位氨基酸之间，特别是在CDR3环内的YGN(酪氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列和VCAM-1内的FGN(苯丙氨酸—甘氨酸—天冬氨酸)序列之间进行了一些序列相似性的鉴定。认为这些序列与在各种细胞粘附事件中的重要的RGD(精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸)序列有关(Main等，Cell71671～678(1992))。因此，在CDR3的98位，在小鼠21.6VH区存在的酪氨酸被变成在人VCAM-1的序列中发现的苯丙氨酸。
也考虑了在FR2的36位的可能的取代。在小鼠的21.6VH链中，在FR2的36位含有不常见的半胱氨酸残基。在有关的小鼠和人序列中，FR2中该位置通常是色氨酸。虽然半胱氨酸残基在抗体的构象中经常是重要的，小鼠的21.6可变区模型并未提示该半胱氨酸残基直接或间接地参与了抗原的结合，因此，存在于人21/28′CL VH区的RF2内的色氨酸在三种形式的人源化21.6抗体中被保留下来而未做取代。
实施例6改型人21.6抗体的构建改型人21.6VL区的第一形式(resh 21.6V La)基本上是按Daugherty等在NucleicAcids Res.192471～2476(1991)所述的以重叠PCR片段来构建的。(参见图8)。将按实施例2改造的并插入pUC19中的小鼠21.6VL区用作模板。合成了4对引物，APCR1-v1a1，v1a2-v1a3，v1a4-v1a5和v1a6-v1a7。(表6和图8)。邻接对的引物至少重叠21个碱基。APCR1引物与pUC19载体互补。在含有10mMTris-Hcl(pH8.3)，50mM Kcl，200μM dNTPs和1.5mM MgCl2的50μl的PCR缓冲液中，将适当的引物对(0.2μM)与10ng的模板DNA、1单位的AmpliTaqDNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)混合。每个反应进行25次循环。在94℃起始融化后5分钟后，在94℃1分钟，55℃1分钟，和72℃2分钟，且最后在72℃进一步温育10分钟。在引物退火和延伸步骤之间的斜线时间为2.5分钟。用苯酚抽提和乙醇沉淀从第一轮中的四个反应(A、B、C和D)所得的产物。
表6为构建改型人21.6可变区的PCR引物A.轻链可变区1.合成“a”形的引物21.6VLa1(39聚体)(SEQ.ID NO22)5′GAT GGT GAC TCT ATC TCC TAC AGA TGC AGA CAG TGA GGA 3′21.6 VLa2(32聚体)(SEQ.ID NO23)5′CTG TAG GAG ATA GAG TCA CCA TCA CTT GCA AG 3′21.6VLa3(39聚体)(SEQ.ID NO24)5′AGG AGC TTT TCC AGG TGT CTG TTG GTA CCA AGC CAT ATA 3′21.6VLa4(41聚体)(SEQ.ID NO25)5′ACC AAC AGA CAC CTG GAA AAG CTC CTA GGC TGC TCA TAC AT3′
21.6VLa5(40聚体)(SEQ.ID NO26)5′GCA GGC TGC TGA TGG TGA AAG TAT AAT CTC TCC CAG ACC C 3′21.6VLa6(42聚体)(SEQ.ID NO27)5′ACT TTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT ATT GCA ACT3′21.6VLa7(59聚体)(SEQ.ID NO28)5′CCG AGG ATC CAC TCA CGT TTG ATT TCC ACC TTG GTG CCT TGACCG AAC GTC CAC AGA TT 3’2.合成“b”形的引物21.6VLb1(33聚体(SEQ.ID NO29))(将H-49变成Y-495′GGA AAA GCT CCT AGG CTG CTC ATA TAT TAC ACA 3′21.6VLb2(38聚体)(SEQ.ID NO30)ACC-101变成ACA-101来破坏StyI位点5′CCG AGG ATC CAC TCA CGT TTG ATT TCC ACC TTT GTG CC 3′B.重链可变区1.合成“a”形的引物21.6VHal(51聚体)(SEQ.ID NO31)5′AAC CCA GTG TAT ATA GGT GTC TTT AAT GTT GAA ACC GCT AGCTTT ACA GCT21.6VHa2(67聚体)(SEQ.ID NO32)5′AAA GAC ACC TAT ATA CAC TGG GTT AGA CAG GCC CCT GGC CAAAGG CTG GAG TGG ATG GGA AGG ATT G 3′21.6VHa3(26聚体)(SEQ.ID NO33)5′GAC CCG GCC CTG GAA CTT CGG GTC AT 3′21.6VHa4(66聚体)(SEQ.ID NO34)5′GAC CCG AAG TTC CAG GGC CGG GTC ACC ATC ACC GCA GAC ACCTCT GCC AGC ACC GCC TAC ATG GAA 3′
21.6VHa5(64聚体)(SEQ.ID NO35)5′CCA TAG CAT AGA CCC CGT AGT TAC CAT AAT ATC CCT CTC TGGCGC AGT AGT AGA CTG CAG TGT C 3′21.6Vha6(63聚体)(SEQ.ID NO36)5′GGT AAC TAC GGG GTC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGAACC CTT GTC ACC GTC TCC TCA 3′2.合成“b”形的引物21.6VH了(37聚体)(SEQ.ID NO37)从R-44变成G-445’CCA GGG CCG GGT CAC CAT CAC CAG AGA CAC CTC TGC C 3’3.合成“c”形的引物21.6VHc(27聚体)(SEQ.ID NO38)从Y98变成F-985′CAG GCC CCT GGC CAA GGG CTG GAG TGG 3′C.轻链和重链可变区与pUC19载体DNA的侧翼杂交的引物APCR1(17聚体(SEQ.ID NO39)，有意引物)5′TAC GCA AAC CGC CTC TC 3′APCR4(18聚体(SEQ.ID NO40)，反义引物)5′GAG TGC ACC ATA TGC GGT 3′在PCR反应的第二轮将PCR产物A和B、C和D连接起来。将PCR产物A和B、C和D(每种50ng)加入50μl PCR反应液中(如上所述)，除了将退火温度升至60℃外，按上面所描述的进行20圈的扩增。这些反应的产物称之为E和F。所用的PCR引物对分别为APCR1-v1a3和v1a4-v1a7。用苯酚抽提和乙醇沉淀PCR产物E和F，通过其自身的互补性在两步—PCR反应中使之在第三轮PCR反应中装配，两步—PCR反应用APCR1和v1a7作终止引物。完全装配的片段代表包括引导序列的完整的改型人21.6VL区，用HindIII和BamHI消化之，并将其克隆到pUC19中以便测序。具有正确序列的克隆被指定为resh21.6Vla。
通过Kamman等在Nu cl.Acids.Res.175404(1989)的方法，对第一形式的改型人21.6VL区(La)进行较小的修饰，用PCR引物来构建改型人21.6VL区的第二形式(Lb)。
合成了两套引物(表6)。每个PCR反应基本上是在上面所述的同样的条件下进行的。在第一PCR反应中，用诱变引物21.6VLb2来破坏StyI位点(苏氨酸—ACC—97变成苏氨酸—ACA—97)，以产生resh21.6VLa2。然后，在第二PCR反应中，诱变引物21.6VLb1(组氨酸-49变成酪氨酸-49)和PUC-resh21.6Vla2一起用作模板DNA。用StyI和BamHI切PCR产物，并将之亚克隆到PUC-resh21.6 VLa2中，用同样的限制性酶裂解之。具有正确序列的克隆被指定为pUC-resh21.6VLb。
用所述的构建“a”形改型人21.6VL区的同样的PCR方法，来构建“a”形改型人21.6VH区。(表6和图9)。将编码“g”形改型人425VH区(如前所述，Kettleborough等)和“b”形改型人AUK12-20 VH区的Hind III-BamHI DNA片段亚克隆到pUC19载体中，分别产生出pUC—resh425g和pUC—reshAUK12-20b。(AUK12-20的“b”形衍生于如Kettleborough等所描述的片段VHa 425的诱变，且编码氨基酸序列(SEQ.ID NO41)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFT SYYIH WVRQAPGQGLEWVGYIDPFNGGTSYNQKFKG KVTMTVDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR GGN-RFAY WGQGTLVTVSS(空白间隔区将FR和CDR区分开)。
pUC-resh425g和pUC-reshAUK12-20b质粒，及含有修饰后用于构建嵌合型21.6重链的小鼠21.6VH区的pUC载体(pUC-chim 21.6VH)，在以后的PCR反应中用作模板DNA。设计和合成了用于“a”形改型人21.6VH区的PCR引物(表6)。用pUC-reshAUK12-20b作DNA模板和APCR1-val1作为引物对来获得PCR产物A(图9)。用pUC-chim 21.6VH做DNA模板，用vha2-vha3和vha6-APCR4分别作PCR引物对，得到了PCR产物B和D。最后，用pUC-resh425g作DNA模板和vLa4-vLa5作PCR引物对，得到了PCR产物C。将最终的PCR产物的HimdIII-BamHI片段亚克隆到pUC19中从便测序。具有正确DNA序列的克隆被指定为pUC-resh21.6VHa。第一形式的改型21.6可变区的DNA和氨基酸序列示于图10。
用上面描述的构建“b”形改型人21.6VL区的基本相同的方法构建剩下的其它形式的改型人21.6VH区。合成了两套引物(表6)。对第二形(Hb)和第三形(Hc)来说，在PCR反应中分别使用诱变引物21.6VHb(精氨酸—44变成甘氨酸—44)和21.6VHc(酪氨酸—98变成苯丙氨酸—98)，而同时用pUC-resh21.6VHa作模板DNA。用限制酶切PCR产物，并分别将其MscI-BamHI和PstI-BamHI片段亚克隆到pUC载体pUC-21.6VHa中，来产生pUC-resh21.6VHb和pUC-resh21.6VHc。
用与用来构建第一形式的改型人21.6VL区(La)相似的方法来构建第一形式的改型人21.6VH区(Ha)。然而，在这种情况下，PCR引物与三种不同的模板DNA一起使用；三种模板是已被改造成的表达嵌合的21.6重链的小鼠21.6VH区、“g”形的人源化425VH区(如前所述，Kettleborough等)和“b”形的人源化AUK12-20VH区(表6，图9)。第一形式的人源化21.6重链可变区的DNA和氨基酸序列被示于图11。对第一形式的人源化21.6VH区(Ha)用PCR引物做较少的修饰，可构建第二和第三形的人源化21.6VH区(Hb和Hc)。
实施例7人源化抗体的表达和分析1.在表达载体内可变区与恒定区的连接将编码嵌合的和改型的21.6VL和VH区的DNA片段亚克隆到HCMV载体中，该载体是设计用来在哺乳动物细胞中表达人κ轻链或人ν-1重链的(参见图3)(Maeda等，Hum.Antibod.Hybridomas.2124～134(1991)。两个载体均含有人细胞肥大病毒(HCMV)启动子和使免疫球蛋白轻链和重链高水平转录的增强子。轻链表达载体就是Maeda等所描述的载体，该载体含有编码人κ恒定区的基因组DNA(Rabbitts等，Curr.Top.Microbiol.Immuno.113166-171(1984)。除由cDNA代替了编码人γ-1恒定区的基因组DNA外，重链表达载体基本上与Maeda等描述的相同，通过PCR从分泌人γ-1抗体的人细胞系中克隆了编码人γ-1恒定区的cDNA。为方便将其亚克隆到表达载体中，在cDNA的每一端均产生了BamHI位点。另外，在cDNA序列的5′-端产生了接合受体位点和65bp的内含子序列。含有人γ-1cDNA接合受体位点和内含子序列的BamHI片段(1176bp)取代现存的重链载体(如前所述，Maeda等)内的BamHI片段(大约2.0kb)。然后用Klenow聚合酶除去在人γ-1恒定区3′一端的BamHI位点。
2.表达载体的转染用Gene Pulsar仪(BioRad)通过电穿孔法将表达载体导入Cos细胞。将DNA(每个载体10μg)加入0.8ml含1×177细胞/ml的PBS中。给以1900伏，25μF电容的脉冲。恢复期10分钟后于环境温度下，将电穿孔的细胞加入8ml含5％热灭活的无球蛋白的胎牛血清的DMEM(GIBCO)中。经72小时温育后，收集培养基，离心以除去细胞残片，于4℃在灭菌条件下短期贮存，或在-20℃长期保存。
3.人源化抗体的纯化将来自转染的Cos细胞的上清液部分集合起来，用固相蛋白A纯化(ImmunoPure IgG Purification Kit，Pierce)。将上清液通过0.22μm的滤膜而将其灭菌。与等体积的ImmunoPure Ig G结合缓冲液(pH8.0)混合后，将稀释的样品上样到1ml的蛋白A柱上，并使其完全流入凝胶。在用15ml的ImmunoPure IgG结合缓冲液洗涤后，用5ml的ImmunoPure IgG洗脱缓冲液(pH2.8)洗脱结合的抗体，收集1ml的级分。第1和第2级分的pH值大约为8.0。通过加入100μl的ImmunoPure结合缓冲液，将第3级分的pH调至生理pH。含有蛋白A纯化的抗体的第5级分用ELISA分析，来确定在每个级分中所含有人IgG抗体的量。用碱性磷酸结合的羊抗—人IgG(全分子，Sigma)来检测抗体。
4.结合亲和性的测量改型的人21.6抗体与α4β1整合蛋白的结合用ELISA进行了分析，并与小鼠的和嵌合的抗体做了比较。简言之，将转化的在其细胞表面表达α4β1整合蛋白的L细胞于96-孔组织培养板中埔板，并使其长至汇合。被测样品(或者是未提纯的上清液或者是蛋白A纯化的)做连续稀释后，加到每个孔中。在冰上保温1小时和轻轻洗涤后，加羊抗鼠或羊抗人(γ-链特异的)过氧化酶接合抗体(Sigma)。在冰上保温另外1小时和轻轻洗涤后，加入底物(邻苯二胺二氢氯化物，Sigma)。在室温下温育30分钟后，加1 M H2SO4，终止反应，并于A490进行测量。
结合Ha形的改型的人21.6重链，对两种形式的改型的人21.6轻链(La和Lb)的未提纯的上清液的分析结果，提示La形的改型的人21.6VL区与抗原的亲和性比Lb形的要稍好些。因此，La形被用于以后的试验。结合La形的改型的人21.6轻链，对人源化21.6重链(Ha和Hb)的未提纯的上清液的分析结果表明在改型的人VH区的两种形式(Ha和Hb)之间没有显著差异。因为在人FRs中Ha形只含有5个改变，选择Ha形用于以后的进一步试验。
图12比较了人源化21.6抗体(La+Ha)的结合和嵌合的21.6抗体的结合。数据表明改型的人21.6抗体(La+Ha)对抗原的结合与嵌合的21.6抗体对抗原的结合一样好，并且可能还稍好一些。因为嵌合的21.6抗体含有完整的小鼠21.6的可变区，预期在对抗的结合特征方面嵌合之21.6抗体相当。改型的人21.6抗体(La+Ha)也表现出阻断人α4β1整合蛋白质的结合，其效力可以与原始的小鼠21.6抗体和嵌合的抗体的效力相比。因此，可以得出结论，改型的人21.6抗体(La+Ha)具有与小鼠21.6抗体基本相当的特异的结合亲和力。而且，因为只需在人FRs做较小的修饰就能在人可变区内再生成小鼠21.6抗体的抗原结合位点，因此预期改型的人21.6抗体可成为可靠的人抗体。
对含有La形的改型的人21.6VL区和Hc形的改型的人VH区的改型人21.6抗体也进行了测试，测试了其与在细胞表面表达人α4β1整合蛋白的L细胞的结合，并与嵌合的抗体进行了比较。结果提示改型的人21.6抗体(La+Ha)可与抗原很好地结合。VH区的CDR3内的变化不损害与抗原的结合。实际上，有一些迹象表明CDR3内的变化稍稍促进与抗原的结合(图12)。可以想象地，该促进在功能性阻断分析中可能会更明显。
实施例8Mu 21.6抗体的阻断性质将Mu 21.6与另一个抗α4整合蛋白称作L25的抗体进行了比较。L25可从BectonDickinson商购得到，在文献中已经报道它是α4β1整合蛋白粘附性功能的好的抑制剂。如图13A所示，在无Mn2+存在时，Mu 21.6和L25两者都能完全抑制单核细胞与纯化的VCAM-1的α4β1整合蛋白—依赖的粘附。然而，在Mn2+(1mM)(α4β1的几个活化子中的一个)，L25就不再是有效的抑制剂了。当α4β1整合蛋白用其它刺激物活化时，也会观察到类似的结果。阻断活化的α4β1整合蛋白的能力在治疗炎症疾病如多样性硬化症时，可能是有价值的。
作为mu 21.6和L25的进一步的比较，对抑制人T细胞与增加量的VCAM-1的粘附的抗体能力进行了测定。在这样试验中，用增加量的VCAM-1包被96-孔测试板的料孔，测量了人T细胞系，Jurkat(它表达高水平的α4β1整合蛋白)与包被孔的结合能力。Y-轴的值代表在四次洗涤后仍然结合的占最初加入每孔的Jurkat细胞的百分数(图13B)。这个试验证明，在遇到低水平的VCAM-1时，L25是细胞粘附的好的抑制剂，但在VCAM-1的水平较高时则变得完全失去作用。另一方面，无论VCAM-1存在的量的多寡，Mu 21.6均能完全抑制细胞粘附。由于VCAM-1在炎症位置的上调控(upregulation)，高浓度的VCAM-1的阻断能力在治疗应用中是很希望的。
实施例9人源化21.6抗体在动物模型中的效能本实施例建立人源化21.6抗体在刺激多样性硬化症的动物模型中，预防和治疗EAE的效能。
(a)方法(1)EAE的诱导分别从5只用CO2窒息处死的豚鼠中取出脑和脊髓。将该组织于PBS中在湿冰上保存，直至将其称重和均化成浓度为每毫升PBS中含1克组织。用电子手控匀浆器将该组织完全均化，并随后将其与等体积的Freund’s完全佐剂(FCA)相混合。通过将100mg的分枝结核杆菌H37 RA(DIFCO，3114-33-8)加入10ml的Freund’s不完全佐剂而制得FCA(Sigma，F-5506)。通过使溶液在由两向开关连接的两个注射器之间经过，使混合物乳化成蛋黄酱样(mayonaise)的稠度。每只鼠用600μl的乳浊液免疫，分别在3个位点给药。
(2)计录有疾病症状的动物通过促使动物行走，且按照下述通常接受的标准给动物打分来估计疾病症状0无病1后肢无力2、后肢完全麻痹3、后肢完全麻痹和一些前麻痹4、涉死的或死亡(3)血清和组织的收集通过心脏穿刺从甲氧基荧烷—麻醉的豚鼠中取样。收集大约300～400μl的血液，将其置于微量血清分离器中并使之在室温下凝集20～30分钟。将试管在室温下离心5分钟。将血清移入正appendorf管，并将其于-20℃贮存以便以后的荧光活化的细胞分类(sorting)法(FACS)的抗体效价的分析。
为进行血液学分析，将血液收集到乙二胺四乙酸包被的微量管中。将100μl等份吸入吖啶包被的血细胞比容管中。盖上管盖，通过轻轻倒置试管15次使血液与吖啶橙混合。将浮器放入血细胞比容管中，并将样品离心5分钟。将血细胞比容管置于预先校准的Idexx QBC Vet Autoreader中，该仪器是设计用来进行定量buffey包被分析的。在马校准系统中读取数值，并用预先确定的转换系数将其调整到豚鼠相应值。
在试验的最后，用CO2窒息法将豚鼠杀死，并将其脑和脊髓取出。每只豚鼠一半的脑和脊髓在2-甲基—丁烷中在于冰上(-20℃至-40℃)上快速冷冻。切割组织，用亲和素—生物素连接的过氧化物酶分析法(Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA)和二氨基联苯胺作生色剂，并以巨噬细胞标记(Serotec MCA-518)和T-淋巴细胞标记(Serotec MCA-751)对其进行免疫染色。按照下列计分系统对组织的细胞浸润计分0 没有浸润细胞。
0.5很少染色；可能是人工假象；通常与脉管有关。
1通常在血管附近的少数细胞染色(少于15个)2许多细胞染色(20～50)，通常自脉管放射出。
3许多细胞染色(＞50)，散布在组织中；许多折褶的脉管。
(b)预防性治疗该试验是设计用来评估人源化抗体延迟临床症状的发作的效能。以前的数据表明白细胞典型地在第7和第8天之间开始流入EAE豚鼠的脑和脊髓。因此，在免疫后7天和10天进行抗体给药。为比较小鼠和人源化21.6抗体，给药相应剂量的每种抗体(3.0、0.30和0.03mg/kg)。初步的药物动力学研究表明小鼠21.6抗体在皮下给药后24小时就能达到饱和的血液水平，并直到48小时时还保持很高水平。
在第11天，即第二次的抗体给药后24小时，从每组中随机选取3只动物抽取血样。计算每个处理组中每只豚鼠达到临床得分为1时的天数的平均数(表7)。在此试验中，PBS—处理组的平均值为免疫后11天(该值是以前的典型的结果)。用高剂量的人源化和小鼠抗体所作的处理，其结果是疾病分别显著延迟了4.6天(p＝0.000)和3(p＝0.007)天。抗体的较低剂量对疾病的病程没有影响。
表7小鼠或人源化21.6抗体对在免疫后达到临床分数为1的时间的影响
@H表示人源化抗体；#表示小鼠。
**p＝0.000和*p＝0.007，与PBS相比。
豚鼠的每日的体重反映出高剂量的人源化和小鼠抗体的类似的效果(图14)。这些治疗组中的动物的体重逐渐增加。其它所有处理组中的豚鼠恰在疾病发作之前的日子即开始损失体重。
在第11天，即第二次处理后大约24小时后，通过心脏穿刺对从每个组中随机选取的三只动物的抗体进行了效价测定。抗体延迟疾病的效能与血清水平密切相关。在所有的用高剂量的人源化和小鼠抗体注射的动物中，在循环血中存在大约20μg/ml的血清抗体。这一浓度与在活体外饱和VLA-4位点所需的21.6抗体的浓度的数量级相当。作为对照所有其它组中的动物几乎不具有或不具有可检测的血清抗体。
(C)发生中的疾病的逆转免疫了大约60只豚鼠并使之发展到EAE的监床症状。在第13天，将所有的获得临床得分为1的豚鼠随机分成治疗组。图15表明用3mg/kg人源化抗体处理的动物，在处理48小时之内就开始恢复后肢的功能。在第17和第18天，即给以第二剂量后的1和2天后，所有的8只动物都没病了。在每个治疗组曲线值下的面积和ANOVA表明只有3mg/kg人源化抗体的处理组的值令人满意地比PBS对照组的要低(p＝0.042)。在第一次给药后24小时直至在第19天终止试验时，这些动物逐渐增加体重(图16)。
用FACS分析法对在第一次注射后24小时(第14天)和处死时(第19天)所取的样品进行了抗体血清效价的测量。结果是用小鼠21.6抗体处理的血清抗体效价要比用人源化21.6抗体处理的血清抗体效价稍低(9.1比12.6μg/ml)。这种差异在第19天，即第二次给药后3天变得更加明显，此时，几乎没有可检测的血清小鼠抗体；而在第19天虽然人源化抗体的水平降低到了饱和水平以下，但仍是可测量的(6.1μg/ml)。这些数据证明在抗体血浆水平和生理学效能之间存在相关，并且提示豚鼠的有效的循环抗体的水平的范围是10～20μg/ml。
用第19天处死的动物的组织对白细胞渗入脑和脊髓进行估测。表8表明在作为抗体治疗功能的浸润程度存在显著差异。用3mg/kg处理后，T细胞浸润脑和脊髓和巨噬细胞浸润脊髓的减少是显著的。低剂量趋向减少浸润，但没达到显著差异。巨噬细胞浸润到脊髓在任何剂量都没有显著差异。因用来进行估测的免疫组织化学技术不能将常住细胞(resident)和入侵细胞区分开，巨噬细胞的效果的缺乏可能表示常住巨噬细胞和小神经胶质细胞的持久存在。
在疾病发生后通过给药抗体使脑组织内T细胞和单核细胞减少，提示细胞堵塞并不是累积的过程，而是细胞进出CNS组织的动态的运动。更重要地，该数据表明白细胞进入薄壁组织的中断使CNS自身能摆脱侵入的病理学因素。
表8脑脊髓
NS＝无差异。
在第19天T细胞和巨噬细胞对脑和脊髓的浸润的显著差异血液学数据表明用小鼠或人源化21.6抗体进行处理，在全血白细胞计数、单核细胞和粒细胞计数或在红细胞计数方面不产生差异。与PBS处理的动物相比，高剂时的小鼠或人源化抗体导致血小板计数的显著增加(表9)。豚鼠的血小板计数为755±103细胞/ml，大约是PBS—处理的EAE动物的两倍。因此，用使疾病有效逆转的小鼠和人源化抗体的剂量处理，也可使血小板计数恢复到正常。
表9在EAE动物中抗体治疗对血小板计数的影响
++非-EAE豚鼠的血小板计数在独立的试验中测定。
*P＝0.05与PBS相比。
得出结论，人源化和小鼠21.6抗体两者均能在动物模型中延迟和逆转刺激的多样性硬化症的临床症状。在逆转症状时，人源化抗体比相同剂量的小鼠抗体更有效。
虽然为使理解清楚的目的已对本发明进行了详细描述，很明显可在所附的权利要求之内进行某些修饰。上面引用的出版物和专利文件在此同样地在整体上引作参考，就象每篇文献被分别做了说明。
表4导致改型的人21.6轻链可变区的设计的氨基酸序列的直线排列
说明(Kabat)根据如前所述的Kabat等的编号；(#)用于分子模拟的序列号；(小鼠21.6)来自小鼠21.6抗体的VL区的氨基酸序列；(小鼠κ5)来自亚组5的小鼠κVL区的一致性序列(Kabat等，如前所述)；(人κ1)来自亚组1的人VL区的一致性序列(Kabat等，如前所述)；(人REI)人VL区的氨基酸序列(Palm等(1975)，如前所述)；(RH VL21.6)改型人抗体的21.6VL区的L1形的氨基酸序列；(*)CDR环的经典结构部分的残基(Chothia等，如前所述)；(下划线的)在人FRs中氨基酸残基被改变了的残基。
表5导致改型的人21.6重链可变区的设计的氨基酸序列
说明(Kabat)根据如前所述的Kabat等的编号；(#)用于分子模拟的序列号；(小鼠21.6)来自小鼠21.6抗体的VH区的氨基酸序列；(小鼠2c)来自亚组2c的小鼠VH区的一致性序列(Kabat等，如前所述)；(人1)来自亚组1的人VH区的一致性序列(Kabat等，如前所述)；(人21/28′CL)人VH区的氨基酸序列(Dersimonian等(1987)，如前所述)；(RHVH21.6)改型的人21.6VH区H1形的氨基酸序列；(*)CDR环的经典结构部分的残基(Chothia等，如前所述)；(下划线的)人的FRs中氨基酸残基被改变了的残基。
序列表(1)一般信息(i)申请人玛丽·M·本迪希奥立费尔·J·列格尔琼斯·萨尔德拿泰伦·S·琼斯(ii)发明名称抗白细胞粘附分子VLA-4的人源化抗体(iii)序列数45(iv)通讯地址(A)收件人汤森和汤森 库瑞和克鲁(B)街 道One Market Plaza，Steuart Tower，Suite 2000(C)城 市旧金山(D)州加利福尼亚(E)国家美国(F)邮 编94105(v)计算机可读形式(A)媒体形式Flooppy disk(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)目前申请数据(A)申请序号US 08/186,269(B)申请号1994年1月25日(C)分类(viii)代理人信息(A)姓 名威兼·L·史密斯(B)登记号30,223(C)案卷/卷宗号15270-14(ix)通信信息(A)电话415-543-9600(B)电传415-543-5043(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度483个碱基对(B)类型核酸(C)链型双(D)拓扑线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位点53…430(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGAGGGCCC CTGCTCAGAT TTTTGGATTC TTGGTCAGGA GACGTTGTAG AA ATG 55Met1AGA CCG TCT ATT CAG TTC CTG GGG CTC TTG TTG TTC TGG CTT CAT GGT 103Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His Gly5 10 15GCT CAG TGT GAC ATC CAG ATG ACA CAG TCT CCA TCC TCA CTG TCT GCA 151Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala20 25 30TCT CTG GGA GGC AAA GTC ACC ATC ACT TGC AAG ACA AGC CAA GAC ATT199Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr 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NO28的信息(i)序列特征(A)长度59对碱基(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑线性(ii)分子类型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO28CCGAGGATCC ACTCACGTTT GATTTCCACC TTGGTGCCTT GACCGAACGT CCACAGATT 59(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)长度33对碱基(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑线性(ii)分子类型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO29GGAAAAGCTC CTAGGCT GCT CATATATTAC ACA 33(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)长度38对碱基(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑线性(ii)分子类型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO30CCGAGGATCC ACTCACGTTT GATTTCCACC TTTGTGCC 38(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)长度51对碱基(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑线性(ii)分子类型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO31AACCCAGTGT ATATAGGTGT CTTTAATGTT GAAACCGCTA GCTTTACAGC T 51(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)长度67对碱基(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑线性(ii)分子类型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO32AAAGACACCT ATATACACTG GGTTAGACAG GCCCCTGGCC AAAGGCTGGA GTGGATGGGA 60AGGATTG 67(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)长度26对碱基(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑线性(ii)分子类型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO33GACCCGGCCC TGGAACTTCG GGTCAT 26(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)长度66对碱基(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑线性(ii)分子类型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO34GACCCGAAGT TCCAGGGCAG GGTCACCATC ACCGCAGACA CCTCTGCCAG CACCGCCTAC 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Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20 25 30Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Gly Tyr Ile Asp Pro Phe Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Gly Asn Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser115(2)SEQ ID NO42的信息(i)序列特征(A)长度109个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO42Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Sar Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Asp Ile Ser Asn20 25 30Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ser Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Tyr Ala Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu65 70 75 80Gln Glu Asp Ile Ala Thr Phe Cys GIn Gln Gly Asn Thr Leu Pro85 90 95Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105(2)SEQ ID NO43的信息(i)序列特征(A)长度114个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO43Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ser Leu Val Xaa20 25 30Xaa Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys35 40 45Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln85 90 95Tyr Asn Ser Leu Pro Glu Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu100 105 110Ile Lys(2)SEQ ID NO44的信息(i)序列特征(A)长度125个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO44Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Xaa Val Gly Tyr Tyr Ala Met100 105 110Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser115 120 125(2)SEQ ID NO45的信息(i)序列特征(A)长度129个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO45Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Gly Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys50 55 60Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala65 70 75 80Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95Cys Ala Arg Ala Pro Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Cys Tyr Arg Gly Asp100 105 110Tyr Xaa Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120 12权利要求
1.含有人源化重链和人源化轻链的人源化免疫球蛋白(1)人源化轻链包含三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)和可变区框架，所述的互补决定区具有相应于小鼠21-6免疫球蛋白轻链的互补决定区的氨基酸序列，所述的可变区框架来自除了选自由L45、L49、L58和L69组成的第一组中的至少一个位置外的人κ轻链可变区框架序列，其中例外的氨基酸位置由与小鼠21-6免疫球蛋白轻链可变区框架的等同位置相同的氨基酸所占据；和(2)人源化重链包含三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)和可变框架区，所述的互补决定区具有相应于小鼠21-6免疫球蛋白重链的互补决定区的氨基酸序列，所述的可变区框架来自除选自由H27、H28、H29、H30、H44、H71组成的组中的至少一个位置外的人重链可变区框架序列，其中例外的氨基酸位置由与小鼠21-6免疫球蛋白重链可变区框架的等同位置相同的氨基酸所占据；其中免疫球蛋白与VLA-4配体特异性地结合，具有下限为大约107M-1和上限为大约5倍于小鼠21-6免疫球蛋白结合亲和力的结合亲和力。
2.权利要求1的人源化抗体，其中人源化轻链可变区框架来自除了选自第一组中的至少一个位置和选自由L104、L105和L07位所组成的第三组中的至少一个位置外的RE1可变区框架序列，例外的氨基酸位置由与来自人免疫球蛋白的而不是RE1κ轻链的等同位置相同的氨基酸所占据。
3.权利要求2的人源化免疫球蛋白，其中人源化重链可变区框架来自21/28′CL可变区框架序列。
4.权利要求3的人源化免疫球蛋白，其中人源化轻链可变区框架含有至少3个来自小鼠21.6免疫球蛋白第一组位置的氨基酸和3个来自人免疫球蛋白而不是REI的κ轻链的第三组位置的氨基酸，并且人源化重链可变区框架含有至少5个来自小鼠21.6免疫球蛋白在第二组位置的氨基酸。
5.权利要求4的人源化抗体，其中除了来自第一组的至少3个位置和来自第三组的3个位置外，人源化轻链可变区框架与RE1轻链可变区框架序列是相同的；且除了来自第二组的至少5个位置外，重链可变区框架与21/28′CL重链可变区框架序列是相同的。
6.权利要求5的人源化免疫球蛋白，其中来自第一组的至少3个位置是L45位、L58位和L69位，来自第二组的至少5个位置是H27位、H28位、H29位、H30位和H71位。
7.权利要求6的人源化免疫球蛋白，其中除了在人源化重链的CDR3区可含或不含第98位的苯丙氨酸外，人源化轻链含有与小鼠21-6重链的相应的互补决定区相同的互补决定区，且人源化重链含有与小鼠21-6重链的相应的互补决定区相同的互补决定区。
8.权利要求7的免疫球蛋白，其中人源化重链含有在98位的苯丙氨酸残基。
9.权利要求1的人源化免疫球蛋白，其中成熟的轻链可变区的氨基酸序列是在图6中指定为La的序列(SEQ.ID NO7)。
10.权利要求1的人源化免疫球蛋白，其中成熟的轻链可变区的氨基酸序列是在图6中指定为Lb的序列(SEQ.ID NO8)。
11.权利要求1的人源化免疫球蛋白，其中成熟的重链可变区的氨基酸序列是在图7中指定为Ha的序列(SEQ.ID NO11)。
12.权利要求1的人源化免疫球蛋白，其中成熟的重链可变区的氨基酸序列是图7中指定的为Hb的序列(SEQ.ID NO12)。
13.权利要求1的人源化免疫球蛋白，其中成熟的重链可变区氨基酸序列是在图7中指定为Hc的序列(SEQ.ID NO13)。
14.权利要求9的人源化免疫球蛋白，其中成熟的重链可变区的氨基酸序列是图7中指定的Ha(SEQ.ID NO11)。
15.权利要求9的人源化免疫球蛋白，其中成熟的重链可变区的氨基酸序列是图7中的Hb(SEQ.ID NO12)。
16.权利要求9的人源化免疫球蛋白，其中成熟的重链可变区的氨基酸序列是在图7中指定的Hc(SEQ.ID NO13)。
17.权利要求14或16的人源化免疫球蛋白的结合片段。
18.权利要求14或16的人源化免疫球蛋白，具有恒定区结构域。
19.权利要求18的人源化免疫球蛋白，其中恒定区结构域具有效应器功能。
20.权利要求18的人源化免疫球蛋白，其中恒定区结构域缺少效应器功能。
21.权利要求19的人源化免疫球蛋白，其中效应器功能能补充固定的或抗体依赖的细胞毒性。
22.编码权利要求1的人源化抗体重链或其结合片段的核酸序列。
23.编码权利要求1的人源化抗体轻链或其结合片段的核酸序列。
24.编程以在监视器上显示权利要求1的人源化免疫球蛋白三维图像的计算机。
25.含有权利要求14或16的人源化抗体、或其结合片段，和其药物学上可接受载体的药物组合物。
26.检测VLA-4抗原的方法，该方法包括对患者或其组织样品给药权利要求14或16的人源化免疫球蛋白或其结合片段；和检测由于抗体或片段和靶样品内存在的VLA-4的特异性结合而形成的复合体。
27.抑制白细胞粘附到内皮细胞的方法，该方法包括给药治疗有效量的权利要求25的药物组合物。
28.权利要求27的方法，其中内皮细胞是脑细胞。
29.治疗患者炎症疾病的方法，包括给患者给药治疗有效量的权利要求25的药物组合物。
30.权利要求29的方法，其中炎症疾病是多样性硬化症。
全文摘要
本发明提供了与VLA-4配体特异性结合的人源化免疫球蛋白，及用其进行治疗的方法。该方法对治疗多样性硬化症特别有用。
文档编号A61P29/00GK1140413SQ95191354
公开日1997年1月15日 申请日期1995年1月25日 优先权日1994年1月25日
发明者玛丽·M·本迪希, 奥立弗尔·J·列格尔, 琼斯·萨尔德拿, 泰伦·S·琼斯 申请人:雅典娜神经科学公司