专利名称：一个能特异与细胞间粘附分子－1结合的十五肽的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一个能特异与细胞间粘附分子1(ICAM-1)结合的十五肽分子。
本发明的能特异与细胞间粘附分子-1(ICAM-1)结合的十五肽，其编码序列及推测的氨基酸序列分别见序列表1(SEQ ID No.1)和序列表2 SEQ ID No.2)。
本发明的十五肽的获得方法是通过从噬菌体展示随机十五肽库中，运用生物淘选(biopanning)的方法，富集并扩增能与ICAM-1特异结合的噬菌体克隆，经测序后推测其氨基酸序列。具体步骤如下(1)ICAM-1特异结合肽展示克隆的淘选从噬菌体展示随机十五肽库中，运用生物淘选(biopanning)的方法，富集并扩增能与ICAM-1特异结合的噬菌体克隆；(2)ICAM-1特异结合肽噬菌体克隆的酶联免疫分析(ELISA)挑选单个噬菌体克隆，通过酶联免疫分析(ELISA)，获得ICAM-1特异结合肽噬菌体克隆；(3)测序将淘选到的ICAM-1特异结合肽噬菌体克隆测序，测序引物为M13反向引物。编码序列及推测的氨基酸序列分别见序列表1(SEQ ID No.1)和序列表2(SEQID No.2)。
经酶联免疫分析(ELISA)证明该十五肽能特异与ICAM-1结合。ICAM-1特异结合肽噬菌体克隆可以抑制单克隆抗体sc-107与ICAM-1的结合。
ICAM-1特异结合十五肽对RAW264.7细胞p38活性的影响通过western杂交证明，ICAM-1特异结合十五肽能够抑制细菌脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞p38蛋白激活。P38激酶介导着炎症的信号通路，抑制该激酶就能有效的抑制炎症信号通路，进而阻止炎症的发展。这个十五肽分子可作为抗炎和ICAM-1相关疾病的药物或药物的先导物。
本发明的优点和积极效果1.本发明发现的十五肽分子具有明确的靶分子。
2.利用生物淘选的方法获得的十五肽，通过化学合成可以具有生物学活性。
3.该十五肽可以抑制由细胞粘附分子1介导的MAPK38的活性。
1.将重组人ICAM-1包被于酶标板，加入噬菌体展示随机十五肽库孵育；2.在酸性条件下将与ICAM-1结合的噬菌体洗脱；3.洗脱的噬菌体感染宿主菌，经扩增后纯化噬菌体；4.取部分扩增的噬菌体与ICAM-1再次孵育，进行第二轮淘选。
总共进行四轮淘选。
二、ICAM-1特异结合肽噬菌体克隆的酶联免疫分析(ELISA)挑选单个噬菌体克隆，通过酶联免疫分析(ELISA)，获得ICAM-1特异结合肽噬菌体克隆。
1.最后一轮淘选出的噬菌体感染宿主菌，铺于固体培养基，得到分散良好的单克隆；2.挑取分散良好的单克隆，分别扩增提取噬菌体；3.将提取的噬菌体包被于酶标板；4.加入生物素标记的重组人ICAM-1孵育；5.加入辣根过氧化物酶标记亲和素孵育；6.加入邻苯二胺底物孵育，测A490，挑选阳性克隆。
三、测序将得到的阳性克隆用M13反向引物进行测序，所得ICAM-1特异结合十五肽编码序列及推测的氨基酸序列分别见序列表1(SEQ ID No.1)和序列表2(SEQID No.2)。
四、ICAM-1特异结合肽展示克隆对抗体作用的影响通过酶联免疫分析(ELISA)证实ICAM-1特异结合肽噬菌体克隆可以抑制单克隆抗体sc-107与ICAM-1的结合。
1.将噬菌体包被于酶标板；2.加入ICAM-1孵育；3.加入ICAM-1单克隆抗体sc-107孵育；4.加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG孵育；5.加入邻苯二胺底物孵育，测A490。
噬菌体与ICAM-1结合的A490与二者结合后再与sc-107结合的A490之差值为1.506，证明此十五肽能特异地与ICAM-1的第一结构域结合。
五、ICAM-1特异结合十五肽对RAW264.7细胞p38活性的影响细菌脂多糖(LPS)与ICAM-1特异结合十五肽同时处理RAW264.7细胞。使用抗磷酸化p38单克隆抗体，通过western杂交证明ICAM-1特异结合十五肽能够抑制细菌脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞p38蛋白激活。
序列表1(SEQ ID No.1)GGT CGG GGT GAG TTT CGT GGT AGG GAT AAT TCT GTT TGG GTG GTT序列表2(SEQ ID No.2)G R G E F R G R D N S V S V V
权利要求
1.一种十五肽，具有序列表1所述的编码序列或序列表2所述的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的十五肽分子用于抑制P38激酶的应用。
全文摘要
本发明公开了一个能特异与细胞间粘附分子－1(ICAM－1)结合的十五肽，属于生物技术领域。ICAM－1特异结合十五肽能够抑制细菌脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞p38蛋白激活。P38激酶介导着炎症的信号通路，抑制该激酶就能有效的抑制炎症信号通路，进而阻止炎症的发展。这个十五肽分子可作为抗炎和ICAM－1相关疾病的药物或药物的先导物。
文档编号A61K38/10GK1392158SQ0212554
公开日2003年1月22日 申请日期2002年7月19日 优先权日2002年7月19日
发明者顾军, 朱圣庚, 韦锦学 申请人:北京大学