专利名称：具有抗炎活性和抗动脉粥样硬化活性的藿香提取物以及含有从所述提取物中分离和提纯 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组合物，它含有藿香和通过分离提纯方法从藿香中获得的椴素(tilianin)，用于抗炎和抗动脉粥样硬化；而且更特别地涉及藿香提取物和通过分离提纯方法由其中获得的椴素，它们不仅可有效地预防和治疗炎性疾病，而且可有效地预防和治疗与炎性反应相关的动脉粥样硬化和动脉粥样硬化引起的循环系统疾病，这是因为它们在抑制一种炎性反应因子-补体系统的活性、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的表达、一氧化氮(NO)的产生方面具有良好的作用。它们还可显著地减轻炎性反应所致动脉粥样硬化的发展。
本发明的背景当组织或细胞出现损害，或者人体被外来物质(例如细菌、霉菌、病毒、各种引起变态反应的物质)引起感染时，它通常出现炎性反应，表现为一系列复杂的生理反应，诸如酶的活化、炎症介导物质的分泌、体液的渗出、细胞移动和组织损伤，它们与局部血管、体液中的所有各种炎症介导因子和免疫细胞有关，而且还表现出外在症状，诸如红斑、水肿和发热。正常情况下，炎性反应除去外来感染源，使损害组织再生，并且恢复机体功能，但是，当抗原未被除去，或者因为内在物质，炎性反应过度或连续发生时，炎性反应则变成疾病(过敏性疾病、慢性炎症)的主要病理症状，而且成为输血、药物应用和器官移植等治疗过程中的主要障碍。
涉及本发明相关的炎性反应的因素的作用描述如下。
补体系统是体液的一种主要因子，它在免疫反应的早期激活并增强炎症反应。补体系统激活过程中产生的活性蛋白(过敏毒素、C3a，C4a，C5a)和缀合蛋白质(膜攻击复合体(MAC))与各种炎性疾病(风湿性关节炎、红斑狼疮、成人呼吸窘迫综合征、阿耳茨海默氏病)相关，而且经常成为器官移植中超急性排斥反应的直接原因。
ICAM-1是内皮细胞表面上表达的细胞粘附分子组中的一种典型的蛋白质。正常情况下，它表达的水平非常低，但是当它受到诸如TNF-a、干扰素-γ和白介素-1β等的细胞因子的炎症介导分子刺激时，其表达水平快速提高，以在粘附血液中移动的诸如单核细胞或淋巴细胞的炎性细胞和将炎性细胞移动至炎性组织中发挥作用。因此，在早期当炎性细胞移动并聚集在炎性组织上时，ICAM-1的表达在炎症的增强中起重要的作用。
VCAM-1是内皮细胞表面上表达的细胞粘附分子组中的一种。当在与人动脉粥样硬化的进程相似的动物模型(载脂蛋白E缺陷鼠，ApoE-/-)中造成动脉粥样硬化损伤时，VCAM-1在血管内皮细胞中的表达快速增长。而且，VCAM-1表达的增长直接与血浆中胆固醇-低密度脂蛋白(胆固醇-LDL)的浓度相关。因此，当动脉粥样硬化损害引起时，血管内皮细胞中表达的VCAM-1粘附血液中的单核细胞和淋巴细胞，并且那些炎症细胞聚集在血管内皮细胞下，因此在动脉粥样硬化损害的发展中起重要的作用。
L-精氨酸被一氧化氮合酶(NOS)氧化后，NO与L-瓜氨酸一起产生。NO是一种介导分子，它与血管减压、血小板的粘附和凝结、神经传递、消化器官的运动有关，并通过影响血管系统与阴茎的勃起相关。而且NO防护微生物感染，不仅是通过在炎性细胞中产生，而且还通过在非炎性细胞中产生而获得。同时，在产生NO中参与的一种NOS-诱导-NOS(iNOS)不依赖钙和钙调蛋白，并通过脂多糖(LPS)和细胞因子(IFN-γ，TNF等)的刺激而表达。因为环加氧酶-2(COX-2)也是通过这种刺激激活从而产生炎性介导分子、前列腺素，所以COX-2和iNOS的表达密切相关，因此所产生的NO也影响COX-2的表达。iNOS的表达选择性地诱导巨噬细胞中NO的产生，因此诱导其它炎性反应的激活。所以，NO是炎性疾病中一种重要的因子。
动脉粥样硬化是由遗传条件引起的动脉变硬的一种疾病，这些条件与脂质代谢以及诸如饮食习惯、吸烟和缺乏锻炼等环境条件相关，而且它可导致循环系统的疾病，诸如心脏病和脑血管疾病。动脉粥样硬化早期发病的一种假说是“反应-损伤”假说，它指由于遗传改变、过氧化物、高血压、糖尿病、血浆高半胱氨酸浓度升高和微生物感染等因素，导致血管内皮细胞不能保持正常的内环境稳定，而发生机能障碍。当血管内皮细胞发生机能障碍时，细胞粘附分子的表达增高，细胞传递增强，然后免疫细胞、血小板和脂肪的粘附以及向组织的传递开始增强。炎性反应，诸如炎症介导因子和免疫细胞的生长因子的分泌导致动脉粥样硬化损害的发生。在这里，由于氧化作用、糖类结合、蓄积和糖蛋白结合等因素，导致血液中低密度脂蛋白(LDL)变成修饰LDL(MLDL)，它引起血管内皮细胞和平滑肌的刺激和破坏。因此，当内皮细胞上VCAM-1的表达和炎症细胞的炎症介导因子的释放升高时，LDL溢出并蓄积至内皮细胞下，蓄积的LDL和氧化的MLDL重复诱导诸如巨噬细胞、T-淋巴细胞等免疫细胞流入和激活的过程，结果损害处的炎症增强。此后，流入至这个损害处的巨噬细胞、淋巴细胞释放的水解酶、炎症介导因子和生长因子使此斑点发生坏死。通过单核细胞流入至坏死灶的重复过程，平滑肌的运动和分化，以及纤维组织的形成，损害组织生长为一种纤维组织复合结构，它在坏死组织中覆盖着纤维物质，核心部分是MLDL。从生长的损害组织中产生血栓，动脉变硬，并且发生循环系统疾病，诸如血流障碍物。因此，在血液中诸如胆固醇和LDL等的脂肪量升高时，发生动脉粥样硬化，但仅仅是脂肪蓄积时，它并不发生。相反，动脉粥样硬化是一种典型的炎性反应，其中内皮细胞、巨噬细胞和淋巴细胞与脂肪涌入并蓄积在动脉内皮细胞下，此后损害发展，以及最后细胞坏死等的一系列过程相关。
藿香是一种多年生植物，它属于唇形科，分布在东北亚，包括朝鲜、日本、中国等地。在朝鲜，它主要野生在南部地区或在某些地区栽培。在中药中，这种植物的地上部分称为广藿香(藿香的别名)，一本中国书“Myoneubyolok”说到“它解除机体的恶气和外界疫毒，并治疗假霍乱，即治疗呕吐和肠痉挛”。在普通人中，其叶子用作各种汤中的调料，诸如泥鳅汤，花用作蜜源。
对藿香成分的研究报告到具有多种挥发油、倍半萜、二萜、三萜、类黄酮、phenylpropanoid和类胡萝卜素。对藿香生理活性的研究报告到提取物的抗菌活性[Phytother.Res.14(3)，210-212，2000；J.Food Sci.Nutr.4(2)，97-102，1999]，抗病毒活性[Arch.Pharm.Res.22(5)，520-523，1999；U.S.Pat.No.5776462]和对单胺氧化酶的抑制活性[The Pharmaceutical Societyof Korea 42(6)，634-638，1998]。另外还报告有挥发油的抗菌活性[中国药学杂志35(1)，9-11，2000；Weishengwuxue Zazhi 18(4)，1-4，16，1998]和驱蚊活性[中国专利No.1044205]，类胡萝卜素的抗癌活性[The Korean Society of Pharmacognosy 30(4)，404-408，1999]，二萜的抗癌活性[J.Nat.Prod.58(11)1718-1821，1995]和抗病毒活性[Arch.Pharm.Res.22(1)，75-77，1999]，phenylpropanoid的抗病毒活性[Arch.Pharm.Res.22(5)，520-523，1999]，抗氧化活性[The Korean Society of AgriculturalChemistry and Biotechnology 42(3)，262-266，1999]和抗补体活性[The Korean Society of Pharmacognosy 27(1)，20-25，1996；The Korean Society of Agricultural Chemistry andBiotechnology 39(2)，147-152，1996]。但是无论是国内还是国外，尚未报告藿香提取物的抗炎和抗动脉粥样硬化活性。
另一方面，已经报告椴素存在于各种植物中，它是一种类黄酮金合欢素的葡萄糖-糖苷化合物。
对椴素生理活性的研究报告有抗氧化活性[J.Food Sci.Nutr.4(1999)，221-225；Indian J.Chem.，Sect.BOrg.Chem.Incl.Med.Chem 36B(1997)，1201-1203]和对黄嘌呤氧化酶的无任何抑制活性[J.Nat.Prod.51(1988)，345-348]。但是，无论是国内还是国外尚未有关于椴素抗炎活性和抗动脉粥样硬化活性的任何报告。
本发明的总结因此，本发明人研究了用于食品和药物目的的天然原料药物的抗炎活性和抗动脉粥样硬化活性，以选择不妨碍正常脂质代谢，并且可控制抗炎活性引起的动脉粥样硬化损害进展的天然药物。结果，本发明成功地发现了藿香提取物具有对各种炎性因子的抑制活性和良好的抗动脉粥样硬化活性，它可显著地减轻与炎性反应相关的动脉粥样硬化的损害。
因此，本发明的目的是提供一种藿香提取物和通过分离-提纯从其中获得的椴素，因为它们具有抗炎活性和抗动脉粥样硬化活性，所以它们作为药物和食品添加剂可有效地预防并治疗炎性疾病、与炎性反应相关的动脉粥样硬化和动脉粥样硬化引起的循环系统疾病。
附图的简要描述附
图1显示椴素对内皮分子诱导的剂量依赖效应。用10或100μM椴素将HUVECs预孵育2小时，并用TNF-a(10ng/ml)刺激16小时，对VCAM-1或同位型对照染色，用流式细胞术进行分析。
附图2显示藿香提取物对用胆固醇饮食喂养8周的Ldlr-/-鼠油红O染色的主动脉瓣损伤区域中动脉粥样硬化损伤的影响。心脏主动脉瓣的典型截面图(×100)，(A)选自对照组，(B)选自1％藿香提取物饮食组。
附图3显示使用鼠巨噬细胞-2的单克隆抗体(MOMA-2，SerotecInc.NC.USA)后，胆固醇饮食喂养8周的Ldlr-/-鼠的主动脉瓣损伤处巨噬细胞蓄积的免疫化学染色(×100)，(A)为对照组，(B)为1％藿香提取物饮食组。
附图4显示椴素对胆固醇饮食喂养8周的Ldlr-/-鼠的主动脉瓣损伤处的动脉粥样硬化损伤的影响。心脏主动脉瓣的典型截面图(×40)，(A)选自对照组，(B)选自1％藿香提取物饮食组。
本发明详细描述本发明涉及一个具有抗炎和抗动脉粥样硬化活性的组合物，此组合物中包含藿香提取物和通过分离-提纯从其提取物中获得的椴素作为活性成分。
下面对本发明进行更详细地描述。
按照本发明，藿香提取物或通过分离-提纯获得的椴素具有炎性因子的抑制活性，即抗补体活性，对ICAM-1和VCAM-1表达的抑制活性，以及对NO产生的抑制活性，这样，由于其对炎性反应相关的动脉粥样硬化损伤良好的抑制活性，所以它不仅对炎症疾病，而且对动脉粥样硬化均可进行有效地预防和治疗。
因此，本发明包括药物或食品添加剂，其含有的藿香提取物和通过分离-提纯获得的椴素作为活性成分。
下面更详细地描述本发明的藿香提取物和椴素的分离-提纯过程。
干燥整个藿香植物，用低级醇提取，然后浓缩，获得藿香的提取物。此提取物的分馏收率约为干燥藿香重量的10-20％。因此，将所得藿香提取物悬浮在水中，充分摇动后用相同体积的正己烷分馏，并按此顺序加入氯仿和低级醇分馏，然后获得通过溶剂分馏的馏分。此处，低级醇为1到6个碳原子的烷基醇，需要的是正丁醇。通过溶剂分馏后进行诸如硅胶柱色谱法和高速液相色谱法的常规方法。或者可应用常用的分离-提纯方法，诸如再结晶。
在如上述所述获得的藿香提取物和通过分离-提纯获得的椴素中分别检测角叉菜胶诱导的急性炎症小鼠中对补体系统的抗补体活性，对ICAM-1表达的抑制活性，对VCAM-1表达的抑制活性和对NO产生的抑制活性，以及抗炎活性和动脉粥样硬化损伤的抑制活性。
藿香提取物具有抗补体活性，它可强烈地抑制人抗免疫复合物血清的补体活性。而且，它强烈地抑制ICAM-1对THP-1单核细胞的白血病细胞(THP-1细胞)的表达，此THP-1细胞通过肿瘤坏死因子-a(TNF-a)诱导ICAM-1表达。而且，它对脂多糖(LPS)活化的小鼠单核细胞/巨噬细胞RAW264.7细胞的NO产生具有强烈的抑制活性。另外，它还在患有角叉菜胶诱导急性炎症的小鼠中表现出强烈的抗炎活性，而且当用加入饲料中的1％藿香提取物饲养低密度脂蛋白受体缺乏鼠(LDLR-/-mice)时，对照组主动脉窦处的动脉粥样硬化损伤明显减轻。
另外，已证实藿香提取物己烷馏分具有上述强烈的抗补体活性和对ICAM-1表达的抑制活性，氯仿馏分具有强烈的对ICAM-1表达的抑制活性和对NO产生的抑制活性，丁醇馏分具有强烈的对ICAM-1表达的抑制活性。
同时，因为本发明包括药物和食品添加剂，其所含藿香提取物和通过分离-提纯获得的椴素为活性成分，所以制备药物和食品添加剂的方法与所熟知的方法一致。
因为藿香提取物和椴素是天然的形式，所以应用中可采用其自身的形式，但是也可以将其与制药中所允许的载体、成形剂和稀释剂混合制成粉末、颗粒、胶囊或注射剂。从很久以前藿香提取物就已经用于食品和药物，而且剂量不受限制，并且可根据内吸收性、体重、患者年龄、性别、健康状况、给药时间、给药方法、排泄率和疾病的程度进行改变。一般情况下，作为活性成分的藿香提取物(浓缩状态)和椴素的所想要的量为0.1-100mg/kg(体重)。因此，考虑到有效剂量的限制，必须制备含有本发明活性成分的组合物，而且一旦需要，例如观察者或专家的决定和个人的要求，则可间断地应用或进行几次特殊给药。
同时，当将藿香提取物和椴素制备为食品添加剂时，它们可包括在诸如饮料、口香糖、油酥点心等食品中。
如上述含有藿香提取物和椴素作为活性成分的药物和食品添加剂善于预防和治疗炎性疾病、动脉粥样硬化和动脉粥样硬化引起的循环系统疾病。
下面应用实施例对本发明进行详细的描述，然而，本发明的范围将不限制在下面的实施例中。
制备实施例1藿香提取物的制备和应用溶剂分馏采集、干燥和精细剪切农场中栽培的30kg藿香的地上部分，然后将其保持在甲醇(120L)中3天。将提取物(30kg)浓缩3遍，获得提取物(3.5kg)。然后将一些提取物(2.5kg)悬浮在水(10L)中，并用正己烷(10L)分馏2遍。结果，获得380g正己烷馏分。随后，按上述方法用氯仿和正丁醇对其进行分馏，并浓缩。结果，获得590g氯仿馏分，450g正丁醇馏分和980g水馏分。
制备实施例2从藿香中分离-提纯椴素采集、干燥和精细剪切农场中栽培的藿香地上部分后，获得30kg原料。将其保持在甲醇(120L)中3天，通过将其(30kg)提取3遍，获得提取物(3.5kg)。
然后将一些提取物(2.5kg)悬浮在水(10L)中，用氯仿(10L)分馏，并重复此步骤2遍，除去氯仿馏分。随后，按照上述方法用正丁醇对其进行分馏，获得450g正丁醇馏分。将吸附于硅胶(1kg)的正丁醇馏分(150g)接受填充有硅胶(4kg)的柱色谱法(25×75cm)，然后用氯仿-甲醇混合物(甲醇比例5％～10％)洗脱含椴素的馏分。将剩余的馏分(300g)保持在甲醇(10L)中，并用甲醇将此处获得的沉淀冲洗数遍，获得含椴素超过90％的沉淀。应用高速液相色谱法将上述2种方法获得的纯椴素与含化合物的椴素分离开。
实施例1抗补体活性采用Meyer等[Kabat，E.A.和Mayer M.M.(1961)《试验免疫化学》第2版Charles and Thomas，USA]的方法的改良方法进行补体系统的抗补体活性的测定，试验方法如下。
用明胶-佛罗那缓冲溶液(1.8mM巴比妥钠，3.1mM巴比妥酸，0.1％明胶，0.141M盐，0.3％叠氮化钠，0.5mM氯化镁，0.15mM氯化钙，pH7.3)冲洗新鲜绵羊红细胞3遍，然后将其浓度调整为5×108细胞数/ml。在上述缓冲溶液中将抗体(抗绵羊红细胞基质兔抗血清，S-1389，Sigma)稀释至1/100，与相等体积的绵羊血细胞稀释溶液混合，在37℃的孵化器中缓慢搅拌1小时，制备出致敏红细胞(EA)，用冷缓冲溶液将其冲洗2遍，并将浓度调整至5×108细胞数/ml。从人血液中获得的补体(血清)在2500×g下离心后，将其在缓冲液中稀释至1/90，与40μl EA溶液、80μl补体稀释溶液和80μl缓冲溶液混合，并将其置于37℃孵化器中进行反应。然后在离心后，立即在504nm下测定100μl上层溶液的吸光度。按照浓度测定每个抗体和补体(血清)的吸光度，并测定50％溶血(标准溶血)发生的抗体和血清(补体)的稀释浓度。随后，将融化在DMSO中的试验样品在80μl缓冲溶液中稀释至2.5％，为达到标准溶血将其加入，然后将吸光度的测定重复3遍，并计算吸光度的下降。然后用此，将对试验样品溶血的抑制活性转化为抗补体活性。
结果，藿香提取物的正己烷馏分和氯仿馏分显示高的抗补体活性，如表1所示。
表1
实施例2对ICAM-1表达的抑制活性下面是对THP-1细胞的ICAM-1表达抑制活性的试验方法。
在CO2孵化器(5％CO2、相对湿度95％、37℃)中用加入10％胎牛血清(Gibco BRL 26140-079，FBS)的RPMI-1640肉汤(RPMI-1640，Gibco BRL 23400-021，1.62％；0.2％NaHCO3；1％混合有青霉素和链酶素的抗菌剂)培养THP-1细胞。在DMSO中融化试验样品，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释至5％以下，并加入反应溶液，达原先的5％，以使终溶液中此融化样品的DMSO浓度不超过0.25％。将200μl THP-1细胞(2.5×105细胞/ml)分入96孔板的每个孔中，每个孔中添加了在恒浓度下制备的10μl溶液。在37℃的CO2孵化器中将其培养1小时后，加入TNF-a(终浓度10ng/ml)，诱导ICAM-1表达，并在CO2孵化器中再培养16小时。准备反应溶液，加入25μl戊二醛缓冲溶液(PBS中戊二醛浓度为2.08％)，以分离非特异性结合部分，使细胞处于良好状态，用PBST(PBS中tween-20浓度0.005％)冲洗，加入3％脱脂乳。再次冲洗后，按顺序加入一抗(抗人ICAM-1)和二抗(抗鼠IgG过氧化物酶缀合物)，加入200μl着色用底物溶液(OPD过氧化物酶底物(Sigma P-9187)，在0.05M磷酸盐-枸橼酸盐缓冲液中)，然后加入50μl 3M HCl，5-10分钟后停止反应。然后，在测定490 nm下的吸光度和TNF-a引起THP-1细胞ICAM-1的表达后，计算样品所致表达的抑制率。
表2
如表2所示，藿香提取物、其溶剂馏分和椴素对ICAM-1表达的抑制活性低于抗炎药物地塞米松，但是正己烷馏分和氯仿馏分特别显示出良好的抑制活性。地塞米松是一种甾类药物，它与其它甾类药物一样，具有良好作用的同时，长期使用会出现副作用(肾功不全、炎症加重、糖尿、肌肉萎缩、生长抑制、骨质疏松等)。但是藿香提取物和椴素没有这些副作用。
实施例3对VCAM-1表达的抑制活性下面是对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)VCAM-1表达的抑制活性的试验方法。
用加入100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的EGM-2 Bulletkit肉汤培养基[盒内含500ml瓶装内皮细胞基础培养基-2(EBM-2，Clonetics CC-3156，MD，USA)]在CO2孵育器中培养HUVEC。在DMSO中融化试验样品，其在终反应溶液中的浓度保持在0.1％以下。每组所用的HUVEC为两培养皿(ψ10cm，2×106个细胞)，并在样品处理前交换肉汤培养基。首先，将终浓度100μM和10μM的椴素预处理2小时。然后，将每组TNF-a处理为10ng/ml，并诱导VCAM-1表达16小时。用PBS冲洗2遍，并用胰蛋白酶(0.025％)作用5分钟后，收集细胞。将收集的细胞在15ml试管中离心后，除去上层溶液，用PBS悬浮细胞沉淀物，再次离心细胞并冲洗。用PBS冲洗细胞2遍后，将细胞悬浮在100μl加入0.5.％BSA(牛血清白蛋白)的PBS中，并加入鼠抗人单克隆抗体(Rb 1/9；1μg/ml)。诱导单克隆抗体与冰上的细胞结合30分钟后，用冷PBS冲洗这些细胞3遍，并在含有FITC(异硫氰酸荧光素)的冰中孵育40分钟，此处FITC与山羊F(ab’)2抗-鼠IgG结合，其在PBS中的稀释度为1∶25(W/W)。然后用1％低聚甲醛固定细胞，并通过FACScan(Bio-Rad，USA)分析，测定试验样品对VCAM-1表达的抑制活性。
表3和附图1显示对椴素处理的HUVEC组的VCAM-1表达的抑制活性，并证实对VCAM-1表达具有强烈的抑制作用。
表3
实施例4对NO产生的抑制活性下面是对鼠单核细胞/巨噬细胞RAW264.7(RAW264.7细胞)NO产生的抑制活性的试验方法，此细胞的活化是由脂多糖诱导的。
用Sherman等的方法(Sherman et.al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.191，1301-1308，1993)的改良方法进行此试验。测定RAW264.7细胞的NO3产生和样品对其产生的抑制率，NO3是NO的一种稳定的氧化物。将LPS(10μg/ml)加入在Dulbecco’s ModifiedEagle’s培养基(Gibco BRL，USA，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，10％FBS，6g/L HEPES，3.7g/L NaHCO3)中培育的RAW264.7细胞中，并诱导活化，然后在CO2孵化器(5％CO2、相对湿度95％、37℃)中培育RAW264.7细胞48小时。然后，离心(1000rpm，10分钟)此培养基，获得上层溶液，将100μl Griess试剂(37.5mM对氨基苯磺酸、12.5mM二盐酸化N-(1-萘基)乙二胺、6.5mM盐酸)加入此上层溶液中，在室温下培育10分钟，然后通过分光光度计在540nm下测定吸光度。应用NO3浓度吸光度相关系数计算RAW264.7细胞产生的NO3浓度，其相关系数是通过在0-50μM中制备的硝酸盐得出的。在DMSO中融化试验样品，并在LPS处理前2小时加至RAW264.7细胞中，浓度达0.1％，然后通过测定反应后NO3浓度，计算样品对NO3产生的抑制率。
NO浓度的标准等式＝吸光度(540nm)×179.4215-8.5221
结果，如表4中所示，在藿香提取物、氯仿馏分和正丁醇馏分中发现对NO产生的高的抑制活性。
表4
实施例5角叉菜胶诱导急性炎症模型的抗炎活性试验动物为雄性Sprague-Dawley大鼠(210-220g)，角叉菜胶为炎症试剂，研究试验样品对水肿模型的水肿抑制率。试验方法如下。
200mg/kg藿香提取物悬浮在水中，用作试验样品，用其饲养每只鼠，1小时后，在鼠后腿附近皮下给予0.1ml的在0.85％盐水中的1％角叉菜胶悬浮液。给药后的5小时中，测定每组7只鼠的模型足底的厚度，每小时测定1次。同时，一起测定对照组(盐水)模型足底的厚度，并根据对照组随时间水肿的加重，研究样品组水肿的抑制率。
表5显示角叉菜胶诱导的急性炎症模型中藿香提取物的抗炎活性。从给药的2小时开始，藿香表现出较强的抗炎活性，对水肿的抑制作用持续了测定的5小时。
表5
实施例6对动脉粥样硬化损害的抑制活性下面详细描述动脉粥样硬化损害的抑制活性的试验方法。
步骤I)鼠的饲养和藿香提取物应用于鼠的试验将所用的模型，雌性LDLR-/-鼠(6-8周，平均体重16.8g)随机分入2组，每组各10只。一组以高胆固醇饮食(15％脂肪，1.25％胆固醇，0.5％Na-胆酸盐)饲养，另一组以添加了0.1％和1％试验样品的上述饮食饲养。在试验期间，鼠可自由地进食水和食物。
步骤II)模型动脉粥样硬化损害的测定试验进行8周后，通过眼睛对所有鼠采血。然后，用PBS(磷缓冲溶液)灌流鼠的心脏和动脉10分钟，随后用低聚甲醛灌流5分钟。此过程后，摘除心脏和动脉，浸入10％中性福尔马林中24小时，将其置于OCT培养基(10.24％聚乙烯醇，4.26％聚乙二醇，80.5％非反应成分，w/w，Life Science International，英格兰，UK)中，然后保持于-70℃。用低温下(-20℃)的切片机从动脉区域开始制备冰冻切片(每个9μm)，用油红O将6个冰冻切片染色，并用Harris苏木精对染。然后通过计算机辅助形态测定法对这些染色切片进行定量分析，并计算每组动物损害大小的平均值。这样，根据对照组损害的发作，计算对样品组损害的抑制活性。
(其中对照组指高胆固醇饮食组)(1)藿香组对动脉粥样硬化损害抑制活性的试验结果如表6所示，与对照组相比，8周试验中藿香组的摄入量和体重没有任何变化。
表6
另外，如表7所示，藿香提取物对动脉粥样硬化损害抑制作用的结果显示，与对照组相比，用包括0.1％和1％藿香提取物的饮食饲养的组中，损害的大小分别下降了23％和46.6％。
表7
而且，当对心脏的动脉横切面染色时，与对照组相比，1％藿香提取物组中炎症所致损害(坏死组织)的大小显著下降(附图2)。另外，当仅对损害的巨噬细胞染色时，与对照组相比，1％藿香提取物组中巨噬细胞的聚集显著下降(附图3)。
因此，动脉粥样硬化损害进展至巨噬细胞等免疫细胞在内皮细胞下的聚集和炎症显示，藿香提取物显著地降低了炎症所致损害的发展。
(2)椴素组对动脉粥样硬化损害抑制活性的试验结果如表8所示，椴素对动脉粥样硬化损害抑制作用的结果显示，与对照组相比，用包括1％椴素的饮食饲养的组中，损害的大小下降了41.9％。
表8
如表8所示，1％洛伐他汀组中对动脉粥样硬化损害的抑制活性高于1％椴素组，但是本发明的椴素是安全的，没有任何副作用，而洛伐他汀对肝脏具有毒性作用。另外，可以肯定的是本发明的椴素组比对照组更有效。
而且，心脏的动脉横切面染色的结果显示，与对照组相比，1％椴素组中炎性反应所致损害(坏死组织)的大小显著下降(附图4)。因此，在动脉粥样硬化损害进展至巨噬细胞等免疫细胞在内皮细胞下的聚集和炎症的过程中，证实椴素显著地减轻了动脉粥样硬化损害的发展。
实施例7片剂的制备在将10g藿香提取物(包括1g椴素)、70g乳糖、15g结晶纤维素和5g硬脂酸镁压碎和混合后，通过直接压片法制备片剂。每片总量为100mg，活性成分藿香提取物的量为10mg(1mg椴素)。
实施例8散剂的制备通过将10g藿香提取物(包括1g椴素)、50g玉米淀粉和40g羧基纤维素压碎和混合，制备散剂。并通过将100mg散剂放入硬度VI的胶囊中而制备胶囊。
实施例9毒性试验从很早以前开始，藿香提取物和通过分离-提纯获得的椴素是无毒的原料和天然药物，用作食品和药物。将在二甲亚砜中溶解并在水中稀释的1g/kg成分给予每只鼠(10只/组)，7天后未发现任何鼠死亡。
实施例10包括藿香提取物的饮用组分将李子提取物(李子固体提取物(固体量69°Bx)，制造商韩国Hadong National Agricultural Cooperative Federation)、中国榅桲、大独活、干姜、五味子、肉桂(汉城Kyongdong市场)、葡萄汁(固体量65°Bx，制造商Comax international Corp.)和梨汁(制造商Hanmi aromatics chemistry)制备为包含藿香提取物的饮用组分。
首先，加入天然药物重量10倍的水，然后在100℃将中国榅桲、大独活、干姜、五味子和肉桂等天然药物水热提取30分钟。将这些保持在4℃24小时，在将它们离心10分钟后，应用上层溶液的天然药物提取物。
将所用的李子提取物的李子固体提取物(69°Bx)稀释至10°Bx，所用的葡萄汁(65°Bx)和梨汁(69°Bx)不稀释。
对于包含藿香提取物的饮用组分，将0.1％藿香提取物、0.2％李子提取物、0.3％干姜提取物、0.3％中国榅桲提取物、0.01％肉桂提取物、5.0％梨汁和17％超级果糖(superfructose)在水中稀释以调整为100ml，在95℃进行射线照射和处理15秒，制备为饮料商品。
上面所述是制备包含藿香提取物的饮料商品的方法，也可制备相同用途的包含椴素的饮用商品，其中椴素替代藿香提取物。
如上所述，本发明的藿香提取物和通过分离-提纯获得的椴素可抑制各种炎症因子的活化、产生和表达，在动物中具有抗炎活性，而且对动脉粥样硬化损害的产生具有显著的抑制活性，因此，它们可用作预防或治疗炎性疾病、与炎性反应相关的动脉粥样硬化和由动脉粥样硬化引起的循环系统疾病的药物或食品添加剂。
权利要求
1.一种药物组合物，它含有藿香提取物作为活性成分。
2.按照权利要求1的药物组合物，其中所说的提取物含有正己烷、氯仿或正丁醇分馏的溶剂馏分。
3.按照权利要求1的药物组合物，其中所说的提取物含有椴素作为活性成分。
4.按照权利要求1或3的药物组合物，其中所说的组合物对炎症反应中的一种因子-补体系统具有抑制活性。
5.按照权利要求1或3的药物组合物，其中所说的组合物可抑制细胞间粘附分子-1的表达。
6.按照权利要求1或3的药物组合物，其中所说的组合物可抑制一氧化氮的产生。
7.按照权利要求1或3的药物组合物，其中所说的组合物具有抗炎活性及抗动脉粥样硬化活性。
8.食品添加剂组合物，它包括藿香提取物或通过分离-提纯获得的椴素作为活性成分，并具有抗炎活性及抗动脉粥样硬化活性。
全文摘要
本发明涉及包含藿香和通过分离－提纯获得的椴素(tilianin)的组合物，它用于抗炎和抗动脉粥样硬化，而且更特别的是，本发明涉及藿香提取物以及通过分离－提纯从其中获得的椴素，它们不仅可有效地预防和治疗炎症疾病，而且可有效地预防和治疗与炎性反应相关的动脉粥样硬化和由动脉粥样硬化引起的循环系统疾病，这是因为它们可良好地抑制炎性反应中的一种因子－补体系统的活性，细胞间粘附分子－1(ICAM－1)和血管细胞粘附分子－1(VCAM－1)的表达，以及一氧化氮(NO)的产生。它们还可显著地减轻炎性反应所致动脉粥样硬化的发展。
文档编号A61P9/10GK1518454SQ01823069
公开日2004年8月4日 申请日期2001年12月20日 优先权日2001年2月27日
发明者李炯圭, 吴世洋, 安境燮, 崔顺子, 金正姬, 吴九泽, 弘廷宙, 朴成圭, 南穷佑 申请人:韩国生命工学研究院