专利名称：含多胺作为活性物质的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含多胺作为活性物质的药物以及多胺用于生产免疫刺激药物和/或作为治疗和/或预防各种人和动物疾病之药物的用途。
在相当长时间的兽医实践中，一直将诱导“旁特异性免疫”的产物-称为免疫刺激剂或者旁免疫诱导剂用于治疗、病后调养和预防。例如，免疫刺激剂可以由化学灭活的Parapoxvirus ovis，strain D1701(DE-A 3504940)组成。BAYPAMUN是以这种病毒为基础制备的产品。
在动物中，灭活的副痘病毒诱导针对各种病原体引起之感染的非特异性保护。因此认为身体自身防御系统的各种机制是造成这种保护作用的原因。
这些机制包括干扰素的诱导，天然杀伤细胞的激活，“集落-刺激活性”(CSA)的诱导以及淋巴细胞增殖的刺激作用。早期对作用机制的研究表明白细胞介素2和α干扰素受到刺激(Steinmassl & Wolf，1990)。
另外，可以用免疫刺激剂例如未甲基化的含CpG的寡核苷酸(WO98/18810)激活非适应性免疫系统并增强身体对疾病病原体的抵抗能力。已经可以在不同小鼠模型中实验性地表明一次给药可以激活初始免疫反应并防止各种病原体感染，例如李斯特菌属单细胞基因(Elkinset al.，1999；Krieg et al.，1998；Oxenius et al.，1999)，Francisella tularensis(Elkins et al.，1999)，利什曼原虫(Walker et al.，1999；Zimmermann et al.，1998)，炭疽，埃博拉(ebola)和疟疾(Krieg，2000；Klinman et al.，1999)。
在作用机制的分析过程中，可以表明鼠B细胞、巨嗜细胞、树突细胞和NK细胞都被含CpG的寡核苷酸所刺激。另外，诱导了细胞因子IL-18、IL-12和γ干扰素(Krieg，2000)。
本发明的目的是提供含新免疫刺激剂的药物，所述免疫刺激剂尽管与Parapox ovis有相似的活性，但是可经化学合成，因此可便宜地生产，并更容易与化学治疗剂组合。
通过提供含多胺作为活性物质的药物可达到所述目的。
作为活性物质的多胺含有至少10个单体单位或者至少10个氮原子，优选至少45个单体单位或者至少45个氮原子。
所述多胺可以是线性或者分枝的。
所述多胺优选可溶于水或者可分散在水中；取决于pH的部分质子化作用发生在含水介质中。可通过物理化学测量法例如ξ潜能测量法(potential measurements)测定质子化程度。
此外，还优选所述多胺具有疏水取代基。
所述疏水取代基可以在所述聚合物中作为侧链或者末端。取代程度(在主聚合物链中功能化N原子的百分比)优选为0.01-10％。
适宜的疏水取代基特别是烷基链、酰基链或类固醇样取代基。酰基链是特别适宜的疏水取代基。通过将主聚合物链的氮功能加成到异氰酸酯或者α，β-不饱和羰基化合物而引入的疏水取代基也是适宜的。
特别优选的多胺是聚乙烯亚胺。
优选可用于生产所述药物的聚乙烯亚胺具有下列通式 其中，在每个[CH2-CH2-N]单位中，R1表示氢、甲基或乙基，和R2表示有1-23个碳原子的烷基，优选有12-23个碳原子的烷基，特别优选有17个碳原子的烷基，而且其中R3和R4(末端基团)彼此独立地表示氢和1-24个碳原子的烷基，优选13-24个碳原子的烷基，特别优选18个碳原子的烷基，或者具有取决于引发剂(initiator)的结构，R5(末端基团)是取决于终止反应的取代基，例如羟基、NH2、NHR或NR2，而且其中的R可以对应于末端基团R3和R4，平均聚合度P＝(m+n)为45至5250，优选250至2250，特别优选500至2050，且n＝a×P，其中0.0001＜a＜0.1，优选0.01＜a＜0.05，特别优选a＝0.03。
就此而言，单位m和n不是嵌段结构，而是随机分布在聚合物中。
可优选用于生产所述药物的另一种聚乙烯亚胺具有下列通式 其中，在每个[CH2-CH2-N]单位中，R1表示氢、甲基或乙基，和R2表示有1-22个碳原子的烷基，优选有11-22个碳原子的烷基，特别优选有16个碳原子的烷基，而且其中R3和R4(末端基团)彼此独立地表示氢和1-24个碳原子的酰基，优选13-24个碳原子的酰基，特别优选18个碳原子的酰基，或者具有取决于引发剂的结构，R6(末端基团)是取决于终止反应的取代基，例如羟基、NH2、NHR或NR2，而且其中的R可以对应于末端基团R3和R4，平均聚合度P＝(m+n)为45至5250，优选250至2250，特别优选500至2050，且n＝a×P，其中0.0001＜a＜0.1，优选0.01＜a＜0.05，特别优选a＝0.03。
就此而言，单位m和n不是嵌段结构，而是随机分布在聚合物中。
可优选用于生产所述药物的另一种聚乙烯亚胺具有下列通式
其中，在每个[CH2-CH2-N]单位中，R1、R2和R3表示氢或羟基，而且其中R4和R5(末端基团)彼此独立地表示氢或者类固醇母体物质，例如胆汁酸，或者具有取决于引发剂的结构，R6(末端基团)是取决于终止反应的取代基，例如羟基、NH2、NHR或NR2，而且其中的R可以对应于末端基团R4和R5，平均聚合度P＝(m+n)为45至5250，优选250至2250，特别优选500至2050，且n＝a×P，其中0.0001＜a＜0.1，优选0.01＜a＜0.05，特别优选a＝0.03。
就此而言，包括具有类固醇骨架链的所有类固醇异构体。特别是，R1、R2和R3取代基可以为α构象和β构象。以同样的方式，5位的取代基可以为α构象和β构象(根据Rmpp-Chemielexikon，9thedition，Georg Thieme Verlag，1992命名法)。
就此而言，单位m和n不是嵌段结构，而是随机分布在聚合物中。
可优选用于生产所述药物的另一种聚乙烯亚胺具有下列通式
其中，在每个[CH2-CH2-N]单位中，R1表示OR4或NR4R5，而且R4和R5(末端基团)彼此独立地表示氢或者具有1-24个碳原子的烷基，优选13-24个碳源中的烷基，特别优选18个碳原子的烷基，而且其中R2和R3(末端基团)彼此独立地相应于主聚合物链氮原子的取代基或者具有取决于引发剂的结构，R6(末端基团)是取决于终止反应的取代基，例如羟基、NH2、NHR或NR2，而且其中的R可以对应于末端基团R2和R3，平均聚合度P＝(m+n)为45至5250，优选250至2250，特别优选500至2050，且n＝a×P，其中0.0001＜a＜0.1，优选0.01＜a＜0.05，特别优选a＝0.03。
就此而言，单位m和n不是嵌段结构，而是随机分布在聚合物中。
可优选用于生产所述药物的另一种聚乙烯亚胺具有下列通式 其中，在每个[CH2-CH2-N]单位中，R1表示有1-24个碳原子的烷基，优选13-24个碳源中的烷基，特别优选18个碳原子的烷基，
而且其中R2和R3(末端基团)彼此独立地相应于主聚合物链氮原子的取代基或者具有取决于引发剂的结构，R4(末端基团)是取决于终止反应的取代基，例如羟基、NH2、NHR或NR2，而且其中的R可以对应于末端基团R2和R3，平均聚合度P＝(m+n)为45至5250，优选250至2250，特别优选500至2050，且n＝a×P，其中0.0001＜a＜0.1，优选0.01＜a＜0.05，特别优选a＝0.03。
就此而言，单位m和n不是嵌段结构，而是随机分布在聚合物中。
可优选用于生产所述药物的另一种聚乙烯亚胺具有下列通式 其中，在每个[CH2-CH2-N]单位中，R可以是氢或者下式的基团 其中Rx可以是氢或再次又是类型R的基团，且其中每个[CH2-CH2-N]单位和末端基团可携带上述取代基，平均聚合度P＝(m+n)为45至5250，优选250至2250，特别优选500至2050，且n＝a×P，其中0.0001＜a＜0.1，优选0.01＜a＜0.0 5，特别优选a＝0.03。这些聚乙烯亚胺具有分枝或交联结构。
所述聚合物的平均分子量优选低于220000g/mol，特别优选分子量为2000至100000g/mol，极为优选分子量为20000至100000g/mol。
在聚合物类似反应，例如通过卤代链烷的烷基化、碳酰氯的酰化、活性酯的酰化、与α，β-不饱和羰基化合物(羧酸、羧酰胺、羧酸酯)的Michael加成反应或者与异氰酸酯的加成反应中引入疏水基。这些是可从文献中获知的反应类型(March，1992)。
用阳离子引发剂，优选按照B.L.Rivas和S.I.Ananias(1992)的方法，通过2-乙基噁唑啉的阳离子开环聚合反应制备线性聚乙烯亚胺。可将用这种方法得到的聚(乙基噁唑啉)用浓盐酸和水组成的混合物，优选浓盐酸和水的1∶1混合物处理除去丙酸定量转变成线性聚乙烯亚胺。反应温度优选为80-100℃，特别优选100℃。反应时间优选为12-30小时，特别优选24小时。优选通过从乙醇中重结晶数次纯化所述产物。
可用已描述的方法制备所需分子量为2000至220000g/mol的线性聚乙烯亚胺。
例如，在40-75℃，优选60℃，通过将适宜线性聚乙烯亚胺的5％溶液与十八烷基氯在无水乙醇中反应引入烷基，例如C18-烷基。将计量的烷基氯的数量精确调整到所需的取代程度(0.1-10％)。反应时间优选为10-24小时，特别优选17小时。
例如，在40-60℃，优选50℃，通过将适宜线性聚乙烯亚胺的5％溶液与十八烷酰氯在无水乙醇中反应引入酰基，例如C18-酰基。将计量的酰氯的数量精确调整到所需的取代程度(0.1-10％)。反应时间优选为10-24小时，特别优选20小时。
还用活性酯引入酰基，使用经N-羟基琥珀酰亚胺活化的羧酸衍生物。当胆汁酸功能化聚乙烯亚胺时，优选使用此方法。为此，将胆汁酸衍生物鹅脱氧胆酸(3α，7α-二羟-5β-胆甾烷酸)，在下文用缩写CDC代替，例如与以二甲氧基乙烷为溶剂的N-羟基琥珀酰亚胺并存在二环己基碳二亚胺的条件下反应。所述反应在室温下完成，反应时间为16小时。将用此方法制备的性性酯与5％的适宜线性聚乙烯亚胺在无水乙醇中的溶液反应。将计量的性性酯的数量精确到所需的取代程度(0.1-10％)。反应温度为20-60℃，优选50℃。反应时间优选为10-24小时，特别优选20小时。
文献(Walker et al.，1998)中描述了用活性酯法例如将鹅脱氧胆酸引入寡胺例如精胺或者五亚乙基六胺中。本发明胆汁酸取代的聚合物具有疏水取代基，所以可用羟基数目控制疏水度，与S.Walker etal.所述“阳离子表面亲水脂分子”(cationic facial amphiphiles)中的方法类似。
通过将多胺，特别使疏水聚乙烯亚胺在pH7溶解于水中，浓度为0.1-1mg/ml，优选0.5mg/ml，然后通过Sephadex柱色谱纯化，随后冻干来制备高度纯化的样品。然后将所述聚合物再次溶解于水，优选生理氯化钠溶液中，同时进行短暂声处理，然后将pH调整到7。多胺或聚乙烯亚胺储备液的浓度优选为0.1-1mg/ml，尤其优选0.5mg/ml。所述储备液在室温下贮存时稳定；优选贮存于4℃。
可以用标准方法，例如1H NMR光谱、FT-IR光谱或ξ潜能测量法表征所述阳离子聚合物。
还可将可用于生产所述药物的多胺与细胞特异性的配体结合。所述细胞特异性配体例如可以是构成性的，以致它们与靶细胞，优选动物或人靶细胞的外膜结合。所述靶细胞例如可以是内皮细胞、肌肉细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、神经胶质细胞、造血细胞、肿瘤细胞，例如白血病细胞、病毒感染的细胞、支气管上皮细胞或肝细胞，例如肝的窦细胞。特异性与内皮细胞结合的配体可选自例如内皮细胞的单克隆抗体或其片段、携带末端甘露糖的糖蛋白、糖脂或多糖、细胞因子、生长因子或者粘附分子，或者在特别优选的实施方案中，选自有内皮细胞趋性的病毒被膜的糖蛋白。与平滑肌细胞特异性结合的配体可选自例如肌动蛋白特异性的单克隆抗体或其片段、细胞膜受体和生长因子，或者在特别优选的实施方案中，选自具有平滑肌细胞趋性的病毒被膜衍生的糖蛋白。特异性与巨噬细胞和/或淋巴细胞结合的配体可选自例如巨噬细胞和/或淋巴细胞上膜抗原特异性的单克隆抗体、巨噬细胞和/或淋巴细胞上膜抗原特异性的多克隆或单克隆抗体的完整免疫球蛋白或Fc片段、细胞因子、生长因子、携带末端甘露糖的肽、蛋白质、脂或多糖，或者在特别优选的实施方案中，选自病毒被膜衍生的糖蛋白，特别是在核苷酸872位有突变的流感病毒C的HEF蛋白或者含催化三联体丝氨酸71、组氨酸368或369和天冬氨酸261的C流感病毒HEF裂解产物。特异性与神经胶质细胞结合的配体可选自例如与神经胶质细胞膜结构特异性结合的抗体和抗体片段、粘附分子、携带末端甘露糖的肽、蛋白质、脂或多糖、生长因子，或者在特别优选的实施方案中，选自具有胆汁细胞趋性的病毒被膜衍生的糖蛋白。特异性与造血细胞结合的配体可选自例如干细胞因子受体特异性的抗体或抗体片段、IL-1(特别是I或II型受体)、IL-3(特别是α或β型受体)、IL-6或GM-CSF，以及具有上述特异性的完整免疫球蛋白或者Fc片段和与附属的受体结合的生长因子例如SCF、IL-1、IL-3、IL-6或GM-CSF及其片段。特异性结合白血病细胞的配体可选自与白血病细胞上膜结构特异性结合的抗体、抗体片段、免疫球蛋白或Fc片段，例如CD13、CD14、CD15、CD33、CAMAL、sialosyl-Le、CD5、CD1e、CD23、M38、IL-2受体，T细胞受体、CALLA或者CD19，生长因子或其片段，或类维生素A。特异性与病毒感染的细胞结合的配体可选自例如病毒抗原特异性的抗体、抗体片段、完整免疫球蛋白或Fc片段，所述病毒抗原是在病毒感染后，在受感染细胞的细胞膜上表达的。特异性与支气管上皮细胞、肝窦细胞或肝细胞结合的配体可选自例如转铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白，例如脱唾液酸血清类粘蛋白、新糖蛋白(neoglycoprotein)或者半乳糖、胰岛素、携带末端甘露糖的肽、蛋白质、脂或多糖、与靶细胞特异性结合的完整免疫球蛋白或Fc片段，在特别优选的实施方案中，可选自以特性结合靶细胞的病毒被膜衍生的糖蛋白。配体的其他详细实施例公开于例如EP-A 0790312和EP-A 0846772中。
一般来说，本发明的药物每剂量含0.5-500mg多胺作为活性物质，优选每剂量20-100mg。
除作为活性物质的多胺外，本发明药物还含有其他药物学活性化合物，例如Parapox ovis(例如BAYPAMUN形式)、Parapox ovis片段、含CpG-的寡核苷酸、抗生素和细胞生长抑制剂。
在将上述多胺纯化或冻干后，可用于生产本发明药物的多胺或者本发明药物本身，优选为固体形式，可在给药即前，将其溶解于适宜的含水介质，优选生理氯化钠溶液中，或者在分散在含水介质，优选生理氯化钠溶液中后，任选地与添加剂混合后以适宜的制剂直接给药。
适宜的其他制剂辅料是生物可相容性和生物可降解的聚合物例如聚交酯、聚交酯乙交酯共聚物、聚丙烯酸酯、聚原酸酯、聚酐、聚酰胺、聚氨基酸、纤维素衍生物、淀粉衍生物或者壳聚糖衍生物。
根据临床问题，要么全身施用(例如经口、肌肉内、皮下、腹膜内或者静脉内)或者局部施用(例如至有关器官)所述基于多胺的药物。
根据相应临床之问题的时间表，可以数次或长期治疗。
由于其免疫刺激、抗炎和抗细胞程序死亡(antiapoptotic)效果(细胞因子诱导，抗炎与抗细胞程序死亡因子的过表达)，可以用多胺治疗下列疾病/损伤或者用于预防/病后调养下列疾病·病毒感染基于已知的Th1免疫反应对潜伏期、慢性、持续病毒感染之影响(Lucin et al.，1994；Smith et al.，1994)与多胺之效果的联系，多胺的效果可与免疫刺激剂Parapox ovis的效果相媲美，因此，多胺具有治疗价值，可用多胺作为单治疗剂或者与生物活性的例如抗病毒的低分子量化合物结合，用于人和动物中针对乙型肝炎、丙型肝炎或致肝炎的病毒类的任何其他病原体的抗病毒治疗，另外，还可用于内部器官的其他病毒感染、包括伴随其他疾病的由不同类型单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人免疫缺陷型病毒(HIV)和人巨细胞病毒(HCMV)的其他感染，以及动物中相应病毒疾病的抗病毒治疗。
·急性或慢性呼吸道和内部器官的病毒感染·由于压力或手术或牙病治疗后引起的感染·细菌感染，特别是细胞内细菌感染·癌症，肿瘤·器官纤维化，特别是病毒型肝炎或者乙醇诱发的肝疾病后引起的肝纤维化或者肝硬变，以及囊肿纤维化·可以治疗伴随有胶原蛋白沉积增加的疾病，所述沉积增加与内部器官，例如肝，以及皮肤和其附件都有关·内部器官、皮肤、血液或者中枢神经系统及其附件，包括眼睛的炎症、退化性和增殖性疾病·过敏性疾病，特别是用于预防全身性过敏的发作或者用于局部过敏或哮喘。
还可用所述多胺作为佐剂。
实施例实施例1合成线性聚乙烯亚胺(LPEI)通过2-乙基噁唑啉的阳离子开环聚合作用得到聚(乙基噁唑啉)(与Rivas & Ananias，1992的方法类似)，然后酸水解，除去丙酸，合成线性聚乙烯亚胺。还可从市场上购买特定的前体聚合物聚(乙基噁唑啉)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Germany)。用凝胶渗透层析、1H-NMR和FT-IR表征前体聚合物。
100℃，在40ml水和40ml浓盐酸组成的混合物中，通过反应例如24.7g聚(乙基噁唑啉)(Mw 200000g/mol)进行定量水解。24小时后，加入250ml水溶解已形成的大部分沉淀。冷却到20℃后，通过加入20％NaOH将pH调整到11，然后沉淀。抽气和洗涤(洗涤水，pH7)过滤掉沉淀后，在高度真空下，用五氧化二磷干燥。然后从乙醇中重结晶粗产物(产率9.5g/88％)。用Millipore水作为洗脱剂，使聚乙烯亚胺饱和水溶液(pH7)经Sephadex G25(Pharmaciadisposable PD-10脱盐柱)柱色谱，得到高纯度产品(毫克量)，随后冻干。
通过1H-NMR和FT-IR表征所述线性聚乙烯亚胺，由此可确定水解是定量的。
实施例2合成疏水功能化线性聚乙烯亚胺(H-LPEIs)，作为3mol％C18烷基引入分子量为87000g/mol LPEI的例子为此，60℃，在氩气下，将0.5g LPEI溶解于10ml乙醇中，缓慢加入0.11g(0.13ml)十八烷基氯后，将混合物搅拌17小时。在20℃，通过加入20ml水沉淀反应产物，然后滤掉沉淀，用水洗涤(洗涤水，pH7)，在高度真空下，用五氧化二磷干燥(产率0.48g/96％)。用Millipore水作为洗脱剂，使聚乙烯亚胺饱和水溶液(pH7)经Sephadex G25(Pharmacia disposable PD-10脱盐柱)柱色谱，得到高纯度产品(毫克量)，随后冻干。
通过1H-NMR和FT-IR表征所述烷基化的线性聚乙烯亚胺，由此可确定得到所需程度的烷基化。
实施例3合成疏水功能化线性聚乙烯亚胺(H-LPEIs)，作为3mol％C18酰基引入分子量为87000g/mol LPEI的例子
为此，50℃，在氩气下，将0.5g LPEI溶解于10ml乙醇中，缓慢加入0.11g(0.12ml)十八烷酰氯后，将混合物搅拌20小时。过滤后，真空下定量弄碎反应混合物。将残留物溶解于4ml热乙醇中，然后在20℃，通过加入8ml水沉淀。滤掉沉淀，用水洗涤(洗涤水，pH7)，在高度真空下，用五氧化二磷干燥(产率0.38g/76％)。用Millipore水作为洗脱剂，使聚乙烯亚胺饱和水溶液(pH7)经SephadexG25(Pharmacia disposable PD-10脱盐柱)柱色谱，得到高纯度产品(毫克量)，随后冻干。
通过1H-NMR和FT-IR表征所述酰基化的线性聚乙烯亚胺，由此可确定得到所需程度的酰基化。
实施例4合成疏水功能化线性聚乙烯亚胺(H-LPEIs)，作为3mol％鹅脱氧胆酸(CDC)基团(3α，7α-二羟-5β-胆甾烷酸)引入分子量为87000g/molLPEI的例子为此，用N-羟基琥珀酰亚胺将鹅脱氧胆酸(Sigma-Aldrich ChemieGmbH)转变成活性酯化合物。将1g鹅脱氧胆酸和0.32g N-羟基琥珀酰亚胺溶解于5ml二甲氧基乙烷，然后在0-5℃与0.63g二环己基碳二亚胺反应。将反应混合物搅拌16小时，然后过滤掉沉淀，将滤液真空下浓缩。高度真空下干燥所述活性酯(稳定的泡沫)，然后用1H-NMR表征。无需任何进一步纯化，室温和氩气下，将179mg鹅脱氧胆酸活酯加入到0.5g LPEI在10ml乙醇中的溶液中。将反应混合物在50℃搅拌20小时。将混合物冷却到室温后，加入25ml水沉淀产物。滤掉残留物，用水洗涤(洗涤水，pH7)，在高度真空下，用五氧化二磷干燥(产率0.41g/82％)。用Millipore水作为洗脱剂，使聚乙烯亚胺饱和水溶液(pH7)经Sephadex G25(Pharmacia disposable PD-10脱盐柱)柱色谱，得到高纯度产品(毫克量)，随后冻干。
通过1H-NMR和FT-IR表征已用活性酯法酰基功能化的所述线性聚乙烯亚胺，由此可确定得到所需程度的酰基化。
实施例5ξ潜能测量法在水溶液中，于生理pH下，完成潜能测量法以确定线性聚乙烯亚胺以及疏水功能化聚乙烯亚胺的电荷或者质子化程度。发现独立于平均分子量和独立于聚合物类型，平均质子化程度在pH7为50％，即在pH7水溶液中，约50％氮原子被质子化。
实施例6用pH7的生理氯化钠溶液制备所有聚乙烯亚胺(LPEIs，H-LPEIs)的储备液，聚乙烯亚胺的浓度均为0.5mg/ml。为此，将25mg LPEI或H-LPEI溶解于30ml水或生理氯化钠溶液，同时加热并进行简短声处理；然后用0.1N HCl将所得溶液的pH调至7，使终体积为50ml。通过过滤(0.2μm)将储备液灭菌，然后于20℃长期储存。
为了证实多胺、特别是聚乙烯亚胺作为免疫治疗剂的适宜性，在体内确定多胺的γ干扰素刺激作用，然后证实多胺的体内效力。
1.在小鼠脾细胞检测中诱导γ干扰素a)动物管理在试验开始前8天，从Charles River公司(Sulzfeld，Germany)获得NMRI小鼠(远系繁殖的，雌性，18-20克重)。动物可自由接近食物和水，并饲养在人工的白天/黑夜节律下(07:00-19:00光照，19:00-07:00为黑夜)。
b)制备小鼠脾细胞通过颈脱臼杀死动物，然后取出脾。从脾中除去连接的结缔组织，然后按照下列方法整理将脾铺在(平皿)金属筛(筛网宽度约70μm)上，然后用剪刀弄碎。然后加入5ml PBS，用玻璃杵将组织碎片压过筛网。随后，用PBS将筛网漂洗数次，此后，将在共50ml PBS中的细胞转移到Falcon试管中，以300xg离心10分钟。弃去上清液，将细胞重悬在20毫升PBS中，再以300xg离心10分钟。将细胞重悬在5-10毫升介质中后，确定细胞计数，用介质调整到2.5×106细胞/ml。
c)刺激小鼠脾细胞在37℃，5％二氧化碳下，在24孔平板的1毫升体积内刺激72小时。在总体积为1毫升的溶液(0.8ml介质RPMI，10％FCS，1％青霉素/链霉素)中刺激2×106个脾细胞。根据刺激剂的数量，每个检测试验混合下列组分800微升含2.5×106细胞/ml的介质100微升刺激剂(聚乙烯亚胺，0.5mg/ml)100微升PBS所有脾细胞刺激均以一式两份完成。
刺激结束后，将上清液转移到1.5ml反应试管中，将剩余的细胞通过以300xg离心10分钟分开。取出无细胞上清液，然后于-20℃储存至用ELISA测量γ干扰素时。
d)测量γ干扰素浓度用小鼠γ干扰素OptEIA-ELISA套盒(Pharmingen，Heidelberg，Germany)，按照制造商的说明，确定刺激上清液中γ干扰素的浓度。
结果列于
图1在小鼠脾细胞检测中，检测的聚乙烯亚胺表明有显著的γ干扰素诱导作用。
2.体内诱导γ干扰素a)小鼠管理20-22℃，将NMRI小鼠(HdsWinNMRI远系繁殖的，雌性，18-20克重，从Harlan/Winkelmann，Borchen，Germany获得)保持在能经受住压热器作用的木削线聚碳酸酯盒中，放在S2分离畜棚(空气湿度为50-60％)，处于在人工的白天/黑夜节律下(06:30-18:30光照，18:30-06:30为黑夜)。动物可以自由接近食物和水。
b)完成试验将动物随机分成各6只的两组。在其到达后，将小鼠在笼中保持3天，无需任何进一步处理。
将0.2ml待分析的物质腹膜内给药。完成下列处理方案1组安慰剂PBS
2组聚乙烯亚胺，H-LPEI，分子量(Mw)87000，C18酰基，3mol％，按照实施例3(0.1mg/小鼠)。
处理9小时后，杀死小鼠，用5毫升冰冷的PBS漂洗腹，得到腹膜细胞。
离心(16000xg，30秒，室温)浓缩细胞，此后，倒出上清液，用NucleoSpin RNA II试剂盒(Machery-Nagel，Düren，Germany)提取细胞中的总RNA。
为此，将细胞颗粒重悬在400微升RA1缓冲液(得自NucleoSpinRNA II试剂盒)中，然后冷冻于-80℃。在37℃融化后，为了降低其粘度，将混合物负载到NucleoSpin过滤器上，离心1分钟(16000xg，室温)。将300微升乙醇加入到滤液中，然后将混合物负载到NucleoSpin RNA柱上。离心(8000xg，30秒)后，取出上清液，使柱离心干燥(16000xg，1分钟)，用DNase I裂解DNA。为此，将90微升DNase反应缓冲液与10微升DNase I(均得自NucleoSpin RNA II试剂盒)混合，将95微升此溶液加到干燥滤纸上。保温15分钟(室温)后，将滤纸先用500微升RA2洗涤，然后用600微升RA3，随后用250微升RA3(得自NucleoSpin RNA II试剂盒)洗涤。为了完成洗涤，使用洗涤缓冲液，每次将柱以8000xg离心30秒，最后的洗涤步骤后，以16000xg离心2分钟。此后，用60微升无RNase蒸馏水洗脱RNA(16000xg，1分钟)。
用分光法测量RNA的量。
用随机六聚体(Random Hexamers)作为聚合酶反应的引物，通过反转录RNA合成cDNA。就此而言，使用TaqMan反转录试剂(AppliedBiosystems，Weiterstadt，Germany)。用100微升完成合成。
合成混合物的组成如下·1300-1500微克RNA·10微升RT缓冲液(10x)·22微升MgCl2(25mM)·5微升随机六聚体·2.5微升MultiScribe RT·2微升RNase抑制剂·20微升dNTP
·无RNase水(使总体积为100微升)将混合物在GeneAmp 2400 Thermocycler(Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)中保温，开始在25℃10分钟，然后48℃30分钟；然后冷却到4℃。将用此方法合成的cDNA于-20℃储存。
用ABI PRISM5700(Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)完成定量PCR。将鼠γ干扰素(Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)PDAR试剂盒(预发展的TaqMan检测试剂)用于此目的。
借助管家(housekeeping)基因(18S RNA)，“内源控制核糖体RNA对照(18S RNA)”用PDAR试剂盒使cDNA的量标准化。
用校对的cDNA标准化并计算诱导作用。该cDNA由来自11个不同小鼠的cDNA混合物组成，按照组1处理。
在每种情况下，均用50微升完成扩增，其组成如下内源18 S RNA对照·1ng cDNA·25微升2x TaqMan Universal PCR Master Mix·2.5微升18S RNA·无RNase水(使总体积为100微升)γ干扰素的检测·10ng cDNA·25微升2x TaqMan Universal PCR Master Mix·2.5微升γ干扰素引物·无RNase水(使总体积为100微升)50℃保温2分钟后，随后开始变性(95℃，10分钟)，然后进行45个循环的变性(94℃，15秒)，退火/延伸(60℃，1分钟)。用GeneAmp5700 Sequence Detection System software(v.13)分析产物。
得到下列结果用聚乙烯亚胺H-LPEI，分子量(Mw)87000，C18酰基，3mol％处理9小时后，体内诱导了γ干扰素的表达(参见图2)。根据动物的不同，这种诱导作用比标准高16-120倍。另一方面，未处理的动物，或者用PBS处理的动物，表达的γ干扰素是标准的0.9-7倍。
3.在Aujeszky小鼠模型中检测免疫刺激作用Aujeszky小鼠模型是用于检测不同免疫刺激剂(例如BAYPAMUN和CpG-寡核苷酸)之作用的体内压力模型。
a)小鼠管理20-22℃，将NMRI小鼠(HdsWinNMRI远系繁殖的，雌性，18-20克重，从Harlan/Winkelmann，Borchen，Germany获得)保持在能经受住压热器作用的木削线聚碳酸酯盒中，放在S2分离畜棚(空气湿度为50-60％)，处于在人工的白天/黑夜节律下(06:30-18:30光照，18:30-06:30为黑夜)。动物可以自由接近食物和水。
b)压力模型为了研究，每组含10只小鼠。任何一组的动物都接受相同的检测物质。
在动物到达后，将小鼠在笼中保持2-3天。随后，用生理氯化钠溶液(pH7.6)以1∶10和1∶100稀释聚乙烯亚胺(起始浓度为0.5mg/ml)。将这些溶液以0.2ml/小鼠的比例腹膜内给药。
处理24小时后，通过腹膜内施用假狂犬病病毒Hannover H2病毒株对小鼠产生压力。为此，用PBS稀释病毒，使压力滴度为103.8-104.1TCID50/ml，然后施用0.2ml此悬浮液。
作为阴性对照，一组小鼠用生理氯化钠溶液处理，然后给予压力。
在给予压力后3-8天，该组小鼠死亡。大部分聚乙烯亚胺处理小鼠，用假狂犬病病毒感染后存活。给予压力后10天终止试验。
通过比较在氯化钠对照组已死亡的小鼠与检测组的小组来确定诱导的免疫刺激强度，然后通过效力指数定量。用免于Aujeszky病毒致死作用的小鼠百分比数作为用待测物质免疫刺激的结果加以说明。用下列公式计算EI＝(b-a)/b×100在该公式中，b代表对照组中死亡的小鼠百分比，a代表检测组中死亡的小鼠百分比。
结果(参见图3)
用Aujeszky小鼠模型检测不同浓度聚乙烯亚胺令人惊奇地发现·在用0.1或0.01mg H-LPEI，分子量87000，C18酰基，3mol％或者H-LPEI，分子量87000，CDC酰基，3mol％处理小鼠后，在所表明的每种情况，都有显著免疫刺激作用，效力指数≥60％。
·在用两种不同浓度聚乙烯亚胺H-LPEI，分子量87000，C18酰基，3mol％或者H-LPEI，分子量87000，CDC酰基时，在每种情况都表明了剂量/效用关系。
4.用PIQORTMcDNA排列系统分析H-LPEI，分子量87000，C18酰基，3mol％或者H-LPEI，分子量87000，CDC酰基对鼠腹膜细胞(体内)基因表达的影响a)动物管理在试验开始前8天，从Charles River公司(Sulzfeld，Germany)获得NMRI小鼠(远系繁殖的，雌性，18-20克重)。动物可自由接近食物和水，并饲养在人工的白天/黑夜节律下(07:00-19:00光照，19:00-07:00为黑夜)。
b)试验过程将动物随机分成3组，每组4只动物。将0.2ml待分析物质经腹膜内施用。所用的处理方案如下1组安慰剂生理氯化钠溶液2组聚乙烯亚胺，H-LPEI，分子量87000，C18酰基，3mol％(0.1mg/小鼠)3组聚乙烯亚胺，H-LPEI，分子量87000，CDC酰基，3mol％(0.1mg/小鼠)处理6小时后杀死小鼠，通过用10毫升介质(DMEM，5％FCS)灌洗腹来分离腹膜细胞。
随后，离心(300xg，10分钟，室温)浓缩细胞，然后要么立即提取RNA，要么首先进行红细胞溶胞。
红细胞溶胞为了进行红细胞溶胞，将沉淀的腹膜细胞重悬在1毫升PBS中，此后，加入10毫升溶胞缓冲液(10ml 0.17M Tris，pH7.2+90ml0.16M NH4Cl，pH7.2)，然后将混合物在室温保温10分钟。然后以300xg离心10分钟。弃去上清液，用10ml PBS洗涤细胞，然后再离心一次(300xg，10分钟)。
制备总RNA用RNeasy小试剂盒(QIAGEN，Hilden，Germany)，按照制造商的说明，从腹膜细胞制备总RNA。就此而言，将每种情况下的两批产物混合整理。
来自每种情况4只动物腹膜细胞的总RNA产率为10至20微克RNA。
RNA的中间扩增用基于Eberwine等人(1992)的方法完成RNA的中间扩增。这包括从总RNA制品扩增mRNA。
cDNA排列用来自Memorec Stoffel GmbH(Cologne，Germany)的PIQORTMcDNA排列系统分析诱导和表达的基因。就此而言，将来自免疫相关基因(白细胞介素、分化簇(CDs)、转录因子、受体等)的cDNA负载到芯片上。
用扩增的RNA进行杂交。在每种情况下，在一个RT反应中将2微克扩增的RNA转录成cDNA，同时掺入荧光标记的核苷酸。对照用Cy3标记，同时用Cy5标记样品。
按照制造商说明的方法(PIQORTMcDNA排列系统，2.6版，2000年2月)完成下列杂交，并评估
在评估杂交信号时，只分析在被比较的每种情况中，至少一个样品(分别为Cy3和Cy5信号)信号高于两个阴性对照(盐和herringsperm DNA)平均值至少2倍的那些信号。只对差异表达高于2倍的基因信号确定基因表达。
结果下列表格总结了cDNA分析。在(A)中，大于2.0的值表示相应mRNA的表达特异性增加，而在(B)中，小于-2.0的值表示抑制。用聚乙烯亚胺刺激后，特别过表达了抗炎症或抗细胞程序死亡因子(antiapoptotic factors)。白细胞介素-1受体2型的表达增加极高，对此，文献归结为强抗炎作用(Brown et al.，1996；Bossu et al.，1995)。FERHA(铁蛋白重链mRNA)的表达被描述为是抗炎或抗细胞程序死亡的(Weiss et al.，1997；Oberle & Schroder，1997)。MCL-1增加到2.88还表明所述聚合物有抗细胞程序死亡作用(Fujise et al.，2000)。在鼠腹膜细胞(体内)中，用PIQORTMcDNA排列系统分析聚乙烯亚胺H-LPEI，分子量87000，C18酰基，3mol％和H-LPEI，分子量87000，CDC酰基，3mol％对基因表达的作用A)诱导的基因
B)抑制的基因
文献清单Bossu，P.，Visconti，U.，Ruggiero，P.，Macchia，G.，Muda，M.，Bertini，R.，Bizzarri，C.，Colagrande，A.，Sabbatini，V.& Maurizi，G.(1995) Transfected pe IIinterleukin-l receptor impairs responsiveness of human keratinocytes to inteueukin-1. Am.J.Pathol.，147，1852-1861.
Brown，E.A.，Dare，H.A.，Marsh，C.B.& Wewers，M.D.(1996)The combination ofendotoxin and dexamethasone induces type II interleukin 1 receptor (IL-1r II) inmonocytesa comparison to interleukin 1 beta(IL-1 beta)and interleukin 1 receptorantagonist(IL-1ra).Cytokine.，8，828-836.
Eberwine，J.，Yeh，H.，Miyashiro，K.，Cao，Y.，Nair，S.，Finnell，R.，Zettel，M.&Coleman，P.(1992)Analysis of gene expression in single live neurons.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89，3010-3014.
Elkins，K.L.，Rhinehart-Jones，T.R.，Stibitz，S.，Conover，J.S.& Klinman，D.M.(1999)Bacterial DNA containing CpG motifs stimulates lymphocyte-dependentprotection of mice against lethal infection with intracellular bacteria.J.Immunol.，162，2291-2298.
Fujise，K.，Zhang，D.，Liu，J.& Yeh，E.T.(2000)Regulation of Apoptosis and CellCycle Progression by MCL1.J.Biol.Chem.，275，39458-39465.
Klinman，D.M.，Verthelyi，D.，Takeshita，F.&Ishii，K.J.(1999)Immune recognitionof foreign DNAa cure for bioterrorism？Immunity，11，123-129.
Krieg，A.M.(2000)The role of CpG motifs in innate immunity.Curr.Opin.Immunol.，12，35-43.
Krieg，A.M.，Love-Homan，L.，Yi，A.K.& Harty，J.T.(1998)CpG DNA inducessustained IL-12 expression in vivo and resistance to Listeria monocytogeneschallenge.J.Immunol.，161，2428-2434.
Lucin，P.，Jonjic，S.，Messerle，M.，Polic，B.，Hengel，H. & Koszinowski，U.H.(1994)Late phase inhibition of murine cytomegalovirus replication by synergisticaction of interferon-gamma and tumour necrosis factor.J.Gen.Virol.，75，101-110.
March，J.，Advanced Organic Chemistry，Wiley，New York，4. Auflage，1992.
Oberle，S.& Schroder，H.(1997)Ferritin may mediate SIN-1-induced protectionagainst oxidative stress.Nitric.Oxide.，1，308-314.
Oxenius，A.，Martinic，M.M.，Hengartner，H. & Klenerman，P.(1999)CpG-containing oligonucleotides are efficient adjuvants for induction of protectiveantiviral immune responses with T-cell peptide vaccines.J. Virol.，73，4120-4126.
Rivas，B.L.，Ananias，S.I.(1992)Synthesis and characterization of poly(N-propionyl)iminoethylene.Polymer Bull.，28，3-8.
Smith，P.M.，Wolcott，R.M.，Chervenak，R.& Jennings，S.R.(1994)Control of acutecutaneous herpes simplex virus infectionT cell-mediated viral clearance isdependent upon interferon-gamma(IFN-gamma).Virology，202，76-88.
Steinmassl，M.&Wolf，G.(1990)Bildung der Zytokine Interleukin 2 und Interferonalpha durch mononuklere Blutzellen des Schweines nach in vitro Stimulierung mitverschiedenen Virusprparaten. Zbl Vet Med，37，321-331.
Walker，P.S.，Scharton-Kersten，T.，Krieg，A.M.，Love-Homan，L.，Rowton， E.D.，Udey，M.C.&Vogel，J.C.(1999)Immunostimulatory oligodeoxynucleotidespromote protective immunity and provide systemic therapy for leishmaniasis via IL-12-and IFN-gamma-dependent mechanisms.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，96，6970-6975.
Walker，S.，Sofia，M.J.，Axelrod H.R.(1998)Chemistry and cellular aspects ofcationic facial amphiphiles.Advanced Drug Delivery Reviews，30，61-71.
Weiss，G.，Bogdan，C.& Hentze，M.W.(1997)Pathways for the regulation ofmacrophage iron metabolism by the anti-inflammatory cytokines IL-4 and IL-13.J.Immunol.，158，420-425.
Zimmermarm，S.，Egeter，O.，Hausmann，S.，Lipford，G.B.，Rocken，M.，Wagner，H.& Heeg，K.(1998) CpG oligodeoxynucleotides trigger protective and curative Th1responses in lethal murine leishmaniasis.J.Immunol.，160，3627-3630.
权利要求
1.含多胺作为活性物质的药物。
2.权利要求1的药物，其特征在于所述多胺具有疏水取代基。
3.权利要求2的药物，其特征在于所述取代基作为侧连或者末端排列。
4.权利要求2或3的药物，其特征在于所述取代基是烷基链、酰基链或者类固醇样取代基，还可以是疏水取代基，所述疏水取代基可通过将多胺主链的氮功能加到异氰酸酯或者α，β-不饱和羰基化合物上而引入。
5.权利要求1至4任一项的药物，其特征在于所述聚合物是聚乙烯亚胺。
6.权利要求5的药物，其特征在于所述聚乙烯亚胺具有下列通式 其中，在每个[CH2-CH2-N]单位中，R1表示氢、甲基或乙基，和R2表示有1-23个碳原子的烷基，而且其中R3和R4(末端基团)彼此独立地表示氢和具有1-24个碳原子的烷基，或者具有取决于引发剂的结构，R5(末端基团)是取决于终止反应的取代基，平均聚合度P＝(m+n)为45至5250，且n＝a×P，其中0.0001＜a＜0.1，单位m和n随机分布在聚合物中。
7.权利要求5的药物，其特征在于所述聚乙烯亚胺具有下列通式 其中，在每个[CH2-CH2-N]单位中，R1表示氢、甲基或乙基，和R2表示有1-22个碳原子的烷基，而且其中R3和R4(末端基团)彼此独立地表示氢和具有1-24个碳原子的烷基，或者具有取决于引发剂的结构，R5(末端基团)是取决于终止反应的取代基，平均聚合度P＝(m+n)为45至5250，且n＝a×P，其中0.0001＜a＜0.1，单位m和n是随机分布在聚合物中。
8.权利要求5的药物，其特征在于所述聚乙烯亚胺具有下列通式 其中，在每个[CH2-CH2-N]单位中，R1、R2和R3表示氢或羟基，而且其中R4和R5(末端基团)彼此独立地表示氢或者类固醇母体物质，特别是胆汁酸，或者具有取决于引发剂的结构，R6(末端基团)是取决于终止反应的取代基，平均聚合度P＝(m+n)为45至5250，且n＝a×P，其中0.0001＜a＜0.1，单位m和n是随机分布在聚合物中。
9.权利要求5的药物，其特征在于所述聚乙烯亚胺具有下列通式 其中，在每个[CH2-CH2-N]单位中，R1表示OR4或NR4R5，而且R4和R5彼此独立地表示氢或者具有1-24个碳原子的烷基，而且其中R2和R3(末端基团)彼此独立地相应于聚合物主链氮原子的取代基或者具有取决于引发剂的结构，R6(末端基团)是取决于终止反应的取代基，平均聚合度P＝(m+n)为45至5250，且n＝a×P，其中0.0001＜a＜0.1，单位m和n是随机分布在聚合物中。
10.权利要求5的药物，其特征在于所述聚乙烯亚胺具有下列通式 其中，在每个[CH2-CH2-N]单位中，R1表示有1-24个碳原子的烷基，而且其中R2和R3(末端基团)彼此独立地相应于聚合物主链氮原子的取代基或者具有取决于引发剂的结构，R4(末端基团)是取决于终止反应的取代基，平均聚合度P＝(m+n)为45至5250，且n＝a×P，其中0.001＜a＜0.1，单位m和n是随机分布在聚合物中。
11.权利要求5的药物，其特征在于所述聚乙烯亚胺具有下列通式 其中，在每个[CH2-CH2-N]单位中，R可以是氢或者具有下式基团 其中Rx可以是氢或同样也是R型基团，且其中每个[CH2-CH2-N]单位和末端基团可携带权利要求8-13中提及的取代基，平均聚合度P＝(m+n)为45至5250。
12.权利要求1-11任一项的药物，其特征在于所述多胺的分子量低于220000g/mol。
13.权利要求12的药物，其特征在于所述多胺的分子量为2000至100000g/mol。
14.权利要求1-13任一项的药物，其特征在于所述多胺与细胞特异性配体结合。
15.权利要求1-14任一项的药物，其特征在于所述药物还含有制剂辅料。
16.用作药物权利要求1-14任一项中的多胺。
17.权利要求1-14的多胺用于生产免疫刺激药物的应用。
18.权利要求1-14的多胺用于生产治疗病毒感染或者用于预防病毒感染的药物的应用。
19.权利要求18的应用，其特征在于所述感染是乳头瘤病毒、疱疹类病毒、肝炎病毒或HIV感染。
20.权利要求18中的应用，其特征在于所述感染是呼吸道或内部器官感染。
21.权利要求18中的应用，其特征在于所述预防是预防因压力或者手术后或牙治疗后的感染。
22.权利要求1-14的多胺用于生产治疗细菌感染的药物的应用。
23.权利要求1-14的多胺用于生产治疗癌症或肿瘤的药物的应用。
24.权利要求1-14的多胺用于生产治疗器官纤维化或者预防器官纤维化的药物的应用。
25.权利要求1-14的多胺用于生产治疗伴随有胶原蛋白沉积增加的疾病之药物的应用。
26.权利要求1-14的多胺用于生产治疗炎症，内部器官、皮肤、血液或中枢神经系统或其附件包括眼睛的退化或增殖性疾病的药物的应用。
27.权利要求1-14的多胺用于生产治疗过敏性疾病，特别是治疗哮喘的药物的应用。
28.权利要求1-14的多胺作为佐剂的应用。
全文摘要
本发明涉及含多胺作为活性物质的药物，以及多胺生产免疫刺激药物的用途或者多胺作为治疗和/或预防各种人或动物疾病之药物的用途。
文档编号A61P31/04GK1507349SQ01822939
公开日2004年6月23日 申请日期2001年12月19日 优先权日2000年12月29日
发明者T·施拉普, S·M·弗里德里希斯, M·沃尔默, , T 施拉普, 弗里德里希斯 申请人:拜尔公司