一种急性髓系白血病肿瘤标志物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤标志物技术领域，尤其涉及一种急性髓系白血病肿瘤标志物及其应用。
【背景技术】
[0002]急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)是一种异质性髓细胞肿瘤，也称急性非淋巴细胞性白血病，常进展迅速，其特点是由造血干细胞恶变而形成的原始细胞克隆取代了正常骨髓造血。由于白血病细胞代替了正常血细胞，它们不具备正常血细胞的功能，由此导致贫血，血小板和粒细胞减少而引发一系列并发症。若不经过治疗，存活期一般不超过半年。有的病例从诊断到死亡，甚至不过一周，死亡的主要原因是出血和感染。AML是最常见的急性白血病，患者通常为成年人，同时它的发病率随着年龄的增长而增加。尽管白血病是一种相对比较罕见的疾病(大约占癌症死亡人数的1.2% )，但是它的发病率将可能会随着人口老龄化的增加而增加。白血病的症状是由于正常骨髓细胞被白血病细胞所替代，一些白血病相关的危险因素及染色体异常已被确定，但具体发病原因尚不清楚。如今，几乎所有治疗AML的主要治疗方案的第一步是诱导治疗，它是指使白血病细胞数量减少到检测不到的水平以达到完全缓解AML的目的。目前标准化疗可以获得约70?80%的完全缓解(Complete Remiss1n, CR)率，但大部分CR后的患者终将复发，甚至一部分患者难以达到CR而成为难治性白血病，治疗无效而死亡。
[0003]白血病是一类造血细胞异常的恶性疾病，白血病细胞失去继续分化成熟的能力停滞在细胞发育的不同阶段，不断增生影响机体正常功能。所以，白血病患者的鞘糖脂与健康人相比是否会有差别是大家关注的热点，Cooling等曾报道在急性非淋巴细胞白血病患者外周血所分离得到的白血病细胞中会有鞘糖脂的异常表达，并涉及人髓细胞成熟过程中相关鞘糖脂的变化。在体外，ATRA、PMA等药物诱导可以导致白血病细胞系HL-60、NB4产生分化现象，人们同样关注了体外药物诱导产生白血病细胞分化前后的鞘糖脂变化，这些实验结果表明，鞘糖脂在白血病的整个发病过程中都发挥着重要的作用，甚至这些发生明显变化的鞘糖脂可以作为白血病的生物标志物。因此，寻找和确定急性髓系白血病的肿瘤标志物对于该疾病的诊断和治疗具有重要价值。
【发明内容】
[0004]本发明人经研究发现Lacto系列鞘糖脂在急性髓系白血病患者的骨髓组织和血清中存在高表达的现象，因此能够作为急性髓系白血病的肿瘤标记物，本发明基于上述发现完成。
[0005]本发明的目的在于提供一种急性髓系白血病肿瘤标志物，其作为急性髓系白血病诊断的标志性物质，能够明确清楚地表征急性髓系白血病疾病的发生。
[0006]本发明包括以下内容:
[0007]本发明提供一种急性髓系白血病肿瘤标志物，其为Lacto系列鞘糖脂。
[0008]作为本发明的优选，所述Lacto系列鞘糖脂的结构式如下任一项或多项所示:
[0009]Gal-a 4_Gal_ β 4-Gal β -Cer ；
[0010]Gal-β 3-GlcNAc-β 3-Gal-β 4~Glc β -Cer ；
[0011]Gal-β 4-GlcNAc-β 3-Gal-β 4~Glc β -Cer ；
[0012]其中，Gal代表半乳糖，GlcNAc代表N-乙酰葡萄糖，Glc代表葡萄糖，Cer代表N-脂酰鞘氨醇。
[0013]上述结构式表示的Lacto系列鞘糖脂依次称为Lc3、Lc4和nLc4。
[0014]作为本发明的优选，所述所述Lacto系列鞘糖脂的结构和/或组成通过质谱方法确定。
[0015]本发明还提供上述的肿瘤标志物在制备与其结合的特异性结合物中的应用。
[0016]所述特异性结合物，比如可以是抗所述肿瘤标志物的单克隆抗体或者多克隆抗体等。所述单克隆抗体或者多克隆抗体可以是完整的抗体，也可以是具有结合位点的部分抗体片段。
[0017]优选地，所述特异性结合物为抗所述肿瘤标志物的抗体。也就是说，本发明的急性髓系白血病肿瘤标志物可以作为制备抗所述急性髓系白血病肿瘤标志物的抗体的抗原使用。
[0018]本发明的有益效果为:发现Lacto系列鞘糖脂在急性髓系白血病患者的骨髓组织和血清中存在特异性高表达的现象，而在正常组织中没有这种特异性高表达现象，因此能够作为急性髓系白血病的肿瘤标志物，通过质谱检测Lacto系列鞘糖脂的表达量可以快速、准确及清楚的确定急性髓系白血病的发生。
【附图说明】
[0019]图1为Lacto系列鞘糖脂在一级质谱下的图谱，其中A为急性髓系白血病患者骨髓样本鞘糖脂一级质谱图谱，B为正常对照骨髓样本鞘糖脂一级质谱图谱，其中m/z 1100和 1120 为 LacCer 鞘糖脂，m/z 1214.3 和 1326.3 为 Gb3 鞘糖脂，m/z 1255.3 和 1368.3 为Lc3鞘糖脂，m/z 1460.0为Lc4或者nLc4鞘糖脂。
[0020]图2为Lacto系列鞘糖脂在AML病人中高表达的结果图(其中***表示p〈0.001)。
【具体实施方式】
[0021]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
[0022]收集临床骨髓样本或血液样本，取相同量置于玻璃试管中，向试管中加入ImL提取剂A(二氯甲烷:甲醇=1:1(ν/ν))，涡旋振荡使其混匀，超声提取lh，然后将试管2000rpm离心lOmin，小心吸取上清置于新的干净试管中，所剩沉淀继续加入ImL提取剂A，超声提取Ih,重复4遍。将上述所剩沉淀继续加入ImL提取剂B (异丙醇:正己烷:水=55:25:20 (v/v/v)),润旋振荡使其混勻，置于超声波设备中超声提取Ih,同样2000rpm离心1min,小心吸取上清置于新的干净试管中，所剩沉淀继续加入ImL提取剂B超声提取lh，重复4遍。将上述收集到的上清通过真空浓缩干燥机进行干燥，最后得到微量的固体。
[0023]利用Sephadex层析分离法分离中性、酸性鞘糖脂。将Sephadex填料装到玻璃柱中(柱体积约3mL),以15mL氯仿:甲醇:水=30:60:10 (v/v/v)混合溶剂洗柱,用上述溶剂溶解样品，少量即可，500 μ L左右。将溶解的样品加入到柱子上，同样加入1mL上述溶剂洗脱，收集即为中性鞘糖脂。中性鞘糖脂就可以经甲基化反应后质谱检测，酸性鞘糖脂需经过透析脱盐后再进行甲基化反应质谱检测。
[0024]将所得干燥的鞘糖脂固体加入150 μ L DMSO溶解，避免水分进入，水分会影响甲基化反应。将研磨成粉末的NaOH固体加入到试管中，覆盖试管底部即刻，要求迅速，避免固体NaOH粉末吸潮。快速加入150 μ L碘甲烧，立即用铝箔，封口膜封口，避免空气中的水分进入影响反应。置于水平摇床上以最大转速运行lh，然后加入ImL超纯水终止反应，使沉淀完全溶解。在试管中加入2mL 二氯甲烷，可以看到液体分为两层，下层为二氯甲烷，上次为水，吹打液体，使两相液体混合，弃去水相，再加入干净的超纯水，重复之前的操作至少十遍以上，清洗二氯甲烷相中的杂质。将干净的二氯甲烷与水相尽量分开，然后将二氯甲烷干燥，加入甲醇溶解即可进行质谱检测。
[0025]运用电喷雾线性离子阱质谱仪在正离子模式下对甲基化的鞘糖脂进行MS和MSn分析，直接注入鞘糖脂样品的甲醇溶液进行检测，各项参数设置为:流速0.30 μ L/min，毛细管温度230°C，鞘气流速2arb，喷雾电压3.50kV,毛细管电压28.0OkV,注射时间100.00ms，活化时间30ms，激活Q值0.250，m/z隔离宽度1.5。使用前驱离子达到最小丰度的标准化能量进行碰撞，所检测到的离子都是Na离子复合物。Lacto系列鞘糖脂的一级质谱图谱如图1所示，A为急性髓系白血病患者骨髓样本鞘糖脂一级质谱图谱，B为正常对照骨髓样本鞘糖脂一级质谱图谱，其中m/z 1100和1120为LacCer鞘糖脂，m/z 1214.3 和 1326.3 为 Gb3 鞘糖脂，m/z 1255.3 和 1368.3 为 Lc3 鞘糖脂，m/z 1460.0 %Lc4或者nLc4鞘糖脂。经过对16例正常骨髓样本和106例AML病人的质谱图谱进行采用Student-Newman-Keulsa, b 检验分析数据，用 GraphPad Prism 5 软件(GraphPad SoftwareInc.)作统计分析,发现他们之间是有统计学意义的(p〈0.001,图2)。图2显示Lacto系列鞘糖脂在急性髓系白血病患者的骨髓组织和血清中存在特异性高表达的现象，而在正常组织中没有这种特异性高表达现象，提示这类鞘糖脂在急性髓系白血病的发生和发展中的重要作用。进一步，可以把这类鞘糖脂的含量作为急性髓系白血病的一种诊断标志物，有助于急性髓系白血病的早期预防和治疗，对预后也有很大的帮助。因此本发明所述Lacto系列鞘糖脂能够作为急性髓系白血病的肿瘤标志物，通过质谱检测Lacto系列鞘糖脂的表达量可以快速、准确及清楚的确定急性髓系白血病的发生。
[0026]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1.一种急性髓系白血病肿瘤标志物，其为LactO系列鞘糖脂。
2.根据权利要求1所述的肿瘤标志物，其特征在于，所述Lacto系列鞘糖脂的结构式如下任一项或多项所示:Gal- a 4-Gal-β 4-Galβ -Cer ；Gal-β 3-GlcNAc-β 3-Gal-β 4_Glcβ -Cer ；Gal-β 4-GlcNAc-β 3-Gal-β 4-Glcβ -Cer ； 其中，Gal代表半乳糖，GlcNAc代表N-乙酰葡萄糖，Glc代表葡萄糖，Cer代表N-脂酰鞘氨醇。
3.根据权利要求1或2所述的肿瘤标志物，其特征在于，所述所述Lacto系列鞘糖脂的结构和/或组成通过质谱方法确定。
4.如权利要求1-3任一项所述的肿瘤标志物在制备与其结合的特异性结合物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述特异性结合物为抗所述肿瘤标志物的抗体。
【专利摘要】本发明涉及一种急性髓系白血病肿瘤标志物及其应用。所述急性髓系白血病肿瘤标志物为Lacto系列鞘糖脂。具体地，所述Lacto系列鞘糖脂的结构式如下任一项或多项所示：Gal-α4-Gal-β4-Galβ-Cer；Gal-β3-GlcNAc-β3-Gal-β4-Glcβ-Cer；Gal-β4-GlcNAc-β3-Gal-β4-Glcβ-Cer；其中，Gal代表半乳糖，GlcNAc代表N-乙酰葡萄糖，Glc代表葡萄糖，Cer代表N-脂酰鞘氨醇。本发明能够用于急性髓系白血病的明确清楚的表征。
【IPC分类】G01N33-92, G01N27-62
【公开号】CN104698060
【申请号】CN201310647095
【发明人】吴忠福, 李云森, 许秀坤
【申请人】苏州中赢医疗科技有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年12月4日