专利名称：向日葵茎溃疡病菌实时荧光pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术，具体的说涉及向日葵茎溃疡病菌检测用试剂盒。
背景技术：
1975年美国最先报道了向日葵莖溃瘍病(Phomopsis helianthiM. Muntanola-Cvetkovic et al.)的危害性，明尼苏达州因此病减产60%。1979-1982年南斯拉夫该病大发生，产量损失50%以上，感病种子的发芽率、百粒重、油产量和质量降低。1981-1986年匈牙利、罗马尼亚、法国相继报道了该病的发生情况。近几年来，意大利、保加利亚，原捷克斯洛伐克，美国，加拿大和阿根廷等国都报道过该病的大发生。原苏联于1985年，在乌克兰外喀尔巴阡州乌日哥罗德区在向日葵杂交种索耳道尔上首次发现此病，1988-1989年在摩尔达瓦大部分地区，乌克兰的外喀尔巴阡州，敖德萨州和基洛夫格勒州也发现了该病，此病在大多数向日葵种植国家流行，给向日葵生产造成极大危害。此病可造成茎部溃疡，植株枯萎，茎杆弱，易倒伏。病株花盘小，种子轻。1980-1981年在前南斯拉夫沃尔丁那，病株率20% -94%,病株籽粒产量不及健株一半。国内外对此病菌的研究较少，2001年，Veronique等人用AFLP分析了该病菌的系统发育；2004年，Mariarosaria等人用PCR, RFLP和Southern杂交技术,检验了该菌的遗传生物型和流行病学差异之间的关系；2007年，Mara等人研究了该病菌的病原形态、生物学特性及品种抗病性。到目前为止还没有特别有效的化学药剂或抗性品种来防治此病，由于向日葵茎溃疡病菌主要通过向日葵种苗进行传播，所以目前主要控制方法是通过对进境向日葵种苗进行检验检疫。目前国内外未见有关该病菌的检测试剂盒研究的报道。因此，有必要建立一种准确率和灵敏度均高的快速检测试剂盒来检测向日葵茎溃疡病菌。由于该病是我国的检疫性病害，因此在我国检疫是主要控制此病害的手段，严格限制或禁止从发生此病害的国家和地区进口向日葵种苗，从其它国家进口的向日葵种苗也必须在口岸检验检疫局进行检验。目前国内外 检测向日葵茎溃疡病菌所采取的手段主要是1.种植观察将进境的向日葵种苗按照检验检疫机构的要求进行隔离种植，在种植期间定期观察有无表现向日葵茎溃疡病菌的典型症状。此法只能作为初步判断，且费工、费时、结果判断的准确率低。2.分离培养将进境的向日葵种苗在培养基上进行分离纯化，检测周期长，经验性强，阳性样品确定难度大，灵敏度不高。随着我国对外开放不断发展，农产品进出口日益频繁，传带农业植物有害生物的机率进一步加大，有害生物的危害性进一步增强。向日葵自上世纪以来迅速发展，国内外调种批次多，数量大，来源复杂，检疫问题非常突出。自2000年以来，我国每年从美国、德国等地引进大量向日葵种子，进口的数/重量均位居进境植物繁殖材料的前列，口岸检验检疫局每年从进口的向日葵种子检出多种有害生物。但目前我国各口岸检验检疫机构缺乏对向日葵茎溃疡病菌的有效检测试剂盒。病害防治、预测预报及植物检疫需要有准确快速的检测试剂盒，尤其是需要我国拥有自主知识产权的检测试剂盒，从而可以将之投入到商业生产和应用中，目前国内外在这一领域还没有向日葵茎溃疡病菌实时荧光PCR检测试剂盒的报道。此项发明满足了这些需求。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中向日葵茎溃疡病菌的种植观察所需周期长、鉴定困难、准确率低等问题，提供向日葵茎溃疡病菌的快速检测试剂盒。本发明通过分析本实验室测序的结果和已报道的其他拟茎点霉病菌核糖体基因序列，设计引物和荧光探针。引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表PHDf&PHDr所示；探针的核苷酸序列如序列表PHDp所示,该探针一端标记有报告突光染料，另一端标记有淬灭突光染料。可用的报告突光染料有FAM/hex/tet/joe/vic/fitc/cy3/cy5,可用的萍灭突光染料有 TAMRA/rox/dabcyl/bhql/bhq2。根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记了两个荧光染料基团的核苷酸探针，例如将报告突光染料标记在探针的5'端,淬灭突光染料标记在探针的3'端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告 荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq DNA聚合酶具有5'端到3'端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对向日葵茎溃疡病菌的检测。本发明应用上述引物和探针进行实时荧光PCR检测，其以样品总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。具体的说本发明以样品总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应。即在25 μ L反应体系中加入 Real-time PCR MixlO μ L, 5 μ M 弓丨物(PHDf&PHDr)各 2 μ L, 2 μ M/L 的 PHDp5 μ L,样品DNA模板2ng。实时荧光PCR反应程序采用三步法第一步50°C，2min ;第二步95°C，IOmin ;然后进入第三步循环，95°C，10s,60°C，Imin共40个循环。本发明具有非常好的特异性和稳定性，检测方法快速简单，准确性和灵敏性高，为可能携带向日葵茎溃疡病菌植物材料的进出口安全提供了保证。
图1.本发明检测向日葵茎溃疡病菌结果图1.向日葵茎溃疡菌株一；2.向日葵茎溃疡菌株二；3-11.健康向日葵叶片和向日葵其他病害植株图2.本发明检测向日葵茎溃疡病菌灵敏度结果图1、5· 8 μ g，2、580ng，3、58ng，4、5· 8ng，5、580pg，6、58pg，7、5. 8pg，8、580fg，9、ofg
具体实施例方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例1引物及探针设计根据本实验室测序的结果和已报道的茎点霉核糖体基因序列，采用引物探针设计软件DNAMAN设计引物及探针，引物序列为PHDf :5’ -CGTTCAAAGATTCGATGA-3’PHDr :5’ -CAGTGGATCTCTGAGTAA-3’探针序列为PHDp:5’ -ACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTT-3’，该探针的 5，端标记为报告荧光染料FAM，3’端标记为淬灭荧光染料TAMRA。实施例2向日葵样品检测1.向日葵材料DNA的提取米用试剂盒法(TaKaRaUniversal Genomic DNA Extraction Kit Ver3. 0 或 DNAExtraction Kit for GMO Detection Ver. 2. 2)提取向日葵材料核酸。2.实时荧光PCR反应体系以向日葵材料总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应。在25 μ L 反应体系中加入 Real-time PCR MixlO μ L，5 μ M 引物(PHDf/PHDr)各2 μ L，2 μ Μ/L 的 PHDp5 μ L，样品 DNA 模板 2ng。3.实时荧光PCR反应条件将样品管放入Applied Biosystems7300荧光PCR仪后，设置反应程序第一步500C，2min ;第二步95°C，IOmin ;然后进入第三步循环，95°C，10s,60°C，lmin,共40个循环。每个循环结 束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。实施例3向日葵茎溃疡病菌实时荧光PCR检测试剂盒的特异性实验以向日葵茎溃疡菌株总DNA为模板，以健康向日葵叶片和向日葵其他病害植株为对照，通过实时荧光PCR检测荧光强度变化。实验结果向日葵茎溃疡菌株总DNA为模板，通过实时荧光PCR检测可观察到明显的荧光强度变化，而健康对照和向日葵其他病害植株的荧光强度没有变化，结果见图1。实施例4向日葵茎溃疡病菌实时荧光PCR检测试剂盒的灵敏度实验用三蒸水10倍稀释总DNA，进行相对灵敏度检测。在25 μ L反应体系中，总DNA分别为 5. 8 μ g，580ng, 58ng，5. 8ng，580pg, 58pg，5. 8pg，580fg,检测结果如图 2 所示，当核酸浓度低于580fg时仍然可以检测到荧光信号，说明能够检测的最低DNA浓度低于580fg。
权利要求
1.一种向日葵茎溃疡病菌检测用引物，其核苷酸序列为PHDf :5’ -CGTTCAAAGATTCGATGA-3’PHDr :5’ -CAGTGGATCTCTGAGTAA-3’。
2.一种与权利要求1所述引物配合使用的探针，其核苷酸序列为=PHDp 5’ -ACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTT-3’该探针的一端标记为报告荧光染料，另一端标记为淬灭荧光染料。
3.—种检测向日葵茎溃疡病菌的方法，其特征在于实时荧光PCR反应过程中的退火温度为60°C。
4.含有权利要求1所述引物的试剂盒。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其还包括权利要求2所述的探针。
全文摘要
本发明提供了一种向日葵茎溃疡病菌实时荧光PCR检测试剂盒。试剂盒所采用的引物核苷酸序列如序列表PHDf&PHDr所示，探针核苷酸序列如序列表PHDp所示。该试剂盒以样品总DNA为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。本发明具有非常好的特异性和稳定性，检测方法快速简单，准确性和灵敏性高，为可能携带向日葵茎溃疡病菌植物材料的进出口安全提供了保证。
文档编号C12N15/11GK103060436SQ20121043671
公开日2013年4月24日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者张祥林, 王翀, 陈燕, 刘彬 申请人:新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心