专利名称：高产木质纤维素降解酶的链霉菌人工锌指蛋白突变菌株及其获得方法
技术领域：
本发明涉及一种高产木质纤维素降解酶的链霉菌人工锌指蛋白突变菌株及其获得方法，属于微生物生物技术领域。
背景技术：
基因表达调控的多种生物过程，如发育、分化和疾病等都受细胞内转录因子的调节完成。为实现细胞代谢的定向调控，可使用人工设计的转录因子，定向调控细胞内相关革巴基因的表达。结合在特定基因启动子区域的人造转录因子(Artificial TranscriptionFactor, ATF)可以实现生物体内靶基因的表达调节，并且可根据需要实现不同强度的人为调节。人工转录因子的结构包括一个DNA结合域，一个转录调控域或效应区。其中DNA结合 域负责结合特定的目标基因的启动子，而效应域可以实现上调或下调不同靶基因的表达。因此，可以设计人工的DNA结合域和效应区，创建所需要的人工转录因子。锌指蛋白(Zinc finger protein, ZFP)是一类重要的转录因子,是指具有锌指结构的转录调控因子，在真核生物的胚胎发育、细胞分化、增强抗逆性、基因的表达调控等方面有重要作用。锌指结构是指在调节蛋白上的一个或多个依赖锌离子的DNA结合域，这个区域是由含有几个Cys残基的一小段氨基酸序列构成，其利用与锌离子结合进行自我折叠从而形成稳定的短的手指状结构。在锌指结构中，组氨酸和(或)半胱氨酸通过与锌的不同排列组合和疏水作用来组成并维持稳定的四面体结构。锌指结构既能与RNA和DNA结合，又能与DNA-RNA双链分子以及同类蛋白结合，在转录和翻译水平上调节和控制基因表达，因此在人工转录因子的构建中，锌指蛋白被认为是最有前途的DNA结合域。不同的蛋白结构对应不同的功能，根据锌指蛋白保守结构域的差异，可以将其分为C2H2 (Cys2His2)型、C4(Cys4)型和C6 (Cys6)型3个类群。C2H2型锌指是经典型锌指，是目前研究的最多、分布最广泛的锌指。酵母基因组中发现有55个锌指蛋白，其中31个属于C2H2型锌指。这些蛋白调节着胞内的众多代谢途径，包括糖的代谢、氨基酸代谢、呼吸作用、氮源利用以及对外界压力响应等。目前，人工锌指蛋白文库技术已经成功应用于多个领域，筛选到多种优良表型，例如，细胞分化，逆境抗性，表面抗原及新型药物筛选。该技术与传统的过表达和敲除方法相t匕，细胞的致死率小，重复性好，适用范围从真核细胞到原核细胞。韩国汉城大学学者(参考文献见Park KS, et al. , NatureBiotechnology, 2003，21:1208-1214)构建了人工锌指蛋白文库，转入酵母菌株中，获得了抗热激性和抗渗透性的突变菌株；转入大肠杆菌菌株内，获得了抗热激性，耐冷性和抗渗透性的表型，此外还获得了丁醇耐受性菌株，但目前还未有报道人工锌指蛋白文库技术在生物酶生产菌中的应用。在能源匮乏的当今社会，纤维素乙醇作为第二代生物燃料受到了广泛的重视，而纤维素乙醇生产的瓶颈正是如何高效的降解资源丰富的纤维素为可发酵糖。纤维素酶的生产成本目前仍然较高，限制了纤维素乙醇的大规模工业化生产，因此需要开发提高生产菌纤维素酶活的方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种高产木质纤维素降解酶的链霉菌人工锌指蛋白突变菌株及其获得方法，从海洋放线菌这一独特的菌种出发，筛选到有羧甲基纤维素酶(CMCase)和木聚糖酶酶活的菌株，利用人工锌指蛋白文库这一新颖的全局细胞转录因子，来调控链霉菌纤维素酶的表达，最终筛选到纤维素降解酶酶活提高的突变菌株。本发明采用的技术方案是一株高产木质纤维素降解酶的链霉菌人工锌指蛋白突变菌株Streptomyces sp,所述菌株的登记入册编号为CGMCC No. 6428,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年08月13日。所述链霉菌人工锌指蛋白突变菌株，其基因组中含有能够提高纤维素降解酶活性 的人工锌指蛋白基因，与不含有人工锌指蛋白基因的对照菌株相比，该菌株的木聚糖酶活性提闻11%，而且达到最闻酶活的时间提如两天，最闻酶活约为42. 8U/mL。所述的高产木质纤维素降解酶的链霉菌人工锌指蛋白突变菌株的获得方法为设计人工锌指蛋白表达载体，并通过遗传转化或者结合转移手段导入到受体细胞中，筛选酶活性提高的微生物突变体。具体步骤如下(I)用表达载体，如链霉菌表达载体PIB139连接插入片段约为800bp的锌指蛋白基因，构建人工锌指蛋白表达载体文库，人工锌指蛋白基因可为文献报道的人工合成基因(Nature Biotechnology, 2003 (21) : 1208-1214)，也可为细胞内源的锌指蛋白基因通过随机突变得到的基因；(2)将所获得的文库结合转移或转化至微生物酶生产菌种，如海洋链霉菌中，平板涂布，经鉴定文库合格后挑取平板上的单克隆于选择培养基，如木糖平板中培养；(3)选择酶活提高的突变体，如透明圈更大的突变体进行再次的酶活验证，获得酶活提高的突变体。本发明的有益效果是本发明中的技术方法可以应用于工业酶生产菌株的基因工程改造，提高菌株产酶性能；本发明中的突变菌株木聚糖酶生产能力较强，是一株有望应用于工业生产的木聚糖酶生产菌株。
图1是锌指蛋白文库DNA片段PCR产物琼脂糖电泳检测结果，箭头指示人工锌指蛋白基因片段。图2是锌指蛋白文库质粒图谱。图3是锌指蛋白文库突变菌株羧甲基纤维素酶降解能力比较结果。图4是锌指蛋白文库个别突变菌株液体发酵生产木聚糖酶结果。
具体实施例方式实验材料和试剂
1.菌株出发菌株链霉菌M8由本发明人从大连小平岛海泥样品中分离获得。2.生化试剂木聚糖山毛榉木聚糖、桦木木聚糖、燕麦木聚糖(美国SIGMA公司)；竣甲基纤维素纳(CMC-Na, Solarbio公司)Remazol Brilliant Blue (RBB,美国 SIGMA 公司)琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(
测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；TaKaRa rTaq (大连宝生物工程有限公司)；IOxPCR Buffer (大连宝生物工程有限公司)；dNTP Mixture (大连宝生物工程有限公司)；E. Z. N. A. TM琼脂糖凝胶回收试剂盒(OMEGA, USA)Xba1、EcoRI限制性连接酶，DNA连接酶(大连宝生物工程有限公司)。提取菌株基因组DNA试剂洗涤液50mmol/LTris, 25mmol/L EDTA, 0. 1%PVP, pH=8. 0。裂解液50mmol/LTris, 25mmol/L EDTA,1. 2%PVP, 3%SDS。抽取液10mmol/LTris, lmmol/L EDTA, 0. 3mmol/L NaAC, pH=8. O0提取液苯酚氯仿异戊醇=25:24:1。TE 缓冲液50mmol/L Tris, pH=8. O。DNS试剂配方甲液溶解6. 9g结晶酚于15. 2mL 10%的NaOH中，用蒸馏水稀释至69mL，再加入
6.9g NaHSO3 ；乙液称取255g酒石酸钾钠，加入至300mL 10%Na0H中，再向其中加入880mLl%3, 5- 二硝基水杨酸溶液；将甲乙两液相混即得到黄色DNS试剂，贮存于棕色试剂瓶中。在常温下，放置7-10天后使用，半年内有效。3.培养基(每IL体积计算)Bennett固体培养基葡萄糖IOg,蛋白胨2g,酵母粉lg，牛肉膏Ig,琼脂20g,pH7. O。ISP4 固体培养基可溶性淀粉 10g, K2HPO4 3H20 lg, MgSO4 7H20 lg, NaCl lg,(NH4) 2S04 2g, CaCO3 2g, FeSO4 7H20 lmg, MnCl2 lmg, ZnSO4 7H20 lmg, pH 7. ORBB-木聚糖
固体培养基含有0. 2%RBB-木聚糖的ISP4固体培养基。刚果红固体培养基=(NH4)2SO4 2g ；MgS04 0. 5g ;K2HPO4 Ig ；NaCl 0. 5g ；CMC-Na20g ;琼脂20g。将培养过的平板置于lg/L的刚果红溶液中I小时，再用lmol/L的NaCl溶液冲洗至流出液为无色。TSB液体培养基胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3. 0g，葡萄糖2. 5g, K2HPO4 *3H202. 5g，NaCl 5g, pH 7. 0。MS固体培养基甘露醇20g，豆粉20g，琼脂20g。木聚糖酶产酶培养基=K2HPO4 3H201. llg, KH2PO4 3. 65g，(NH4)2NO3 3g，MgSO4 7H202. 2g，CaCl2 0. 3g，葡萄糖1. 5g，蛋白胨2. 5g，牛肉膏3g，山毛榉木聚糖IOg, pH6.50说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1 海洋链霉菌锌指蛋白文库构建本发明涉及的人工锌指为Cys2His2型锌指，构建方法参考NatureBiotechnology, 2003, 21:1208-1214，包含三个锌指结构域，由韩国ToolGen公司提供；表达载体骨架为PIB139，构建方法参考 J MolMicrobiol Biotechnol4 (4) : 417-426，由 pSET152 中插入 ermE强启动子构成。锌指蛋白文库中，人工锌指部分包含锌指结构域与GAL4转录因子激活域，其示意图如图2。通过改变人工锌指的序列，可以获得多种含有人工锌指的DNA片段，这些片段可以人工合成，也可以通过突变方法获得。本发明中的锌指蛋白DNA片段通过聚合酶链式反应(PCR)从酵母锌指蛋白文库的pRS316-CYC-lib-Gal4载体上获得，并通过EcoRI和XbaI的位点连接入pIB139表达载体。该载体的表达启动子为ermE，抗生素选择标记为安普霉素(Apramycin)01.锌指蛋白与转录激活域DNA片段的获得锌指蛋白与转录激活域DNA的PCR弓丨物序列Pl :5’ -ACGGTCTAGAGTGTGCTGCAATTCT-3’P2 :5， -ACTTGAATTCTGCGGCCCACTAGAT-3，PCR反应条件如表I所示表I PCR反应条件
权利要求
1.一株高产木质纤维素降解酶的链霉菌人工锌指蛋白突变菌株(Streptomyces sp),其特征在于所述菌株的登记入册编号为CGMCC No. 6428，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年08月13日。
2.根据权利要求1所述的高产木质纤维素降解酶的链霉菌人工锌指蛋白突变菌株的获得方法，其特征在于所述获得方法步骤为 (1)用表达载体，构建人工锌指蛋白表达载体文库； (2)将所获得的文库结合转移或转化至微生物酶生产菌种，经鉴定文库合格后挑取单克隆于选择培养基； (3)选择酶活提高的突变体。
全文摘要
一种高产木质纤维素降解酶的链霉菌人工锌指蛋白突变菌株及其获得方法，属于微生物生物技术领域。该菌株于2012年8月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No.6428。与不含有锌指蛋白的野生型出发菌株相比，该菌株的木聚糖酶活性提高11%，而且达到最高酶活的时间提前两天，最高酶活约为42.8U/mL。本发明还涉及获得该菌株的方法，利用该方法可提高多种生物酶的生产，即利用含有人工锌指蛋白基因的文库，通过遗传转化或结合转移等方法将该文库导入到各种生物酶生产菌株，并筛选酶活提高的突变体。
文档编号C12N1/21GK102994437SQ201210436360
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者赵心清, 俊金秀, 白凤武 申请人:大连理工大学