专利名称：用于柑桔溃疡病菌检测的lamp引物组的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物保护领域，提供了利用常温扩增技术对柑桔溃疡病菌的检测，适用于ロ岸检验检疫等机构应用。
背景技术：
ttfto^^ifelSiXanthomonas axonopodis pv. citri 、 Hasse ノ Vauterin et al.)是柑桔生产上的重要病害，被多个国家列入重大检疫性病害。柑桔溃疡病菌在我国华南沿海、华中和西南的14个省(市)均有发生，对柑桔生产和贸易造成了重大影响。在贵州省榕江县，该病害是柑桔上的主要病害之一，全县发生面积2035 hm2，占全县总面积的94%。 很多果园由于受到该病危害变成废园，每年因该病危害造成的产量损失达9万吨，经济损失18000万元。近年来，位居世界柑桔产量第一和第三德巴西和美国也正面临柑桔溃疡病、 柑桔黄龙病的威胁，其柑桔产业大幅度萎縮。柑桔溃疡病传统的检测技术和方法主要包括常规检测方法、酶联免疫吸附检测和普通PCR方法，但这些检测方法均有其不足之处。常规检测法能够检测活的病菌，但需要进行病原物的分离培养、纯化和一系列的生理生化反应及致病性測定，费时费力，难以满足植物检疫“快速、准确”的基本要求；酶联免疫检测中，虽然多克隆抗血清采用近缘细菌菌悬液交叉吸收，提高了特异性，但对于表面污染杂菌和杂质较多的柑桔样品，酶联免疫检测的灵敏度达不到要求，PCR方法虽然特异性高，检测周期短，但其昂贵的仪器设备和较高的假阳性率，也限制了其推广。本发明应用LAMP引物将恒温扩增技术应用于柑桔溃疡病菌的快速检测，特异性、 灵敏度比普通变温PCR方法更高，同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。
发明内容
本发明的第一目的是提供ー种用于柑桔溃疡病菌检测的LAMP引物組，第二目的是提供了ー种利用该引物组检测柑桔溃疡病菌的检测方法。ー种用于柑桔溃疡病菌检测的LAMP引物组包括一对外引物，其DNA序列为SEQ ID NOl :5’ -CACGCCATCTGCCAGTTC-3’
SEQ ID N02 ;5’ -GCGCAGAACGCTATCACTG-3， 和一对内引物，其DNA序列为
SEQ ID N03 5' -TAGCCGCCACGACTTGGTTGGGGAAATAGCGCTCGGTG-3’ SEQ ID N04 :5’-ATGCGGTCGTAGATATCCCGGAGCTCTACGACGGTCAACG-3’。2、ー种利用上述引物组检测柑桔溃疡病菌的方法，包括如下步骤
1)待测样品中DNA模板的提取用市售的DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取待测样品中DNA。2) LAMP 10 μ mol/mL SEQ ID N01、10 μ mol/mL SEQ ID N02 UOymol/ mL SEQ ID N03 禾ロ 10 μ mol/mL SEQ ID N04 各 1 μ L ;2*reaction mix 12. 5μ L ；Bst DNA 聚合酶1 μ L ；步骤1)中获得的DNA模板2 μ L ；灭菌去离子水5. 5 μし3) LAMP扩增条件将配制好反应体系的PCR管于68°C水浴锅中恒温反应60min ； 然后80°C，5min终止反应。4)检测结果电泳步骤3)中的LAMP扩增产物，若产生特异梯状条带，则待测样品中含有柑桔溃疡病菌；若为产生特异梯状条带，则待测样品中不含有柑桔溃疡病菌。与现有技术相比，本发明的进步在于检测时间短，效率高；检测仪器简单，只需要简单的水浴锅，无需昂贵的PCR仪，降低了设备投入，适合口岸检验检疫机构和基层实验室推广。
图1为LAMP弓丨物组恒温扩增结果图中1-柑桔馈场炳菌(Ζ <3Ζ0/ 0/70 ·5· pv. citri ( Hasse ) Vauterin et al.)； 2-黄单胞菌(Janthornonas sp.) ；3-短小杆菌{Curtobacterium sp.) ；4-柑桔馈荡病菌 X. axonopodis pv. citri ( Hasse ) Vauterin et al. );5_銷胺酉!·单胞菌 カブ/ goffloaas sp.) ；6-短波单胞杆菌(Brevundimonas sp.) ；7-嗜冷杆菌(/^FcArohcier sp. );8_7欠稻细条斑病菌oryzae pv. 0ryzicola)-’9-^j]\\f^Wj^^{flavibactermicliiganensis subsp.michiganensis) ； 10-柑;1 マ贯场ラ丙 M C^ aroflo^ot/Zs pv. citri ( Hasse ) Vauterin et al. ) ；11-白米软腐;) 菌 iBrwinia carotovora var . Carotovora );12_ 苏z 金芽孢杆 M (.Bacillus thuringiensis) ；13-枯草芽孢杆菌(β. subtil is) ； 14-阴性对照；M-DL2000 DNA分子量标记。
具体实施例方式1、引物的设计与合成
參照GeneBank中柑桔溃疡病菌全基因序列，挑选特异性高的序列(序列号 AE008923. 1)，采用 LAMP 引物设计软件 Primer Explorer V4. 0 设计 LAMP 引物，利用 LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪对反应进程中的浊度进行实时监控，对不同引物组扩增的起始时间、进入最大扩增速率的时间、最大扩增速率及达到平台期所需时间等參数进行分析，筛选出扩增速率最高、特异性好的一組LAMP引物。引物由上海生エ公司合成，其序列分别为
外引物 1 SEQ ID NOl :CACGCCATCTGCCAGTTC ； 外引物 2 SEQ ID N02 :GCGCAGAACGCTATCACTG ； 内引物 1 SEQ ID N03 :TAGCCGCCACGACTTGGTTGGGGAAATAGCGCTCGGTG ； 内引物 2 SEQ ID N04 :ATGCGGTCGTAGATATCCCGGAGCTCTACGACGGTCAACG。2、样品DNA模板的提取
用 Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit 试剂盒提取供试材料的 DNA，具体操作步骤參照试剂盒说明书。其中供试材料包括1-柑桔溃疡病菌axonopodis pv. ci tri ( Hasse) Vauterin et al. J ；2~ 負单胞菌{Xanthornonas sp.) ；3-組小杆囷{Curtobacterium sp.) ； 4-柑桔 贯扬ヲ丙菌(Ζ axonopodis pv. ci tri ( Hasse; Vauterin et al. ) ；5-鞘胺醇单胞菌、Sphingomonas sp.) ；6-短波单胞杆菌(Brevundimonas sp.) ；7-嗜冷杆菌 (.Psychrobacter sp. ) ;8_ 水稻细条斑病菌 O orj^ae pv. Crj^icoム)；9_ 番茄溃疡病菌 、しlavibacter michiganensis subsx).michiganensis) ； 10- hi^tn'M^MM axonopoais ρ v. citri ( Hasse) Vauterin et al. ) ;11_ 白米软腐ヲ丙菌 iBrwinia carotovora var. Caro to vora ) ； 1苏云金芽孢杆囷· {Bacillus thuringiensis ) ； 13_ ネ古草芽抱杆菌{B. subtilis)。以无菌水作为阴性对照。其中1号为阳性对照，4，10号样品为从柑桔园采集并分离得到的菌株(1，4，10号样品均经过普通PCR和荧光定量PCR检测为柑橘溃疡病菌)，其余菌株均可在国内市场购得。
3、LAMP 扩增
反应体系及条件毎次反应的总体积为25 μ L，具体体系如下。 2氺reaction mix12. 5μ L
lOymol/mL SEQ IDNOl1 μ L
lOymol/mL SEQ IDN021 μ L
lOymol/mL SEQ IDN031 μ L
lOymol/mL SEQ IDN041 μ L
Bst DNA聚合酶1 μ L
灭菌水5· 5 μ L
DNA模板2 μし2*reaction mix % Bst DNA ^^61 Loopamp DNA Amplification Kit
试剂盒产品。依次将上述试剂加入0. 2mL的PCR管中，配成LAMP扩增液。然后将配制好反应体系的PCR管置于68°C水浴锅恒温反应60min ；然后80°C，5min终止反应。4、结果判断
电泳LAMP扩增产物，结果參见图1。其中1、4、10号样品为柑桔溃疡病菌，均能出现梯状特异性条带，结果表明本发明引物对柑桔溃疡病菌的特异性强，对其他同属等細菌都没有特异性条带出现。
权利要求
1.ー种用于柑桔溃疡病菌检测的LAMP引物組，其特征在于该引物组包括一对外引物，其DNA序列为=SEQ ID NOUSEQ ID N02和一对内引物，其DNA序列为=SEQ ID N03、SEQ ID N04。
2.ー种利用权利要求1所述引物组检测柑桔溃疡病菌的方法，包括如下步骤1)待测样品中DNA模板的提取用市售的DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取待测样品中DNA;2)LAMP 扩增体系ΙΟμπιοΙ/mL SEQ ID N01、10 μ mol/mL SEQ ID N02 U0ymol/mL SEQ ID N03 禾ロ ΙΟμπιοΙ/mL SEQ ID N04 各 1 μ L ;2*reaction mix 12. 5μ L ；Bst DNA 聚合酶1 μ L ；步骤1)中获得的DNA模板2 μ L ；灭菌去离子水5. 5 μ L ；3)LAMP扩增条件将配制好反应体系的PCR管于68°C水浴锅中恒温反应60min ’然后 80°C，5min终止反应；4)检测结果电泳步骤3)中的LAMP扩增产物，若产生特异梯状条带，则待测样品中含有柑桔溃疡病菌；若为产生特异梯状条带，则待测样品中不含有柑桔溃疡病菌。
全文摘要
本发明公开了一套用于柑桔溃疡病菌LAMP检测的引物组，所述引物组由一对外引物和一对内引物组成。以本发明所设计的引物采用LAMP方法检测柑桔溃疡病，具有良好的特异性、灵敏度，能快速、方便、高效的检测柑桔溃疡病菌，能满足柑桔溃疡病菌快速准确检测的需要。
文档编号C12R1/64GK102534016SQ201210018338
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者吴瑜佳, 孔德英, 孙涛, 滕少娜, 赵文军, 邓朝晖, 陆丽华 申请人:重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心