专利名称：猪肺炎支原体p36基因重组毕赤酵母及表达蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母及表达蛋白，属于生物蛋白 制备技术领域。特别是涉及猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母的构建，表达蛋白的 制备。制备的蛋白可用于猪肺炎支原体P36蛋白研究、检测试剂盒和基因工程疫苗的 研制。
二背景技术：
猪肺炎支原体(M少co; /wwa/^o戸ew/w"/加，Mhp)是引起猪气喘病(MPS)的主要 病原。猪气喘病是猪群中流行最广、传播最快、最难净化的疫病之一。猪肺炎支原体通 过呼吸道传播，感染呼吸道上皮后导致呼吸道纤毛萎縮、脱落、损坏，上皮细胞坏死， 降低呼吸道黏膜的免疫功能，引起肺部功能损伤，容易产生其它呼吸道病原的继发感染。 据报道，该病可使猪的饲料转化率降低10%，生长速度降低12% 15%，出栏时间延长l 个月，与胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等混合感染时，情 况更为严重，该病一旦爆发就难以控制，给养殖业造成巨大的经济损失。
目前对该病致病机理还不十分清楚。在检测方面，国内外已建立了多种血清学检测 方法，如免疫琼扩和间接血凝等，但免疫琼扩和间接血凝法存在着灵敏度不高等问题。 由于Mhp与非致病支原体之间存在着交叉反应，所以血清学检测方法的研发困难重重。 对Mhp标准菌株和野外分离菌株的抗原分析表明，支原体肺炎含有几种主要免疫原，即: 胞内具LDH活性的蛋白(P36) ， 3种膜蛋白(P46、 P65和P70)和黏附素(P97)。这些蛋 白在急性或初次感染肺炎支原体后，可刺激产生早期和特异抗体。与猪体内常寄居的其 他支原体进行比较后发现，P36和P46高度保守，为肺炎支原体种特异性抗原成份，无 交叉反应。因此，可以应用P36或P46作为抗原，建立血清学检测方法，用于流行病学 调查。P36蛋白抗体的产生会经历两个主要阶段， 一是，感染后5 10周，针对P36蛋白 的抗体还很低；二是，感染后12周，此时感染动物的临床症状以及肺部病变逐渐消失， 而此时P36的抗体滴度增加很快，并且会一直持续到感染后21周。因此用P36蛋白建立 ELISA诊断方法，对于猪支原体肺炎的后期诊断有很重要的意义。
而目前的研究主要是在大肠杆菌里对其进行表达，表达的蛋白大多以融合蛋白的形 式存在，对后续应用可能存在一定的干扰，并且由于大肠杆菌成份的存在，表达蛋白需 要进行烦琐的纯化后才能用于后期的研究。而巴斯德毕赤酵母表达系统是近年发展起来 的一种新型真核表达系统，它既可以进行胞内表达，也可进行分泌表达。据报道，在酵 母表达系统里表达结核分枝杆菌CFP32蛋白与原核表达系统表达的该蛋白的Western Blotting结果显示，酵母表达系统表达的该蛋白与抗体的结合能力更强，而且ELISA结果也显示，结核病人的血清以及接种过疫苗的健康人的血清与酵母表达的CFP32蛋白的 结合能力较原核表达的该蛋白强。因此，选用了酵母表达系统表达P36蛋白具有较好的 前景。
三
发明内容
技术问题
针对上述领域中的缺陷，本发明提供了一种猪肺炎支原体P36基因毕赤酵母表达 系统，其表达蛋白纯度高、工艺简单、生物安全度高、成本低廉、易于生产和应用等 特点，为进一步P36蛋白的研究、开发研制检测试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。
技术方案
本发明的具体实施方案如下
猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母X-33/pPICZa-A/P36属巴斯德毕赤酵母 CP/cW"/ o^on;y)，于2009年4月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号 为CCTCCNO:M209070。
上述的猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母X-33/pPICZa-A/P36的构建方法为
1) 引物设计 设计引物序列为
Pl: 5'- CCCGAATTCATGAAACCTATTAAAATAGCTCT - 3' ￡coi I P2: 5'- GCGTCTAGATTAAATATTTTTAATTGCATCCTGAT - 3'逾I
2) PCR获取P36目的基因
以P1和P2为引物，猪肺炎支原体JS99株DNA为模板进行PCR扩增，取10^iL PCR产物 于质量比WTAE琼脂糖凝胶中电泳并观察拍照，回收PCR产物；
3) 将获取的目的基因克隆入pPICZa-A表达载体并进行序列测定
PCR产物和pPICZa-A均用￡co/ I 、乃a I双酶切，T4 DNA连接酶连接，连接 产物转化￡.co/!' DH5a获重组表达质粒，重组表达质粒用五coi I 、 ^ba I双酶切进行 鉴定，37'C水浴2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见约％6bp的条带，测序见SEQ ID NO.l ， 重组表达质粒命名为pPICZa-A/P36;
4) 重组酵母菌株的筛选和鉴定
毕赤酵母X-33感受态与Sac I线性化的pPICZa-A/P36相混合，转移至预冷的0.2cm 电转杯中，置冰上5min, 1.5kV、 25pF、 200Q电击，立即加入lmL预冷的lmol/L山梨醇， 取200)iL涂布于YPDS平板上，28 30'C培养至单菌落出现，采用PCR方法分析毕赤酵母 转化子，用煮-冻-煮法制备PCR模板，以通用引物5'AOX和3'AOX为引物，其序列分别 为5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'，和5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC -3' 进行PCR鉴定，筛选到的阳性克隆即为毕赤酵母X-33/pPICZa-A/P36。
4上述猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母表达蛋白的制备方法为，将毕赤酵母 X-33/pPICZa-A/P36接种至U5mL BMGY中，28~30°C、振荡培养约22h至OAoo达到2 6时， 室温离心，收集菌体重悬于25mL BMMY培养基，进行诱导表达，28~30°C、振荡培养 约72h，期间每24h补加至终浓度体积比为l。/。的甲醇，72h后，5000r/min离心10min，收 集培养液上清，表达蛋白以可溶形式存在于上清液。
有益效果
本发明的特点和优点如下
本发明重组表达蛋白是由基因工程菌株毕赤酵母X-33甲醇诱导表达后离心后取 上清所得，该菌株含重组表达质粒pPICZa-A/P36。
本发明选用的重组表达质粒为pPICZa-A载体，属于分泌型载体，它具有高效可 调控启动子AOX(醇氧化酶);具有Zeocin抗性筛选标记基因，具有a-因子前导信号序 列，能有效地引导外源蛋白分泌到胞外。重组表达质粒pPICZa-A/P36的表达式为 -5，A0X1- a-factor-P36 gene-Zeocin-。通过重组表达质粒pPICZa-A/P36体外诱导表达， 经过SDS-PAGE电泳以及Western Blotting进行鉴定，发现猪肺炎支原体P36蛋白具 有良好的免疫反应性，能特异性地与猪肺炎支原体阳性血清进行结合，后再对表达条 件进行优化，提高表达量，使用分光光度法测定蛋白浓度可达285pg/mL。
本发明选取的目的基因长度为947bp，表达载体pPICZa-A/P36构建容易；其次， pPICZa-A/P36的表达产物具有良好的抗原反应性；第三，其表达产物都分泌于上清 液中，而毕赤酵母自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化；第四，纯化的表达蛋白 不需要进行蛋白复性就可直接使用。
因此，本发明为猪肺炎支原体P36蛋白的进一步研究、研制检测试剂盒和基因工 程疫苗奠定了基础。 四
图1猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母及表达蛋白技术路线示意图 图2重组表达质粒pPICZa-A/P36酶切鉴定图谱
泳道M为DL-2000 Marker;泳道1为pPICZa-A载体￡coi I 、 Wa I双酶切； 泳道2为重组表达质粒pPICZa-A/P36 ￡coi I 、 I双酶切。 图3重组毕赤酵母X-33 /pPICZa-A/P36 PCR鉴定图谱
泳道M为DL-2000 Marker;泳道1为重组表达质粒pPICZa-A/P36转化毕赤酵母 X-33的克隆；泳道2为质粒pPICZa-A转化毕赤酵母X-33的克隆。 图4重组表达质粒pPICZa-A/P36体外表达的SDS-PAGE图谱
泳道M蛋白分子量标准；泳道1为质粒pPICZa-A诱导72h后离心取得上清；泳 道2为重组表达质粒pPICZa-A/P36诱导72h后离心取得上清。 图5表达蛋白的Western blotting鉴定图泳道M蛋白分子量标准;泳道1为载体质粒pPICZa-A诱导72h后离心取得上清； 泳道2为重组表达质粒pPICZa-A/P36诱导72h后离心取得上清。 五具体实施例方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细的描述。
1. 引物设计
根据GenBank中报道的猪肺炎支原体P36全基因序列(AE017243)，参照毕赤 酵母偏嗜密码子设计两条引物，由TaKaRa公司合成，引物序列为 P1: 5'- CCCGAATTCATGAAACCTATTAAAATAGCTCT - 3' 五coi I P2: 5'- GCGTCTAGATTAAATATTTTTAATTGCATCCTGAT - 3'勘I
2. PCR获取P36目的基因
以P1和P2为引物，猪肺炎支原体JS99株(来自国家兽医微生物菌种保藏管理中心) 基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系(50nL): 10xPCR Buffer 5pL， MgCl2 (25画ol/L)2nL， dNTP(10mmol/L)3nL，引物P1、 P2(20pmol/L)各0.5nL， 7V^TM0.5nL， 模板4iiL， ddH20 34.5nL (均购于TaKaRa公司)。混匀，瞬间离心。进行扩增反应。PCR 反应条件为95t:预变性5min后，按94。C 45s， 54°C 45s， 72°C 45s循环30次，再于72。C延 伸10min。 PCR产物于质量比lc/。TAE琼脂糖凝胶中电泳并观察拍照。切下目的片段，用 小量胶回收试剂盒(购于TaKaRa公司)回收PCR扩增产物。
3. 将获取的目的基因克隆入pPICZa-A表达载体并进行序列测定
PCR产物和pPICZa-A(InvitrogenTM life technologies )均用五coi I 、力"I (TaKaRa 公司)双酶切，T4DNA连接酶连接，连接产物转化五.co/!'DH5a(宝生物工程(大连) 有限公司)，重组表达质粒用、 j^al双酶切进行鉴定，37'C水浴2h，琼脂 糖凝胶电泳鉴定，可见一条约966bp的条带出现(见图2)。双酶切鉴定阳性的质粒送 Iiwitrogen上海分公司测序(见序列表SEQ ID NO.l)。构建正确的重组表达质粒命 名为pPICZa-A/P36。
4. 重组毕赤酵母的筛选和鉴定
毕赤酵母X-33感受态(Invitrogen life technologies)(80 ^L)与Sac I (TaKaRa公司) 线性化pPICZa-A/P36(5吗)相混合，转移至预冷的0.2 cm电转杯(Bio-Rad)中，置冰上 5min， 1.5 kV、 25 jaF、 200 Q电击，立即加入lmL预冷的lmol/L山梨醇，取200 ^L涂布 于YPDS平板上，28-30'C培养至单菌落出现。详细步骤参照Pichia Expression Kit (构建 示意图见图2)。采用PCR方法分析毕赤酵母转化子，用煮-冻-煮法制备PCR模板，以通 用引物5' AOX和3' AOX为引物，其序列分别为5'- GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'， 和5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'反应体系(20pL》2xPCRMix 10pL,引物P1、 P2(20pmol/L)各0.25 nL，模板2.5 ^L， ddH20 7 pL (TaKaRa公司)。混匀，瞬间离心， 进行扩增反应。PCR反应条件为94'C预变性4min后，按94'C lmin，55。C lmin，72'C lmin,循环30次，再于72'C延伸10min。取IO nl PCR产物于质量比P/。TAE琼脂糖凝胶中电泳并
观察拍照，结果可见约1480bp的目的条带(见图3)。
5.重组P. ; aWo^菌的诱导表达和表达蛋白的Western blotting鉴定
将筛选到的阳性酵母菌接种到5mL BMGY中，28~30°C、 200r/min振荡培养约 22h至0￡>6。。达到2~6时，室温3000r/min离心2min,收集菌体重悬于25mL BMMY 培养基，进行诱导表达。28 3(TC、 200 r/min培养72h,期间每24h补加至终浓度体 积比为1°/。的甲醇。72h后，5000r/min离心10min，收集培养液上清。培养上清进行 SDS-PAGE电泳鉴定，约36KDa的表达蛋白以可溶形式存在于表达上清中(见图4)。 再对表达条件进行优化，提高表达量，使用分光光度法测定蛋白浓度可达285pg/mL。
SDS-PAGE电泳后进行转印，然后以猪肺炎支原体阳性血清(中国兽医药品监察 所)为一抗，HRP标记的羊抗猪IgG (武汉博士德公司)为二抗作Western Blotting 鉴定，最后用DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)显色，在醋酸纤维素膜上可见目 的条带36KDa (见图5)，推导的氨基酸序列见SEQ ID N0.2。这提示表达蛋白具有 良好的抗原性，能特异性地与猪肺炎支原体阳性血清进行结合。
本发明可为猪肺炎支原体P36蛋白的进一步研究、开发研制检测试剂盒和基因工 程疫苗奠定了基础。
7序列表
<110>江苏省农业科学院
〈120〉猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母及表达蛋白
<130>说明书
〈140> 00
〈141> 2009-05-05
<160〉 6
<170> Patentln version 3.1
〈210> 1
<211> 4485
<212〉 腿
〈213〉人工构建
<220>
〈221〉重组表达质粒pPICZ a -A / P36
<222> (1)..(4485) <223〉
〈400> 1
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<210〉 2
<211> 317
<212> PRT
<213>重组酵母分泌表达
〈220>
〈221>分泌表达蛋白P36
〈222〉 (l)..(317)
〈223>
〈400> 2
Glu Phe MetLys Pro lie LyslieAlaLeu lieGlyAla Gly Asn Val
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人工合成
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305 〈211〉 <212> <213〉 <220> 〈221〉 〈222〉 <223> <400> 3
cccgaattca tgaaacctat taaaatagct ct 32
<210> 4
<211〉 35
<212>腿
〈213〉人工合成
<220〉
<221〉 引物P2 <222> (1)..(35) <223> <400> 4
gcgtctagat taaatatttt taattgcatc ctgat 35
〈210〉 5
〈211> 21
<212>腿
〈213〉人工合成
〈220>
〈221〉 引物5' AOX <222> (l)..加 <223> <400> 5
gactggttcc aattgacaag c 21 <210> 6 21 DNA
人工合成
<211> <212> 〈213〉 <220〉 〈221> 〈222〉 〈223> <
引物3' AOX (21)
6
gc犯atggca ttctgacatc c 21
1权利要求
1.猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母，该重组毕赤酵母X-33/pPICZα-A/P36属巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，于2009年4月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NOM209070。
2. 权利要求1所述的猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母X-33/pPICZa-A/P36 的构建方法，其特征在于1) 引物设计 设计引物序列为-Pl: 5'- CCCfiMIIQATGAAACCTATTAAAATAGCTCT - 3' 五coi I P2: 5'- GCGieiMATTAAATATTTTTAATTGCATCCTGAT - 3'扁I2) PCR获取P36目的基因以P1和P2为引物，猪肺炎支原体JS99株DNA为模板进行PCR扩增，取10pL PCR产 物于质量比1。/。TAE琼脂糖凝胶中电泳，回收PCR产物；3) 将获取的P36目的基因克隆入pPICZa-A表达载体并进行序列测定PCR产物和pPICZa-A均用I 、 ^k I双酶切，T4 DNA连接酶连接，连接 产物转化￡.co// DH5a获重组表达质粒，重组表达质粒用￡coi I 、 Wa I双酶切进行 鉴定，37。C水浴2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见约966bp的条带，测序见SEQ ID NO.l， 重组表达质粒命名为pPICZa-A/P36;4) 重组酵母菌株的筛选和鉴定毕赤酵母X-33感受态与SacI线性化的pPICZa-A/P36相混合，转移至预冷的0.2cm 电转杯中，置冰上5min， 1.5kV、 25pF、 200Q电击，立即加入lmL预冷的lmol/L山梨醇， 取20(HiL涂布于YPDS平板上，28 30'C培养至单菌落出现，采用PCR方法分析毕赤酵母 转化子，用煮-冻-煮法制备PCR模板，以通用引物5'AOX和3'AOX为引物，其序列分别 为5: GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'，和5乙GCAAATGGCATTCTGACATCC -3'进行 PCR鉴定，筛选到的阳性克隆即为毕赤酵母X-33/pPICZa-A/P36。
3. 权利要求1或2所述的猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母表达的蛋白。
4. 权利要求3所述蛋白的制备方法，其特征在于将毕赤酵母X-33/pPICZa-A/P36接种到5mLBMGY中，28~30'C、振荡培养约22h至 0!W)达到2 6时，室温离心，收集菌体重悬于25mL BMMY培养基，进行诱导表达， 28~30°C 、振荡培养约72h，期间每24h补加至终浓度体积比为1%的甲醇，72h后，5000r/min 离心10min，收集培养液上清，表达蛋白以可溶形式存在于上清液。
全文摘要
本发明公开了一种猪肺炎支原体P36基因重组毕赤酵母及表达蛋白，涉及生物蛋白制备领域。设计引物PCR获得P36目的基因后克隆入pPICZα-A表达载体，重组表达质粒pPICZα-A/P36转化感受态毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33，筛选到重组毕赤酵母X-33/pPICZα-A/P36。表达蛋白制备方法为，将阳性酵母菌接种到BMGY中，经甲醇诱导表达，表达蛋白以可溶形式存在上清液中。该方法制备的猪肺炎支原体P36蛋白较纯，且具有良好的免疫反应性，表达蛋白可用于P36蛋白的研究、猪肺炎支原体免疫检测试剂盒和基因工程疫苗的研制。
文档编号C12N1/19GK101565681SQ200910027160
公开日2009年10月28日 申请日期2009年5月22日 优先权日2009年5月22日
发明者冯志新, 刘茂军, 吴叙苏, 王海燕, 源 甘, 祝永琴, 邵国青 申请人:江苏省农业科学院