抑制大鼠Atpasea3基因表达的siRNA、重组慢病毒及在治疗骨吸收异常疾病的药物中的应用的制作方法

专利名称：：抑制大鼠Atpasea3基因表达的siRNA、重组慢病毒及在治疗骨吸收异常疾病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学、生物医药及基因工程
技术领域：
，具有设计利用慢病毒(lentivirus，LV)介入的RNA干扰技术，构建针对大鼠Atpasea3基因的慢病毒干扰体系，并将其应用到治疗骨吸收异常疾病的新型药物开发制备中。
背景技术：
：破骨细胞(osteoclast,0C)是骨吸收的功能细胞，其绝对或者相对旺盛的骨吸收功能，导致骨改建平衡失调，并是骨质疏松症、Paget病、风湿性关节炎、骨巨细胞瘤及骨肿瘤侵润等多种疾病的病理基础。近年来发现Atpasea3基因表达产物为分子量116kDa的蛋白，是0C空泡型质子泵(空泡型氢离子三磷酸腺苷转运酶vacuolartypeH+adenosinetriphosphatase,v-ATPase)关键组成部分。LiYP发现敲除Atpasea3(即Atp6i)基因可致0C功能障碍，不能使去矿物化形成吸收陷窝，发生严重骨质硬化[LiY-P，ChenW，Liang,Y,etal.Atpi-deficientmiceexhibitsevereosteopetrosisduetolossofosteoclastmediatedextracellularacidification.NatureGenet,1999,23:447-451]，Deng指出Atpasea3基因在OC骨吸收中有具有决定性作用[DengW,StashenkoP,ChenW,etal.CharacterizationofmouseAtpasea3gene，thegenepromoter,andthegeneexpression.JBoneMinerRes,2001,16:1136-1146]。Pringle采用延迟OC吸收过程,可保持股骨头的机械性能，明确了OC是激素性股骨头坏死的直接原因，使用OC抑制药物发现可以有效地防止股骨头缺血性坏死塌陷过程的进展[PringleD,KoobTJ,KimHK.Indentationpropertiesofgrowingfemoralheadfollowingischemicnecrosis.JOrthopRes,2004，22(1):122-130]。针对0C质子泵开发新的高特异性、高效率的抑制剂是目前热点问题之一，目前研究的抑制剂有Bafil咖ycinAl、SB242784、FR177995、FR167356等，然而这些药物的靶向性低加之其毒副作用等问题一直困扰着临床，与RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术相比，这些药物抑制效率低下、特异性差。RNAi技术是一种阻断基因表达的有效新方法，由诺贝尔医学奖获得者Fire发现[FireA，XuS,Montgomery區，etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature,1998，391(6669):806-811.]，并在哺乳动物成功应用[ElbashirSM,Harborth丄LendeckelW，etal.Duplexesof21—nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.Nature,2001,411(6836):494-498.]。RNA和蛋白质在生物体中共同负责基因的表达和基因表达的调控，在生命活动中具有重要的作用。双链RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)在细胞内特异性地诱导与之同源互补的mRNA的降解，使相应基因的表达关闭，从而引发基因转录后水平沉默的现象，称为RNA干扰。其机制是[BersteinB,CaudyM，H醒ondSM，etal.RoleforabideentateribonucleaseintheinitiationspetofRNAinterference[J].Nature,2001,469:363-366]:由于转基因、病毒感染、转座子、人为注射等原因，细胞中出现dsRNA分子；dsRNA在ATP供能的条件下，由RNase家族成员，dsRNA特异性核酶Dicer将其逐步切割为2123nt的小干扰RNA(smallinterferenceRNA，siRNA);siRNA双链结合于一种不同于Dicer的核酶复合体形成RNA诱导的沉默复合体(RNAinducedsilencingcomplex,RISC),然后在ATP供能的条件下，siRNA双链解旋，使RISC激活；活化的RISC借助碱基的互补配对锚定于同源的mRNA转录本上，siRNA双链分离并与同源的单链mRNA之间发生链的交换，其正义链被释放出来，最后核酶从siRNA反义链的3'末端所结合的部位开始，降解mRNA。另一方面，在细胞内RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRP)的催化下，以siRNA为引物，以目的mRNA为模板，合成大量新的dsRNA,这些新合成的dsRNA又可以作为Dicer的底物而被降解为siRNA，从而使信号得以放大，这一模式在蠕虫的研究中得到了证实，被称为"随即降解RNA"的扩增模式;而在果蝇中，还存在着以dsRNA自身为模板合成新的dsRNA的过程，但这种dsRNA会很快的降解掉，所以其作用有限；不但如此，siRNA本身也可以在RdRP的催化下进行自我复制，所以仅仅几个dsRNA分子就可以产生强大的干涉效应[YuJY，DeRuiterSL，TunerRNAinterferencebyexpressionofshortinterferingRNAsandhairpinRNAinmammaliancells[J].PNAS,2002,99(3):6047-6052]。siRNA可在哺乳动物细胞组织内引起基因封闭作用，其结构稳定无须像反义核苷酸那样进行广泛的化学修饰以提高其半衰期，并能在低于反义核苷酸几个数量级的浓度下，使靶基因降至极低水平甚至完全"敲除"，从而产生缺失突变表型[Bru腿elkarapTR.AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancells[J],Science,2002，29(5567):550-553]，siRNA的干预效应关键取决于其靶基因序列的选择，任一nt的错误均会导致RNAi效应的丧失，这种高度序列特异性使其对点突变、序列插入和缺失的选择性基因静寂有很重要的药理作用[5°]。RNAi技术可以方便地阻抑特异性基因，受抑制的基因可以是内源性基因，也可以是外源性基因。内源性基因如癌基因或与疾病相关的基因，外源性基因如病毒基因，针对它们进行特异的阻抑，可应用于基因治疗或开发新型药物等方面的研究，显示了良好的前景和巨大潜力。目前有五种siRNA的制备方法化学合成法(chemicalsynthesis);体外转录法(invitrotranscription);长链dsRNA的RNaseIII家族体外消化法(Dicer,E.coliRNaseIII、invitroRNaseIIIfamilyenzymaticdigestionofdsRNA);siRNA表达载体法(siRNAexpressionvectors);si腿表达框架法(siRNAexpressioncassettes,SECs)。前三种方法是在体外制备siRNA,然后通过转染或电转的方法导入到细胞中；后两种方法则是基于具有合适启动子的载体或转录元件在哺乳动物或细胞中转录生成siRNA。相对于其他方法，化学合成法合成的siRNA质量可靠，纯度高，可以进行多种修饰，省时省力。化学合成的siRNA—般在转染后的1-2天(d)，RNAi的作用显著，转染后24小时(h)可以检测到耙mRNA水平的降低。很多实验证明最高的RNAi效率在转染后48h或者更长。但是化学合成siRNA不适用于转染效率低于50%的细胞实验，直接的敲减结果研究实验，敲减结果的观察需要连续72h以上的实验，以及目的基因蛋白分子量大于100kDa或者蛋白表达水平非常高的实验。并且必须通过脂质体进行转染，因而使其应用受到较大的限制。由于脂质体对有些类型细胞的转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA,在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。siRNA表达载体法是将siRNA对应的DNA序列克隆到适当的启动子和转录终止信号之间形成siRNA表达载体，然后将该载体导入细胞后，利用胞内的RNA聚合酶转录出siRNA。siRNA表达载体的低转染效率是基因治疗应用中的重要障碍，慢病毒载体能够转染大多数非分裂细胞，以及具有高效地整合和稳定地表达目的基因于靶细胞的能力，所以被广泛应用于基因治疗研究。慢病毒载体法发卡结构的RNA(shorthairpinRNA,shRNA)需要病毒基因组整合于宿主基因组，然后长时间、稳定表达外源基因，即形成内源性siRNA，这一过程需要一定时间，然后再发挥RNAi效应，因此较慢约为48-96h,故而称之为慢病毒。利用慢病毒构建的shRNA载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，lentivirus—shRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞，如原代且处于非分裂状态的0C细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达，可以携带可插入不超过10kb的外源片段，还具有低免疫原性的优势。慢病毒构建的siRNA载体，使siRNA在功能基因和基因治疗上的研究领域更加广阔，进一步进行siRNA治疗破骨细胞亢进疾病的体内实验打下良好的基础，可望作为一种新型的生物基因药物运用到临床治疗中。
发明内容本发明的目的在于提供一种能够有效特异地沉默大鼠Atpasea3基因的siRNA序列及其重组慢病毒，以克服现有抑制破骨细胞的药物效率低下、特异性差的问题。本发明提供一种抑制大鼠Atpasea3基因表达的siRNA,所述siRNA由SeqIDNO.1与SeqIDNO.2杂交而成。本发明还提供一种编码含有所述siRNA序列的小发卡RNA的DNA，SeqIDNO.3与SeqIDNO.4杂交而成。另外本发明还提供一种抑制Atpasea3基因表达的重组慢病毒，所述重组慢病毒含有所述的DNA和慢病毒载体。SeqIDNO.1:5，-CACUCAGAGMGGCCUACA-3,;SeqIDNO.2:5，-UGUAGGCCUUCUCUGAGUG-3，。SeqIDNO.3:5'-TaaCACTCAGAGMGGCCTACA"ca柳《aTGTAGGCCTTCTCTGAGTGttTTTTTTC-3';SeqIDNO.4:5'-TCGAGAAAAAAaaCACTCAGAGMGGCCTACAfcfc"狩aTGTAGGCCTTCTCTGAGTGttA-3'。本发明提供所述的siRNA在制备治疗骨吸收异常疾病的药物中的应用。本发明提供的编码含有所述siRNA序列的小发卡RNA的DNA，含有一个Loop环、^aI和J力oI酶切位点。所述DNA为双链，由SeqIDNO.3和SeqIDNO.4杂交而成。所述的小发卡RNA的序歹U如SeqIDNO.5:5'"CACUCAGAGMGGCCUACA^MOM创fl4UGUAGGGCUUCUCUGAGUGUU—3'。本发明还提供所述的DNA在制备治疗骨吸收异常疾病的新型药物中的应用。所述抑制Atpasea3基因表达的重组慢病毒，是自身失活的pGCL-GFPpLL3.7慢病毒载体、质粒载体pHelper1.0和pHelper2.0共转染293T细胞获得的包装重组慢病毒。该重组慢病毒，携带绿色荧光蛋白基因序列。本发明还提供所述重组慢病毒在制备治疗骨吸收异常疾病的药物中的应用。本发明的siRNA、编码shRNA的DNA以及重组慢病毒，能够有效的抑制Atpasea3基因表达，显著的抑制了破骨细胞的骨吸收功能，从而达到治疗骨吸收异常疾病的目的。本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果本发明提供1对能够有效地特异性沉默Atpasea3基因的siRNA序列，构建了能够稳定表达上述siRNA序列的表达载体，以及重组了能够稳定表达上述siRNA序列的LV-Atpasea3-shRNA慢病毒。该表达载体带有抗性标记，该慢病毒可以整合到破骨细胞基因组，持续长期的表达相关的shRNA，而不会引起对细胞的毒害作用，可以发挥长期阻断基因表达的作用，具有优良的靶向性、安全性以及表达持续性，有利于进行长期研究。本发明的有益效果是，携带Atpasea3基因shRNA的慢病毒可以高效、长期、直接抑制OC骨吸收功能，为进一步治疗OC绝对或者相对旺盛的骨吸收疾病奠定基础，并为开发生物型OC抑制剂提供新思路，可望作为一种新型的生物基因药物运用到6临床治疗中。图1为寡核苷酸转录发卡RNA形成功能siRNA示意图，其中A为siRNA序列，正义链及反义链，3'端突出两个UU碱基，典型的siRNA功能序列，B为携带A序列和LOOP茎环结构的shRNA，C为转录shRNA的寡核苷酸结构，U6启动子、L00P发卡茎环、MCS多克隆位点、CMV(CMV启动子，启动EGFP的表达)、EGFP绿色荧光蛋白、LoxP(LoxP序列)；图2为含发明shRNA序列的表达载体阳性质粒测序鉴定图3为筛选最佳RNAi靶点WesternBlotting结果图，图A显示各组GFP蛋白表达量，图B显示各组Actin蛋白表达量，其中M为Maker,Blank为不加任何RNAi质粒的细胞组，NC为阴性对照RNAi质粒的细胞组，GAPDH的RNAi对照为靶向GAPDH的RNAi质粒的细胞组，1#为Atpasea3-shRNA1号RNAi质粒的细胞组，2#为Atpasea3-shRNA2号RNAi质粒的细胞组，3#为Atpasea3-shRNA3号RNAi质粒的细胞组，賴为Atpasea3-shRNA4号RNAi质粒的细胞组，5tt为Atpasea3-shRNA5号RNAi质粒的细胞组；图4为LV-Atpasea3系统构建流程示意图5为LV-Atpasea3转染破骨细胞后骨吸收陷窝面积结果图。具体实施例方式本发明调节Atpasea3的表达设计小干扰RNA以及编码shRNA的DNA，直接抑制破骨细胞的骨吸收功能。本发明的小干扰RNA以及DNA所编码shRNA，能特异识别序列位于Atpasea3基因(NM—199089)第1991-2010碱基处CACTCAGAGMGGCCTACA。本发明的编码shRNA的DNA为双链DNA，其模板列为SeqIDNO.3所示的序列，编码链为SeqIDN0.4所示的序列。通过慢病毒载体介导后，在体内能够有效持续表达shRNA，该shRNA能特异的识别位于Atpasea3基因(NM_199089)第1991-2010碱基处序列CACTCAGAGMGGCCTACA。在本发明中SeqIDNO.3和SeqIDNO.4都设计了polyA尾信号。失活的慢病毒载体携带RNA干扰片段的DNA模板，在体内转录成shRNA，可以持续表达，解决了RNAi基因治疗的靶向性和安全持续性。本发明优选的实施方式中，构建了Atpasea3的慢病毒干扰体系，并取得良好的抑制效果。下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。实施例l基于Atpasea3基因序列(NM—199089)，按照siRNA、shRNA(含有该siRNA序列)设计原则，在编码shRNA的DNA序列上，设计添加polyA尾信号和酶切位点，共设计五对这样的DNA链，以及一对RNA干扰阴性对照序列对应的DNA链，委托Invitrogen公司体外制备合成序列并退火形成双链DNA。阴性对照序列对应的DNA链正义链5，-TTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCMGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTC-3，反义链5，-TCGAGAAAAMTTCTCCGMCGTGTCACGTTCTCTTGMACGTGACACGTTCGGAGAAA-3，经过筛选，从备选五对中获得干扰效果最为显著的本发明Atpasea3干扰片段序列，如下SeqIDNO.3和SeqIDNO.4，且可以形成Atpasea3高效siRNA,如图1所示。Seq訓O.3:5'-TaaCACTCAGAGAAGGCCTACA"c鄉柳TGTAGGCCTTCTCTGAGTGttTTTTTTC-3，SeqIDNO.4:5，-TCGAGAAAAAAaaCACTCAGAGAAGGCCTACATGTAGGCCTTCTCTGAGTGttA-3，.实施例2Atpasea3-shRNA慢病毒质粒的构建构建过程如下酶切(#paI和Z力oI)pGCL-GFP载体(pLL3.7质粒上海吉凯基因化学技术有限公司)以使其线性化，胶纯化回收，用T4连接酶将上述DNA与pGCL-GFP质粒连接12小时，经转化筛选后，获得正确克隆，送Invitrogen公司测序鉴定，命名为Atpasea3-shRNA系统。具体操作步骤1.酶切质粒体系取纯化的pGCL-GFP质粒(lPg/W)2W，10Xbuffer5W，100XBSA0.5W，处aI(10U/W)1W，J力oI(10UAH)1W，H2040.5W混合，在37。C酶切反应1h，然后加入0.5mol/LEDTA(pH8.O)使终浓度达10mraol/L，终止反应。再取5W酶切产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，之后用试剂盒回收酶切后的线性质粒。2.DNA凝胶回收pGCL-GFP质粒酶切充分，用DNA凝胶回收试剂盒回收DNA，并调整浓度为100ng/W，DNA贮存于-20°C。3.氯化钙处理法制备大肠杆菌感受态细胞4.构建连接系统制备10W连接反应体系酶切回收的pGCL-GFP质粒100ng/W1W，实施例1退火获得的双链DNA100ng/W1W，10XT4噬菌体DNA连接酶缓冲液1W，T4噬菌体DNA连接酶1W，ddH206然后于4'C进行连接反应12h，分别制备出6组克隆连接液，准备转化。5.取2W上述连接产物转化入感受态细胞，抗性的SOB(上海吉凯基因化学技术有限公司)涂板后，Amp筛选。6.挑取阳性克隆，进行PCR鉴定，测序保存。8以不同连接产物转化后单克隆的菌落裂解液为模板，P-1(+):5'-GTGTCACTAGGCGGGMCAC-3，，p-2(-):5，-TTATTCCCATGCGACGGTATC-3，为引物，利用20WPCR反应体系进行鉴定。体系如下P-l(+)0.4W，p-2(-)0.4W，ddH2015.2W，lOXbuffer2W，DNTPs(2.5mM)0.8W，Taqpolymerase0.2菌落裂解液1W。将上述配好的反应液在PCR仪上进行扩增。PCR循环条件94。C预变性30sec，94。C变性30sec，60。C退火30sec,72。C延伸30sec，循环30次，再72。C延伸6min。PCR反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定正确后Invitrogen公司用3730型测序仪进行测序分析。测序准确后，该阳性克隆分别命名为Atpasea3-shRNA质粒(1-5共及阴性质粒)，携带SeqIDNO.3的Atpasea3-shRNA质粒测序图如图2所示。实施例3RNA干扰有效靶点WesternBlotting筛选鉴于大鼠Atpasea3基因相关抗体缺乏，筛选最佳RNAi靶点时，无法完成对Atpasea3的蛋白分析。先构建携带绿色荧光蛋白基因序列(greenfluorescentprotein,GFP)的过表达Atpasea3质粒转染293T细胞，制备出过表达Atpasea3基因的293T细胞株，然后转染携带各Atpasea3-shRNA靶点的质粒，通过WesternBlotting检测GFP表达的抑制程度，间接反映对Atpasea3基因RNA干扰效果，筛选出最佳的Atpasea3-shRNA靶点，如图3所示。过程分为两部分，具体操作步骤如下一、过表达目的基因融合蛋白载体的构建1.PCR获得Atpasea3基因大片段设计合成Atpasea3基因引物，P-3(+):CCGGMTTCTGACTACAAGGATGACGATGACMGGATTACMAGACGACGATGATAAGCTCMCGAATCGGTGAGTG，P-4(-):CGCGGATCCGTCACTGTCCACAGTGMGGC。DNA模板(购于GENTAUR公司MRN4776)，利用20WPCR反应体系获得目的基因片段，体系P-3(+)0.4H1,P-4(-)O.化l，ddH2013.6W，lOXbuffer2W，DNTPs(2.5mM)0.8W，pfupolymerase0.2W，模板(GENTAUR公司MRN4776，10ng/W)1W。按以下条件94。C预变性30sec，94。C变性30sec，60。C退火30see,72。C延伸2min，循环30次，再72'C延伸6min，取5WPCR反应产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，得到目的基因片段。2.用PCR产物纯化回收试剂盒纯化DNA，3.采用AcoA"I和I酶切pEGFP-Cl载体(上海吉凯基因化学技术有限公司)以及PCR片段取纯化的pEGFP-Cl质粒或目的基因片段(1PgA4)2W，10Xbuffer5W，100XBSA0.5W,￡coiI(10U/W)1W，万滅1(10U/W)1W,H2040.5混合，37。C酶切反应lh，然后加入0.5mol/LEDTA(pH8.0)使终浓度达10mmol/L，终止反应。再取5W酶切产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。酶切充分，用DNA凝胶回收试剂盒回收DNA，并调整浓度为IOOng/W，方法同DNA凝胶回收步骤。4.构建连接体系将回收的pEGFP-Cl质粒和目的基因片段酶切产物浓度调整为100ng/W。在10W连接反应体系中将目的基因片段与pEGFP-Cl载体连接酶切回收的载体DNA100ng/W1W,酶切后回收的PCR产物100ng/W1W，10XT4噬菌体DNA连接酶缓冲液1W，T4噬菌体DNA连接酶1ri，ddH206W。于4'C连接反应12h，获得连接产物，准备转化。5.取2W上述连接产物转化入感受态细胞，抗性的SOB涂板后，Amp筛选。6.挑取阳性克隆，进行PCR鉴定，测序保存。同前2(mi体系PCR鉴定阳性克隆P-5(+):GCCTTCATCTTCCGGATCTG，P-6(-):CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG。P-5(+)O.糾，P-6(-)0眉，ddH2015.2W，10Xbuffer2W，DNTPs(2.5mM)0.8W，Taqpolymerase0.2W，菌落裂解液1W。引物为PCR条件94。C预变性30sec，94。C变性30sec，60。C退火30sec，72。C延伸2min，循环30次，再72'C延伸6min。PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后测序，测序结果正确后命名为pEGFP-C1-Atpasea3质粒。二、WesternBlotting检测各耙点的RNAi效果在293T细胞中，先转染过表达目的基因质粒(pEGFP-Cl-Atpasea3)，制备过表达Atpasea3的293T细胞株，然后转染不同RNAi靶点质粒，采用WesternBlotting实验方法，检测Atpasea3在不同的RNAi靶点干扰后，GFP蛋白水平表达变化。1.将5X1()S个293T细胞接种于6孔板各孔中，在37。C、5%〔02条件下培养过夜。3.转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。4.转染先将5PgpEGFP-Cl-Atpasea3质粒DNA与240plDMEM培养基(Invitrogen公司)混合，编号为A管，另取一管加入5nlLipofectAMINE2000试剂和245nlDMEM培养基混匀，编号为B管，A、B两管均在室温下温育5min。然后将A、B两管的内容物混合，在室温下静置20min,得到含质粒DNA与LipofectAMINE2000稀释液的转染复合物。然后把转染复合物加入到293T细胞中，混匀，于37'C、5%0)2培养8h。6.每瓶细胞中加入新鲜培养基继续培养，转染36h后取一部分细胞用Westernblotting检测Atpasea3的表达情况。另一部分细胞加入G418(—种氨基糖苷类抗生素)杀死未转染细胞，并扩大培养，进行靶点筛选。将扩大培养的过表达Atpasea3基因的细胞，按照1.6X105个/孔分装到24孔培养板中，一天后转染各组的RNAi质粒，方法同前。36h后收取蛋白，进行WesternBlotting实验(1)一抗孵育用含5%牛奶的TBST分别稀释兔抗GFP多抗4'C下与封闭好的PVDF膜孵育过夜，然后洗膜，TBST洗膜3次，每次10min。(2)二抗孵育用含5W牛奶的TBST稀释与一抗相应的辣根过氧化物酶驴抗兔二抗，于室温下孵育2h，然后洗膜，TBST洗膜3次，每次10min。(内参基因实验中，加入小鼠抗e-Actin单抗，以及羊抗小鼠二抗。)7.用4XLysisBuffer裂解液制备蛋白样品，10%SDS-PAGE电泳后，将蛋白样品转移到PVDF膜上，然后杂交、暗盒显色)，曝光10min。取出X光片，晾干，统计分析发现最佳的Atpasea3-shRNA靶点是5tt(即实施例l所示序列)，见图3，准备将其制备成慢病毒。实施例4重组慢病毒LV-Atpasea3系统的制备过程1.将实施例2中的Atpasea3-shRNA慢病毒质粒进行测序，该结果正确。大量抽提该慢病毒质粒，做好标记和记录。2.将1.2X10'个293T细胞接种于直径为15cm的培养皿，在37'C、5%0)2条件下培养过夜。3.转染前2h，将293T细胞培养基更换为无血清培养基。4.DNA溶液的制备向灭菌离心管中加入Atpasea3-shRNA慢病毒质粒20ug，以及慢病毒包装质粒pHelper1.0(gag/pol元件)载体15ug，pHelper2.0(V-SVG元件)载体10lig，用0pti-MEM(Invitrogen公司)混合均匀，调整总体积至2.5ml，标记为A管，在室温下温育5min。取100piLipofectamine2000试剂在另一管中与2.4mlOpti-MEM混合，标记为B管，在室温下温育5min。把A与B管混合后，在室温下温育20min，将混合液加入293T细胞中，混匀，于37'C、5%0)2培养8h。5.倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。6.每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基25ml，继续培养48h。7.病毒的收获及浓縮收集步骤6中培养好的293T细胞上清液，用0.45nm滤器过滤，细胞可以扩大培养，持续收集病毒上清。离心浓縮装置，制备病毒浓縮液。8.测定病毒滴度，并制备出5X108TU/mlLV-Atpasea3病毒。9.对病毒进行热源检测、微生物检测，确保无热源，无细菌、真菌、野生病毒污染。11所述过程见图4。实施例5重组慢病毒LV-Atpasea3体外实验采用1，25-(0H)2D3(双羟基维生素，Sigma公司)诱导培养破骨细胞法，用培养基[1X10"W)1/L的1，25-(0H)2D3的a-MEM(Invitrogen公司)]接种骨髓单核细胞至预置骨片24孔板，每孔1.5Xl(f个细胞，37°C、5%C02、饱和湿度下培养6天时，去培养基、清洗各孔后，然后加入400WEIS缓冲液(EnhancedInfectionSolution,上海吉凯基因化学技术有限公司)，取上述5Xl(fTU/ml浓度的LV-Atpasea3慢病毒以及对照(阴性慢病毒)各5W，分别加入上述培养破骨细胞的缓冲液中，轻轻左右混匀液体后，8h后再加入400WEIS缓冲液继续培养，转染48h后，再加入lml培养基(含lXl(Tmol/L的1，25-(0H)2D3的a-MEM)。处理转染96h的细胞，抽提总RNA进行RealTime-PCR定量检测，可见靶基因的Atpasea3的mRNA表达水平明显下降。处理转染96h后的骨片，经固定、超声波清洗、系列酒精、1%甲苯胺兰染色后，光镜下观察骨片上骨陷窝(200倍放大)，对各组骨吸收陷窝进行观察、摄像，利用软件图像分析系统计整张骨片上骨吸收陷窝面积之和(mm2/片)，可见LV-Atpasea3阳性病毒转染后的骨吸收功能明显收到抑制，如图5所示。以上内容是结合具体的实施方案对本发明所作的进一步详细说明，不能单纯认定本发明的具体实施仅局限于这些说明，对本发明所属的
技术领域：
内，在本发明设计的前提下，还可以做出若干的推演，都应认定属于本发明的保护范围。能够与Atpasea3的mRNA反向互补的所有其他19-21个碱基序列的小干扰RNA、编码此类小干扰RNA的相应shRNA的DNA模板、以及含有这些DNA模板的重组慢病毒也同样可实施到本发明中。序列〈110>浙江省中医院〈120〉抑制大鼠Atpasea3基因表达的siRNA、重组慢病毒及在治疗骨吸收异常疾病的药物中的应用〈130>zhejiangzhyyl〈160>13<170>Patentlnversion3.3〈210>1〈211>19〈212〉RNA<213>Artificial〈220〉〈223>siRNA序列<400>1cacucagagaaggccuaca19<210>2<211>1913<212>RNA〈213>Artificial〈220>〈223〉siRNA序列〈400〉2uguaggccuucucugagug19〈210>3〈211〉59<212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉编码含有siRNA序列的小发卡RNA的DNA<400〉3taacactcagagaaggcctacattcaagagatgtaggccttctctgagtgttttttttc59〈210〉4〈211〉63〈212〉DNA<213>Artificial〈220〉<223>编码含有siRNA序列的小发卡RNA的DNA<400>4tcgagaaaaaaaacactcagagaaggcctacatctcttgaatgtaggccttctctgagtg60tta63〈210>5〈211>49<212>薩〈213〉Artificial〈220><223〉小发卡RNA〈400>5cacucagagaaggccuacauucaagagauguaggccuucucugaguguu49〈210〉6<211>55〈212〉DNA<213>Artificial<220〉〈223>RNA干扰阴性对照DNA序列正义链〈400〉6tttctccgaacgtgtcacgtttcaagagaacgtgacacgttcggagaattttttc55〈210>7<211>59<212>腿〈213>Artificial〈220><223>RNA干扰阴性对照DNA序列反义链〈400〉7tcgagaaaaaattctccgaacgtgtcacgttctcttgaaacgtgacacgttcggagaaa59<210〉8〈211〉20<212>DNA〈213〉Artificial<220〉<223>Atpasea3-shRNA慢病毒质粒鉴定正向引物<400>8gtgtcactaggcgggaacac20<210〉9<211〉21〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉Atpasea3-shRNA慢病毒质粒鉴定反向引物<400>9ttattcccatgcgacggtatc21〈210〉10〈211〉77〈212〉腿〈213〉Artificial<220〉〈223〉Atpasea3基因正向引物<400>10ccggaattctgactacaaggatgacgatgacaaggattacaaagacgacgatgataagct60c肪cgaatcggtgagtg7717<210>11〈211>30〈212>DNA<213>Artificial<220>〈223>Atpasea3基因引物反向引物〈400〉11cgcggatccgtcactgtccacagtgaaggc30<210>12<211>20〈212〉腿〈213>Artificial<220><223>Atpasea3基因融合蛋白载体鉴定正向引物〈400〉12gccttcatcttccggatctg20〈210〉13<211>22〈212〉DNA〈213>Artificial<220><223〉Atpasea3基因融合蛋白载体鉴定反向引物〈400〉13catggtcctgctggagttcgtg2219权利要求1.一种抑制大鼠Atpasea3基因表达的siRNA，其特征在于所述siRNA由SeqIDNO.1与SeqIDNO.2杂交而成。2.—种权利要求1所述的siRNA在制备治疗骨吸收异常疾病的药物中的应用。3.—种编码含有权利要求1所述siRNA序列的小发卡RNA的DNA。4.根据权利要求3所述的DNA，其特征在于所述DNA含有一个Loop环、//paI和I酶切位点。5.根据权利要求3所述的DNA，其特征在于所述DNA为双链，由SeqIDNO.3和SeqIDN0.4杂交而成。6.—种权利要求3-5中任意一项所述的DNA在制备用于通过抑制Atpasea3基因表达治疗骨吸收异常疾病的新型药物中的应用。7.—种抑制Atpasea3基因表达的重组慢病毒，其特征在于所述携带重组慢病毒含有权利要求3-5中任意一项所述的DNA和慢病毒载体。8.根据权利要求7所述的一种抑制Atpasea3基因表达的重组慢病毒，其特征在于所述慢病毒是自身失活的pGCL-GFPpLL3.7慢病毒载体、质粒载体pHelper1.0和pHelper2.0共转染293T细胞获得的包装重组慢病毒。9.根据权利要求7或8所述重组慢病毒，其特征在于所述重组慢病毒载体携带绿色荧光蛋白基因序列。10.—种权利要求7或8所述重组慢病毒在制备治疗骨吸收异常疾病的药物中的应用。全文摘要本发明提供一种能够有效特异地沉默Atpasea3基因的siRNA序列、编码含有该siRNA序列的shRNA的DNA序列以及重组慢病毒，以克服现有抑制破骨细胞的药物效率低下、特异性差的问题。所述siRNA由SeqIDNO.1与SeqIDNO.2杂交而成。所述DNA由SeqIDNO.3与SeqIDNO.4杂交而成。本发明提供所述的siRNA、DNA及其重组慢病毒。本发明的siRNA、编码shRNA的DNA以及重组慢病毒，能够有效的抑制Atpasea3基因表达，显著的抑制了破骨细胞的骨吸收功能，可以在制备治疗骨吸收异常疾病的药物中进行应用，从而达到治疗骨吸收异常疾病的目的。文档编号C12N15/11GK101580833SQ200910026849公开日2009年11月18日申请日期2009年6月2日优先权日2009年6月2日发明者杜文喜,童培建,肖鲁伟申请人:浙江省中医院