一种培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽医微生物学技术领域，涉及一种高效培养猪肺炎支原体培养基及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪支原体肺炎又称猪地方性流行肺炎（Swine enzootic hyopneumoniae)，我国俗 称猪喘气病，是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种慢性、接触性、呼 吸道传染病。主要临诊症状是咳嗽和气喘，常有其他病菌（如多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆 菌、猪胸膜肺炎放线杆菌等）继发感染。本病广泛分布于世界各地，在我国许多地区的猪场 都有发生。由于带菌病猪的存在和分布较广，通常会引起猪群生产性能显著下降，受感染猪 群日增重下降，饲料报酬降低，上市时间延迟，猪群生长均匀度较差，药物治疗成本增加，因 而给猪场造成较为严重的经济损失。由国内外临床经验可知，接种疫苗，能够显著的降低猪 肺炎病变程度，降低饲养成本，是一种比较可行的预防方法。
[0003] 目前培养猪肺炎支原体的培养基主要有1975年Goodwin等发明的Friis培养基， 1975年江苏农科院发明的养基，2000年版兽医生物制品制造及检验规程中提出的猪 肺炎支原体培养基，2006年农业行业标准中提出的A26培养基。
[0004] 以上述传统培养基及培养工艺培养自行分离的猪肺炎支原体CJ株的共同缺点 是，生长速度较慢，且含菌量较低（在I. ox l(T8CCU/ml之间），从而影响疫苗的免疫效力。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于，提供一种培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法，该培养基 是由基础培养基和辅助培养基制成，采用先配制基础培养基，再配制辅助培养基，然后混 合，调整PH，过滤除菌，即得到猪肺炎支原体液体或固体培养基。本发明所述的猪肺炎支原 体培养基培养猪肺炎支原体CJ株的生长时间为2-3日，含菌量为1. 0 X KTkiCXUAI，达到 最终含菌量的测定时间为9-10日，说明本发明制备的培养基培养猪肺炎支原体CJ株含菌 量高于现有技术的培养基，具有生长迅速，含菌量高的特点；该培养基制备方法工艺简单， 适合工业化大生产。适用于培养猪肺炎支原体CJ株生长。
[0006] 本发明所述的一种培养猪肺炎支原体的培养基，该培养基是由基础培养基为PPLO 肉汤粉3. 0-5. 0g、脑心浸液粉2. 0-4. 0g、去离子水660-740. 0ml、琼脂粉0-15. 0g，辅助培养 基为10X汉克氏平衡盐溶液20-40. 0ml、酵母浸出液20-40. 0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌 肽粉5-20U/ml、0. 25%酚红5-10. 0ml、灭活的猪血清100-250. Oml制成。
[0007] 所述的培养猪肺炎支原体培养基的制备方法，按下列步骤进行：
[0008] a、制备基础培养基：
[0009] 将基础培养基为PPLO肉汤粉3. 0-5. 0g、脑心浸液粉2. 0-4. 0g、去离子水 660-740. Oml和琼脂粉0-15. Og混合搅拌均匀，使之完全溶解，在温度KKTC加热10分钟， 冷却后备用；
[0010] b、制备辅助培养基：
[0011] 将辅助培养基为IOX汉克氏（Hanf S)平衡盐溶液20-40. 0ml、酵母浸出液 20-40. 0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉5-20U/ml、0. 25%酚红5-10. Oml和灭活的猪血 清100-250. Oml混合搅拌均匀，使之完全溶解，在温度4°C保存备用；
[0012] c、将步骤a基础培养基和步骤b辅助培养基混合，用lmol/L氢氧化钠溶液调整pH 值至7. 6,用0. 22 μ m滤膜过滤除菌，即得猪肺炎支原体的液体或固体培养基。
[0013] 该培养基中的酵母浸出液为取干酵母粉100g，加去离子水1000ml，充分混匀后， 在温度37°C下发酵60分钟，煮沸10分钟，冷却，再以lOOOOr/min离心20分钟，收取上清 液，将上清液过滤除菌，定量分装，置于温度2-8 °C保存备用。
[0014] 该培养基中的 IOXHank' s 平衡盐溶液为 CaCl2L 4g，KCl 4. 0g，KH2PO4O. 6g， MgCl2 · 6H20 I. 0g，MgSO4 · 7H20 I. 0g，NaCl 80. 0g，Na2HPO4 · 12H20 I. 5g，加去离子水至 IOOOml0
[0015] 该培养基中的PPLO肉汤粉为BD公司生产，货号为255420 ;脑心浸液粉为BD公司 生产，货号为237500 ;琼脂粉为BD公司生产，货号为214230 ;猪血清为Hyclone公司生产， 货号：SH30908. 04 ;青霉素为Sigma公司生产，货号为PENK-100MU ;杆菌肽粉为MERCK公司 生产，货号为B0125-1250KU ;酚红为Sigma公司生产，货号为P3532 ;无机盐为MERCK公司生 产；干酵母粉为安琪公司生产。
[0016] 本发明所述的一种培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法，该猪肺炎支原体培养 基运用微生物学、无机、有机分析化学的技术原理，对不同的碳源、氮源、无机盐、蛋白质和 胆固醇等诸多营养组分的组合进行了筛选，对培养基的pH值、渗透压、离子强度等进行了 比较与分析，研宄出了适合猪肺炎支原体快速生长的培养基。给培养基的配方中除了基本 成分外，在培养基中还添加了新鲜酵母浸出液，上述成分的添加能明显提高猪肺炎支原体 的含菌量；未添加前的含菌量为I. OX l(T8(XU/ml，添加后的含菌量为LoxkTkiCXUAI ; 含菌量高于现有技术的培养基。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1
[0018] a、制备基础培养基：
[0019] 将基础培养基为PPLO肉汤粉5. 0g、脑心浸液粉4. 0g、去离子水660ml混合搅拌均 匀，使之完全溶解，在温度l〇〇°C加热10分钟，冷却后备用；
[0020] b、制备辅助培养基：
[0021] 配制酵母浸出液：取干酵母粉100g，加去离子水1000ml，充分混匀后，在温度37°C 下发酵60分钟，煮沸10分钟，冷却，再以10000r/min离心20分钟，收取上清液，将上清液 过滤除菌，定量分装，置于温度2°C保存备用；
[0022] 配制 IOXHank，s 平衡盐溶液：取 CaCl2L 4g，KCl 4. 0g，KH2PO4O. 6g， MgCl2 · 6Η201· 0g，MgSO4 · 7H20 I. 0g，NaCl 80. 0g，Na2HPO4 · 12H20 I. 5g，加去离子水至 1000. 0ml 备用；
[0023] 将辅助培养基为10X汉克氏平衡盐溶液40ml、酵母浸出液40ml、青霉素300U/ml、 杆菌肽粉20U/ml、0. 25%酚红10ml、灭活的猪血清250ml混合搅拌均匀，使之完全溶解，在 温度4°C保存备用；
[0024] c、将步骤a基础培养基和步骤b辅助培养基混合，用lmol/L氢氧化钠溶液调整pH 值至7. 6,用0. 22 μ m滤膜过滤除菌，即得猪肺炎支原体的液体培养基。
[0025] 实施例2
[0026] a、制备基础培养基：
[0027] 将基础培养基为PPLO肉汤粉4. 0g、脑心浸液粉3. 0g、去离子水700. Oml混合搅拌 均匀，使之完全溶解，在温度l〇〇°C加热10分钟，冷却后备用；
[0028] b、制备辅助培养基：
[0029] 配制酵母浸出液：取干酵母粉100g，加去离子水1000ml，充分混匀后，在温度37°C 下发酵60分钟，煮沸10分钟，冷却，再以lOOOOr/min离心20分钟，收取上清液，将上清液 过滤除菌，定量分装，置于温度4°C保存备用；
[0030] 配制 IOXHank，s 平衡盐溶液：取 CaCl2L 4g，KCl 4. 0g，KH2PO4O. 6g， MgCl2 · 6Η201· 0g，MgSO4 · 7H20 I. 0g，NaCl 80. 0g，Na2HPO4 · 12H20 I.