专利名称：：抗猪肺炎支原体SIgA间接ELISA检测方法
技术领域：
：本发明属于生物检测
技术领域：
。特别是涉及抗猪肺炎支原体SIgA间接ELISA的检测方法。用于猪肺炎支原体感染临床检测、流行病学调查及免疫监测。
背景技术：
：猪肺炎支原体(Mycqp/a，a/z"/7朋wmom'ae，Mj;)是引起猪气喘病(MPS)的病原。后者是猪群中流行最广、传播最快、最难净化的疫病之一。猪肺炎支原体通过呼吸道传播，感染呼吸道上皮后导致呼吸道纤毛萎縮、脱落、损坏，上皮细胞坏死，降低呼吸道粘膜的免疫功能，引起肺部功能损伤，容易产生其它呼吸道病原的继发感染。研究表明，对MPS的预防主要通过呼吸道局部的细胞免疫和粘膜免疫。slgA是参与粘膜免疫反应的主要效应因子。它们是机体免疫系统中的重要组成部分，在免疫应答中分别起着重要作用。SIgA能够抗病毒、中和毒素及其它生物活性抗原，具有广泛的免疫保护作用，伹最主要的保护作用是阻止细菌对上皮细胞表面粘附，并清除入侵的病原。它也是病原体侵入后最先产生的免疫反应，因此，常根据特异性IgA的检测作疾病的早期诊断。抗猪肺炎支原体IgA是M^感染或免疫后在呼吸道首先产生的特异性标志，同时也反映了疫苗免疫后的保护效果。猪肺炎支原体的诊断方法包括病原检测和血清抗体检测。病原检测方法包括病原的分离与鉴定，聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR和原位杂交法等。这些方法虽都有各自的优点，但也存在耗时较长、检测难度大、检测结果不确定性、所需设备条件和不适合活体检测等缺点。血清抗体检测方法包括微量间接血凝试验(IHA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。但是，IHA的检测中存在着检测滴度低、结果与感染的相关性低、凝集终点判定的主观性较强以及本身固有的技术缺陷等问题，因此IHA在商品猪群的Mp检测中实际应用前景有限。ELISA是目前应用最广泛的检测技术。它具有敏感、特异和快速的特点，且需要的技术和设备要求也不高，非常适用于目前的生产实际。然而，目前所用的ELISA方法均是用来检测Jkft;IgG抗体。由于猪肺炎支原体感染后，IgG抗体产生相对较慢；且研究表明，全身的体液免疫对该病原的免疫保护作用不大。相反，呼吸道局部产生的黏膜免疫和细胞免疫能产生较好的免疫保护效果。因此，建立SIgA的ELISA检测方法更适用于该病的早期诊断与主动免疫后免疫指标的监P97R1是M^粘附素P97蛋白的一个重复单元。R1区是P97蛋白产生粘附能力的主要功能区。Mp通过粘附感染猪支气管纤毛上皮细胞，继而产生后续的致病作用。机体针对支原体的粘附能迅速产生相应的粘膜免疫反应。若利用P97R1蛋白作为包被原能在感染后第一时间检测到相应的SIgA反应，适合于该病的早期诊断。且P97蛋白具有种属特异性，与其它猪支原体不存在血清学交叉干扰。
发明内容技术问题针对上述领域中的缺陷，本发明提供了一种抗猪肺炎支原体SIgA间接ELISA的检测方法，其抗原制备工艺简单、生物安全度高、成本低廉、易于生产和应用等特点，为进一步开发与研究猪肺炎支原体SIgA抗体检测试剂盒奠定基础。技术方案一种抗猪肺炎支原体SIgA的间接ELISA检测方法，其包被抗原为由大肠杆菌原核表达的猪肺炎支原体P97R1蛋白，以猪肺脏灌洗液或鼻拭子为检测样品，以羊抗猪IgA为二抗，以辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG为酶标三抗进行检测猪肺炎支原体SIgA抗体。包括，1)ELISA检测用试剂及溶液(1)羊抗猪IgA抗体(2)辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG(3)包被液即碳酸盐缓冲液NaC031.59g，NaHC032.93g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH值到9.6;(4)磷酸盐缓冲液即0.01MPBS:NaCl8.0g，KC10.2g，KH2P040.2g，Na2HP0412H202.9g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH值至(j7.4;(5)封闭液lg牛血清白蛋白BSA用磷酸盐缓冲液定容至100mL;(6)洗涤液含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液；(7)稀释液0.01M,pH7.4磷酸盐缓冲液；(8)底物缓冲液0.2mol/LNa2HPO4:取Na2HPCU12H2014.33g，加蒸馏水150mL，完全溶解后，定容至200mL;0.1mol/L拧檬酸取拧檬酸0.84g，加蒸馏水150mL，完全溶解后，定容至200mL;(9)底物显色液四甲基联苯胺TMB底物显色液；(10)终止液即2MH2S04:21.7mL浓硫酸缓慢加入178.3mL蒸馏水中；2)阴阳性标准品的釆集(1)以Mp阴性母猪所产3-5日龄仔猪的肺脏灌洗液或鼻拭子为阴性标准品；(2)以经猪支原体肺炎活疫苗168株两次肺内免疫后的仔猪肺脏灌洗液或鼻拭子为阳性标准品；(3)猪肺脏灌洗液的采集方法将猪剖杀后，通过气管向肺脏内灌入50ml灭菌生理盐水，按摩肺脏15s，收集灌洗液约10ml，将灌洗液于低温1000-5000rpm离心10min,收集上清作为检测样品，于-20'C冻存备用；(4)猪鼻拭子样品的采集用棉签采集猪两鼻孔拭子，将拭子于lmL灭菌生理盐水中于4。C浸泡过夜，挤干后取出，浸泡液于低温1000-5000rpm离心10min，收集上清作为检测样品，于-2(TC冻存备用；3)检测样品的准备检测样品为肺脏灌洗液或鼻拭子，具体采集方法同阴阳性标准品的采集；4)ELISA操作方法(1)包被用包被液将权利要求l所述P97Rl蛋白稀释成l-25pg/mL，包被ELISA板，每孔加100uL，于37。C温育2h后，再放入4。C过夜，倒出孔内液体，加入200yL/孔洗涤液，每次3min，拍干，重复洗涤3次；；(2)封闭每孔加入封闭液20(HiL，于37。C封闭2h，倒出孔内液体，洗涤3次；封闭液为lg牛血清白蛋白BSA用磷酸盐缓冲液定容至100mL;(3)加检测样品每孔加入100pL检测样品，另设两个阴性标准孔和两个阳性标准孔，于37'C温育2h，倒出孔内液体，洗涤3次；(4)加二抗每孔加入100nL经稀释液l:1000-l:10000稀释的羊抗猪IgA抗体，于37"C温育lh，倒出孔内液体，洗涤3次；(5)加酶标三抗每孔加入经稀释液1:5000-1:20000稀释的100)aL辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG，于37'C温育lh，倒出孔内液体，洗涤5次；(6)加显色液每孔加入100nL新鲜配制的TMB显色液，于37。C避光作用10min;(7)终止每孔加入50pL终止液，酶标仪检测450nm处OD值；(8)结果判定样品中SIgA效价用S/P值确定，S/P=(检测样品OD值-阴性标准品OD值)/(阳性标准品OD值-阴性标准品OD值)，S/P值X).15判为阳性；S/P值0.1判为阴性；当0.KS/PO.15时，判为疑似。有益效果本发明中所用的包被抗原P97R1是利用引物定点突变PCR方法，扩增猪肺炎支原体黏附因子P97的抗原决定簇R1区段，将Rl区基因插入表达载体pET-32(+)中构建重组质粒pET-32(+)-P97(Rl)，再将该重组质粒转入大肠杆菌BL21中进行原核表达而形成的融合蛋白。(刘茂军，邵国青，张映，聂向庭.猪肺炎支原体P97基因抗原决定簇R1区的克隆与表达.江苏农业学报.2005.21(3):207-11)本发明使用P97R1蛋白作为包被原，一方面是由于P97R1是猪肺炎支原体黏附素的功能区，在感染后第一时间机体能分泌针对其的SIgA反应。从而可以为该病原的感染作早期诊断；另一方面，P97R1又具有种属特异性，与其它猪支原体不存在血清学交叉干扰，从而可以保证该检测方法的特异性。图l:抗猪肺炎支原体SIgA间接ELISA技术路线示意图图2:猪肺炎支原体P97R1融合蛋白的SDS-PAGE分析M.ProteinMaker1.未诱导pET-32(+)载体表达产物2.诱导后pET-32(+)载体表达蛋白3.未诱导pET-32(+)-P97(Rl)载体表达蛋白4.诱导后pET-32(+)-P97(Rl)载体表达蛋白具体实施方式(一)材料的准备1.包被抗原P97R1蛋白。将重组质粒pET-32(+)-P97(Rl)按文献(刘茂军，邵国青，张映，聂向庭.猪肺炎支原体P97基因抗原决定簇R1区的克隆与表达.江苏农业学报.2005.21(3):207-11)方法表达P97R1蛋白并纯化，经SDS-PAGE分析确定(如图2)。2.ELISA检测用试剂及溶液。(1)羊抗猪IgA抗体美国BETHYL公司(2)辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG武汉博士德公司(3)包被液(碳酸盐缓冲液)NaC031.59g，NaHC032.93g,加蒸馏水定容至1000mL，调pH值到9.6。(4)磷酸盐缓冲液(0.01MPBS):NaCl8.0g，KC10.2g，KH2P040.2g,Na2HP0412H202.9g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH值到7.4。(5)封闭液lg牛血清白蛋白(BSA)用磷酸盐缓冲液，定容至100mL(6)洗涤液含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液。(7)稀释液0.01M，pH7.4磷酸盐缓冲液。(8)底物缓冲液0.2mol/LNa2HPO4:取Na2HP0412H2014.33g，加蒸馏水150mL，完全溶解后，定容至200mL。0.1mol/L柠檬酸取柠檬酸0.84g，加蒸馏水150mL，完全溶解后，定容至200mL。(9)底物显色液TMB(四甲基联苯胺)底物显色液。(10)终止液(2MH2S04):21.7mL浓硫酸缓慢加入178.3mL蒸馏水中。3.阴阳性标准品的采集(1)以iWV抗体阴性母猪(经美国IDEXX公司的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒检测M^抗体为阴性的母猪，购自江苏农林职业技术学院试验猪场)所产3-5日龄仔猪的肺脏灌洗液或鼻拭子为阴性标准品。(2)以经猪支原体肺炎活疫苗168株(购自南京天邦生物科技有限公司)两次肺内免疫后的仔猪肺脏灌洗液或鼻拭子为阳性标准品。(3)猪肺脏灌洗液的采集方法将猪剖杀后，通过气管向肺脏内灌入50ml灭菌生理盐水，按摩肺脏15s，收集灌洗液约10ml，将灌洗液于低温2000rpm离心10min，收集上清作为检测样品，于-20r冻存备用。(4)猪鼻拭子样品的采集用棉签采集猪两鼻孔拭子，将拭子于lmL灭菌生理盐水中于4'C浸泡过夜，挤干后取出，浸泡液于低温2000rpm离心10min,收集上清作为检测样品，于-2(TC冻存备用。4.检测样品的准备检测样品主要为肺脏灌洗液或鼻拭子，具体采集方法同阴阳性标准品的采集。(二)ELISA操作方法(1)包被用紫外分光光度法测定纯化后的P97R1蛋白浓度，用包被液将P97R1蛋白稀释成5yg/mL，包被ELISA板，每孔加100lxL。于37'C温育2h后，再放入4"过夜。倒出孔内液体，加入200uL/孔洗涤液，每次3min，拍干，重复洗涤3次。(2)封闭用每孔加入封闭液200^iL，于37'C封闭2h。倒出孔内液体，洗涤3次。(3)加检测样品每孔加入10(VL检测样品，另设两个阴性标准孔和两个阳性标准孔，于37'C温育2h，倒出孔内液体，洗涤3次。(4)加二抗每孔加入100pL经稀释液h5000稀释的羊抗猪IgA抗体，于37。C温育lh，倒出孔内液体，洗涤3次。(5)加酶标三抗每孔加入经稀释液l:8000稀释的100pL辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG，于37"C温育lh，倒出孔内液体，洗涤5次。(6)加显色液每孔加入100^iL新鲜配制的TMB显色液，于37。C避光作用10min。(7)终止每孔加入50nL终止液，酶标仪检测450nm处OD值。(8)结果判定样品中SIgA效价用S/P值确定，S/P=(检测样品OD值-阴性标准品OD值)/(阳性标准品OD值-阴性标准品OD值)，S/P值X).15判为阳性；S/P值0.1判为阴性；当0.KS/PO.15时，判为疑似；(三)应用实例1.临床样品检测(1)样品采集随机采集6份临床样品，以采集鼻拭子为例。采集与处理方法同上。(2)检测具体方法同上。(3)结果与判定-:测定各样品OD45。值，并计算S/P值，根据上述标准判定结果，如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.免疫效果评价(1)样品采集分别采集试验猪经猪支原体肺炎活疫苗肺内免疫前、免疫后2周、4周、6周和8周的样品。以肺脏灌洗液为例。采集与处理方法同上。(2)检测具体方法同上。(3)结果测定各样品OD450值，并计算S/P值，根据上述标准判定结果，如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>上述结果表明，利用本发明可以成功地用于猪肺炎支原体感染的临床检测及免疫效果评价，且鼻拭子和肺脏灌洗液均可作为检测样品。权利要求1.一种抗猪肺炎支原体SIgA的间接ELISA检测方法，其包被抗原为由大肠杆菌原核表达的猪肺炎支原体P97R1蛋白，以猪肺脏灌洗液或鼻拭子为检测样品，以羊抗猪IgA为二抗，以辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG为酶标三抗进行检测猪肺炎支原体SIgA抗体。2.根据权利要求l所述的检测方法，其特征在于，1)ELISA检测用试剂及溶液(1)羊抗猪IgA抗体(2)辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG(3)包被液即碳酸盐缓冲液NaC031.59g，NaHC032.93g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH值到9.6;(4)磷酸盐缓冲液即0.01MPBS:NaCl8.0g，KC10.2g，KH2P040.2g，Na2HP0412H202.9g，加蒸馏水定容至1000mL,调pH值到7.4;(5)封闭液lg牛血清白蛋白BSA用磷酸盐缓冲液定容至100mL;(6)洗涤液含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液；(7)稀释液O.OIM，pH7.4磷酸盐缓冲液；(8)底物缓冲液、0.2mol/LNa2HP04:取Na2HP0412H2014.33g，加蒸馏水150mL，完全溶解后，定容至200mL;、0.1mol/L柠檬酸取柠檬酸0.84g，加蒸馏水150mL，完全溶解后，定容至200mL;(9)底物显色液四甲基联苯胺TMB底物显色液；(10)终止液即2MH2S04:21.7mL浓硫酸缓慢加入178.3mL蒸馏水中；(2)阴阳性标准品的采集(1)以M^阴性母猪所产3-5日龄仔猪的肺脏灌洗液或鼻拭子为阴性标准品；(2)以经猪支原体肺炎活疫苗168株两次肺内免疫后的仔猪肺脏灌洗液或鼻拭子为阳性标准品；(3)猪肺脏灌洗液的采集方法将猪剖杀后，通过气管向肺脏内灌入50ml灭菌生理盐水，按摩肺脏15s,收集灌洗液约10ml，将灌洗液于低温1000-5000rpm离心10min，收集上清作为检测样品，于-20。C冻存备用；(4)猪鼻拭子样品的采集用棉签采集猪两鼻孔拭子，将拭子于lmL灭菌生理盐水中于4。C浸泡过夜，挤干后取出，浸泡液于低温1000-5000rpm离心10min，收集上清作为检测样品，于-2(TC冻存备用；3)检测样品的准备检测样品为肺脏灌洗液或鼻拭子，具体采集方法同阴阳性标准品的采集；4)ELISA操作方法(1)包被用包被液将权利要求l所述P97Rl蛋白稀释成l-25pg/mL，包被ELISA板，每孔加100"L，于37。C温育2h后，再放入4。C过夜，倒出孔内液体，加入200yL/孔洗涤液，每次3min,拍干，重复洗涤3次；；(2)封闭每孔加入封闭液200pL，于37'C封闭2h,倒出孔内液体，洗涤3次；封闭液为lg牛血清白蛋白BSA用磷酸盐缓冲液定容至100mL;(3)加检测样品每孔加入10(^L检测样品，另设两个阴性标准孔和两个阳性标准孔，于37'C温育2h，倒出孔内液体，洗涤3次；(4)加二抗每孔加入100pL经稀释液l:1000-l:10000稀释的羊抗猪IgA抗体，于37。C温育lh，倒出孔内液体，洗涤3次；(5)加酶标三抗每孔加入经稀释液l:5000-1:20000稀释的100)aL辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG，于37卩温育lh，倒出孔内液体，洗涤5次；(6)加显色液每孔加入100pL新鲜配制的TMB显色液，于37'C避光作用10min;(7)终止每孔加入50(aL终止液，酶标仪检测450nm处OD值；(8)结果判定样品中SIgA效价用S/P值确定，S/P=(检测样品OD值-阴性标准品OD值)/(阳性标准品OD值-阴性标准品OD值)，S/P值X).15判为阳性；S/P值0.1判为阴性；当0.KS/PO.15时，判为疑似。全文摘要本发明公开了一种抗猪肺炎支原体SIgA间接ELISA检测方法，涉及生物检测
技术领域：
。主要经由抗原预包被条制备、酶结合物制备、其它试剂的配制、检测。利用羊抗猪IgA结合已与固相猪肺炎支原体P97R1蛋白抗原结合的受检测猪肺炎支原体SIgA，再通过辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG结合羊抗猪IgA，最终检测待检样品中猪肺炎支原体SIgA抗体。其检测方法灵敏度高、特异性强，操作方法简便易行，可以标准化为产品，用于肺炎猪支原体感染的临床检测、流行病学调查和主动免疫效果检测。文档编号G01N33/569GK101545904SQ20091002570公开日2009年9月30日申请日期2009年3月6日优先权日2009年3月6日发明者冯志新,刘茂军,源甘,逯晓敏,邵国青申请人:江苏省农业科学院