专利名称：一种肺炎支原体的培养与检测方法
技术领域：
本发明涉及一种肺炎支原体的培养与检测方法，属于微生物培养技术领域。
背景技术：
肺炎支原体(M. pneumonia)是人类急性呼吸道感染的重要病原微生物之一，主要通过呼吸道和飞沫传播，可引起学龄儿童和青少年下呼吸道感染，如非典型性肺炎、气管炎、支气管炎等；还可引起其他系统的肺外并发症，如脑膜炎、脑干炎、心肌炎、心包炎、肾炎等。肺炎支原体是一类缺乏细胞壁、有别于细胞和病毒的原核微生物。其种类繁多、分布广泛，其大小一般在O. 2-0. 3um之间，可以通过一般除菌滤器。肺炎支原体感染的临床症状具有不典型性，较难与其他原因引起的呼吸道感染进行辨别；临床痰样本中肺炎支原体通常被吸附、包裹在粘稠的蛋白胶体中，生长受到限制，且痰样本中常混有大量不同种类的杂菌，临·床上无法直接用于液体培养；而痰样本直接在固体培养基上生长较慢，长出菌落需要3-4天的时间，且阳性率不高；此外，已使用抗生素的临床痰样本中受损的支原体，需要一个复苏的过程，才能快速生长。这些均成为临床肺炎支原体检测的障碍，因此快速、准确、有效地检测支原体对临床疾病的预防和治疗具有十分重要的意义。目前国内外常用的肺炎支原体检测方法有特异性抗体检测技术、Southern Blot、PCR法、分离培养法、代谢抑制试验等。特异性抗体检测技术，易出现交叉反应，并且特异性IgM在感染后I周出现,3 4周达高峰,特异性IgG出现更晚,一般在6周左右。SouthernBlot对实验技术要求很高，不易普遍开展。PCR法容易出现假阳性和假阴性，已被国家卫生部下令禁止用于临床检验。代谢抑制试验，需加特异性抗体抑制支原体的生长，临床应用不多。总的来说，上述方法不仅检测时间长，操作繁琐，而且需要一些精密的仪器设备，需要专业技术人员进行试验，使用不方便。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种针对肺炎支原体特性设计、培养肺炎支原体快捷方便、鉴定肺炎支原体准确率高、满足临床痰样本培养与检测需要、可有效复苏肺炎支原体的培养与检测方法。本发明的目的是这样实现的一种肺炎支原体的培养与检测方法，其包括如下步骤
步骤一将临床痰样本接种到备有消化培养液的培养瓶I中；
步骤二 培养瓶I上依次装配设置有密封圈1、密封圈I1、垫片、滤膜、滤膜固定装置的瓶盖和培养瓶II，盖好底盖II ；
步骤三将上述装置以培养瓶I在下、培养瓶II在上的状态置于摇床上，在37度恒温条件下培养12 24小时；
步骤四将上述装置倒置，即培养瓶I在上、培养瓶II在下，通过培养瓶II的抽滤口 II进行负压抽滤，使菌液由培养瓶I流向培养瓶II ；
步骤五通过培养瓶I的底盖I向培养瓶II内加入富集培养液，在37度恒温条件下培养12 24小时；
步骤六通过肉眼和\或仪器观察培养瓶II中培养液的浑浊程度、颜色变化、有无荧光现象，或加入试剂进行进一步的观察。在步骤六中，所述培养瓶II中的培养液鉴定为肺炎支原体呈阳性，继续进行如下操作
步骤七更换新的培养瓶1、瓶盖及瓶盖内的配件，再将备有固体培养基的培养支架置入培养瓶I内，培养盘的正面朝向培养瓶I的瓶壁外侧，盖好底盖I ;
步骤八将上述组装好的装置倒置，即培养瓶I在下、培养瓶II在上，通过抽滤口 I进行负压抽滤，使菌液流入培养瓶I，菌液浸没培养支架，并接种到培养盘内的固体培养基上；
步骤九将上述装置再次倒置，即培养瓶I在上、培养瓶II在下，通过抽滤口 II进行负压抽滤，使菌液流入培养瓶II ；
步骤十将上述装置置于培养箱内，并在适合肺炎支原体的温度下培养24 48小时；步骤十一通过肉眼和\或仪器观察上述装置内培养支架上培养盘中菌落形态。在步骤四和步骤九中，进行负压抽滤时，将所述瓶盖I旋松。在步骤八中，进行负压抽滤时，将所述瓶盖II旋松。本发明的有益效 果是
本发明装置包括培养瓶1、盖中央带有通孔的瓶盖、培养瓶II，所述瓶盖内部设置内螺纹1、内螺纹II和内螺纹III将培养瓶1、培养瓶II与瓶盖连接，培养瓶I内注入消化培养液，培养瓶II内注入富集培养液，培养瓶I内的培养盘内放置培养与检测过的固体培养基。痰样本中的肺炎支原体通过分步培养的方法即痰样本经消化培养液消化、复苏，并完成初步增殖、初步鉴定，再通过选择增菌培养液进行增殖、富集，最后接种到含丰富营养的不同功能的固体培养基中进行再增殖，从而完成肺炎支原体的培养和鉴别。本发明一种肺炎支原体的培养与检测装置，可有效消化临床痰样本，复苏肺炎支原体，抑制、过滤去除杂菌；同时采用固液双相的方法，对肺炎支原体进行选择、增菌、分离培养；操作简便，准确率高，能满足临床痰样本培养与检测的需要。
图1为本发明一种肺炎支原体的培养与检测装置的示意图。
图2为图1中局部I的纵切面的放大的示意图。
图3为图2中瓶盖的纵切面的放大的示意图。
图4为图2中瓶盖的立体示意图。
图5为图2中滤膜固定装置的立体示意图。
图6为培养支架实施例一的立体示意图。
图7为培养支架实施例二的立体示意图。
图8为图7的纵切面的不意图。
其中培养瓶I 100底盖I 101抽滤口 I 102外螺纹I 103瓶盖200通孔201内螺纹I 211内螺纹II 212内螺纹III 213密封槽I 221密封槽II 222垫片槽223培养瓶II 300底盖II 301抽滤口 II 302外螺纹II 303密封圈I 401密封圈II 402垫片500滤膜600
滤膜固定装置700十字通孔701外螺纹II 702 培养支架800培养盘801支杆802。
具体实施例方式参见图1至图5，本发明使用的一种肺炎支原体的培养与检测装置，包括瓶口带有外螺纹I 103的培养瓶I 100与侧壁带有内螺纹I 211、盖中央带有通孔201的瓶盖200以及瓶口设有外螺纹II 303的培养瓶II 300。所述内螺纹I 211的顶部内侧设置密封槽I 221，所述密封槽I 221内设有密封圈I 401，所述培养瓶I 100的外螺纹I 103与瓶盖200的内螺纹I 211连接。所述培养瓶I 100的瓶口肩部设置抽滤口 I 102，并在培养瓶
I100内设置培养支架800，如图6 图8所示。所述培养瓶II 300的底部设置底盖II 301、瓶口肩部设置抽滤口 II 303。所述瓶盖200的侧壁反向延长、并在瓶盖200反向延长的侧壁内侧从下往上依次设置内螺纹II 212和内螺纹III 213，所述内螺纹II 212的内直径小于内螺纹III 213的内直径，通孔201的内直径小于内螺纹II 212的内直径，内螺纹II 212的底部内侧设置垫片槽223，内螺纹III 213的底部内侧设置密封槽II 222，所述密封槽II 222内放置密封圈II 402。所述瓶盖200的内螺纹III 213与培养瓶II 300的外螺纹II 303连接。所述瓶盖200内依次设置垫片500、滤膜600、滤膜固定装置700，所述滤膜固定装置700为中央开设十字通孔701、外壁设有外螺纹II 702的圆柱体，所述垫片500设置在垫片槽223内，滤膜固定装置700的外螺纹II 702与瓶盖200的内螺纹II 212连接。所述培养瓶I 100、瓶盖200、培养瓶II 300、密封圈I 401、密封圈II 402、垫片500、滤膜600、滤膜固定装置700和培养支架800的中心均同轴。本发明一种肺炎支原体的培养与检测方法，主要包括三个阶段一、消化复苏。将临床痰样本接入培养瓶I 100的消化培养液中，在37度恒温条件下培养12 24小时，直到痰样本中粘稠的痰液完全消化为溶液，肺炎支原体得到复苏、初步增殖。二、富集增殖。将消化复苏后的菌液通过带有微孔滤膜600的瓶盖200，沉降过滤或负压过滤到培养瓶II 300内的选择性富集培养液中，在37度恒温条件下培养12 24小时，使肺炎支原体得到充分富集、增殖。三、分离培养。将富集、增殖后的菌液接种到新的培养瓶I 100中的固体培养基上，在37度恒温条件下培养24 48小时，直至形成清晰、可见的菌落。本发明一种肺炎支原体的培养与检测方法包括如下步骤
一、消化复苏。步骤一将临床痰样本接种到备有消化培养液的培养瓶I 100中；所述消化培养液为含丰富营养物质、消化酶及抑菌药物的选择性增菌、消化培养液，该消化培养液具有解离分散痰样本、抑制杂菌污染、释放并复苏肺炎支原体的作用。
步骤二 培养瓶I 100上依次装配设置有密封圈I 401、密封圈II 402、垫片500、滤膜600、滤膜固定装置700的瓶盖200和培养瓶II 300，盖好底盖II 301。步骤三将上述装置以培养瓶I 100在下、培养瓶II 300在上的状态置于摇床上，在37度恒温条件下培养12 24小时。二、富集增殖。步骤四将上述装置倒置，即培养瓶I 100在上、培养瓶II 300在下，通过培养瓶
II300的抽滤口 II 302进行负压抽滤，滤膜600阻隔杂菌，而使菌液中的肺炎支原体透过滤膜600由培养瓶I 100流向培养瓶II 300。为使菌液流动通畅，可通过旋松瓶盖I 101实现。步骤五通过培养瓶I 100的底盖I 101向培养瓶II 300内加入足量的富集培养液，在37度恒温条件下培养12 24小时；所述富集培养液为含丰富营养物质、抑菌药物和/或变色指示剂的选择性增菌、富集培养液，该富集培养液具有抑制杂菌污染、富集肺炎支原体、指示肺炎支原体生长的作用。步骤六通过肉眼和\或仪器观察培养瓶II 300中培养液的浑浊程度、颜色变化、有无荧光现象，或加入试剂进行进一步的观察。三、分离培养。若在步骤六中，所述培养瓶II 300中培养液鉴定为肺炎支原体呈阳性，则继续进行如下操作。步骤七更换新的培养瓶I 100、瓶盖200及瓶盖200内的配件，再将备有固体培养基的培养支架800置入培养瓶I 100内，培养盘801的正面朝向培养瓶I 100的瓶壁外侧，盖好底盖I 101。所述固体培养基为分离培养基、选择性培养基、生化鉴别培养基中的一种或多种；这类培养基包括但不限于显色培养基，或者是一种培养基，在菌落形成后能和随后加入的特定化合物起反应，并呈现出一些外观的变化，如变色、产生气泡等；该类培养基具有分离，筛选，鉴别肺炎支原体的作用。步骤八将上述组装好的装置倒置，即培养瓶I 100在下、培养瓶II 300在上，通过抽滤口 I 102进行负压抽滤，使菌液流入培养瓶I 100，菌液浸没培养支架800，并接种到培养盘801内的固体培养基上。滤膜600再次起阻隔杂菌的作用。为使菌液流动通畅，可通过旋松瓶盖底盖II 301实现。步骤九将上述装置再次倒置，即培养瓶I 100在上、培养瓶II 300在下，通过抽滤口 II 302进行负压抽滤，使菌液流入培养瓶II 300。为使菌液流动通畅，可通过旋松瓶盖I 101实现。步骤十将上述装置置于培养箱内， 并在适合肺炎支原体的温度下培养24 48小时。步骤十一通过肉眼和\或仪器观察上述装置内培养支架800上培养盘801中菌落形态。
权利要求
1.一种肺炎支原体的培养与检测方法，其包括如下步骤 步骤一将临床痰样本接种到备有消化培养液的培养瓶I (100)中； 步骤二 培养瓶I (100)上依次装配设置有密封圈I (401)、密封圈II (402)、垫片(500),滤膜(600)、滤膜固定装置(700)的瓶盖(200)和培养瓶II (300),盖好底盖II (301); 步骤三将上述装置以培养瓶I (100)在下、培养瓶II (300)在上的状态置于摇床上，在37度恒温条件下培养12 24小时； 步骤四将上述装置倒置，即培养瓶I (100)在上、培养瓶II (300)在下，通过培养瓶II(300)的抽滤口 II (302)进行负压抽滤，使菌液由培养瓶I (100)流向培养瓶II (300)；步骤五通过培养瓶I (100)的底盖I (101)向培养瓶II (300)内加入富集培养液，在37度恒温条件下培养12 24小时； 步骤六通过肉眼和\或仪器观察培养瓶II (300)中培养液的浑浊程度、颜色变化、有无荧光现象，或加入试剂进行进一步的观察。
2.根据权利要求1所述的一种肺炎支原体的培养与检测方法，其特征在于在步骤六中，所述培养瓶II (300)中的培养液鉴定为肺炎支原体呈阳性，继续进行如下操作 步骤七更换新的培养瓶I (100)、瓶盖(200)及瓶盖(200)内的配件，再将备有固体培养基的培养支架(800)置入培养瓶I (100)内，培养盘(801)的正面朝向培养瓶I (100)的瓶壁外侧，盖好底盖I (101); 步骤八将上述组装好的装置倒置，即培养瓶I (100)在下、培养瓶II (300)在上，通过抽滤口 I (102)进行负压抽滤，使菌液流入培养瓶I (100)，菌液浸没培养支架(800)，并接种到培养盘(801)内的固体培养基上； 步骤九将上述装置再次倒置，即培养瓶I (100)在上、培养瓶II (300)在下，通过抽滤口 II (302)进行负压抽滤，使菌液流入培养瓶II (300)； 步骤十将上述装置置于培养箱内，并在适合肺炎支原体的温度下培养24 48小时；步骤i^一 通过肉眼和\或仪器观察上述装置内培养支架(800)上培养盘(801)中菌落形态。
3.根据权利要求2所述的一种肺炎支原体的培养与检测方法，其特征在于在步骤四和步骤九中，进行负压抽滤时，将所述瓶盖I (101)旋松。
4.根据权利要求2所述的一种肺炎支原体的培养与检测方法，其特征在于在步骤八中，进行负压抽滤时，将所述瓶盖II (301)旋松。
全文摘要
本发明涉及一种肺炎支原体的培养与检测方法，属于微生物培养技术领域。本发明的装置包括培养瓶Ⅰ(100)、盖中央带有通孔(201)的瓶盖(200)和培养瓶Ⅱ(300),培养瓶Ⅰ(100)和培养瓶Ⅱ(300)连接在瓶盖(200)的两端，瓶盖(200)内还设置垫片(500)、滤膜(600)、滤膜固定装置(700)。本发明将痰样本经培养瓶Ⅰ(100)内的消化培养液消化、复苏并实现初步增殖，再通过培养瓶Ⅱ(300)的选择增菌培养液进行增殖、富集,实现肺炎支原体的初步鉴定，最后接种到培养瓶Ⅰ(100)的固体培养基上进行再增殖，从而完成肺炎支原体的培养和鉴别。本发明的装置针对肺炎支原体设计，培养肺炎支原体快捷方便，结果准确率高，能满足临床痰样本培养与检测的需要。
文档编号C12Q1/04GK103045518SQ20121058795
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者赵万千, 王海晶, 杨扬, 杨焱焱 申请人:江苏嘉语生物医药技术有限公司