Pcv2猪肺炎支原体致免疫组合物及其制备方法

专利名称：Pcv2猪肺炎支原体致免疫组合物及其制备方法
技术领域：
在本发明一个方面，提供了有效诱导抗猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,M. hyo)感染的免疫应答的致免疫组合物。更具体地，本发明涉及有效诱导、 激发、或提供免疫应答的致免疫组合物，所述应答保护接受该组合物的动物，减少猪肺炎支 原体感染的发生率、或减轻其严重性。还更具体地，本发明涉及致免疫组合物，其中包括基 于细胞的抗原，优选菌苗(bacterin)，其赋予抗猪肺炎支原体感染的保护性免疫应答。甚至 更具体地，本发明涉及含猪肺炎支原体菌苗的致免疫组合物，给予所述菌苗导致抗猪肺炎 支原体的保护性免疫应答。最具体地，本发明涉及致免疫组合物，其有效赋予接受该致免疫 组合物的猪以保护性免疫应答，其中所述组合物的剂量包括相对效力(relative potency, RP)为至少1.22的猪肺炎支原体菌苗。此外，本发明还提供了制备和施用所述致免疫组合 物的方法。在本发明另一方面中，提供了有效诱导抗2型猪圆环病毒(porcine circovirus 2，PCV2)感染的免疫应答的致免疫组合物。更具体地，本发明涉及有效提供免疫应答的致 免疫组合物，所述应答保护接受该组合物的动物，减少与PCV2感染有关的临床症状的发生 率、或减轻其严重性。还更具体地，本发明涉及基于蛋白的致免疫组合物，其赋予抗PCV2 感染的保护性免疫应答。甚至更具体地，本发明涉及含PCV2 0RF2的致免疫组合物，给予 PCV2-0RF2导致抗PCV2感染的保护性免疫应答。最具体地，本发明涉及致免疫组合物，其有 效赋予接受该致免疫组合物的猪以保护性免疫应答，其中所述组合物包含由PCV2 0RF2表 达的蛋白，且具有至少1. 38的RP。此外，本发明还提供了制备和施用所述致免疫组合物的 方法。在本发明另一方面中，提供了组合致免疫组合物，组合疫苗，或多价的致免疫组合 物或疫苗。更具体地，本发明提供了有效诱导免疫应答的致免疫组合物，所述应答抗猪肺炎 支原体和至少一种引起猪其它疾病的生物的感染。还更具体地，本发明提供了有效诱导抗 猪肺炎支原体感染的免疫应答、并有效诱导抗PCV2感染的免疫应答的致免疫组合物。优选 地，所述抗猪肺炎支原体和PCV2的免疫应答足以减少、包括防止与每一种病原体有关的临 床表现或症状的严重性或发生率。在所述致免疫组合物的优选形式中，其猪肺炎支原体部 分具有至少1. 22的RP值，其PCV2部分具有至少1. 38的RP值。本发明还提供了制备和施 用所述组合物的方法。现有技术的描述猪肺炎支原体是归类为支原体科的小细菌(400-1200nm)。猪肺炎支原体与地 方性动物肺炎有关，这种病是常见于生长和肥育猪(growing and finishing pigs)的猪呼吸道疾病。猪肺炎支原体攻击气管和肺上皮细胞的纤毛，使纤毛停止敲打(纤毛停滞 (ciliostasis))，并最终引起肺部一些区域萎陷。根据疾病的程度，染病猪的每日增重最多 可减少17%。地方性动物肺炎是猪群中广泛传播的疾病，在几乎每个猪群中都有。猪肺炎 支原体被认为是有利于PRRSV和其它呼吸道病原体进入肺部的主要病原体。三种毒株232， J,& 7448 的基因组已测序(Minion et al. ,J. Bacteriol. 186 7123-33, 2004 ；Vasconcelos et al.，J. Bacteriol. 187 =5568-77,2005)。猪肺炎支原体感染的临床表现包括干咳、性能 减弱，以及肺损伤。2型猪圆环病毒(PCV2)是小的(直径17-22nm)、二十面体、无包膜DNA病毒， 含单链环状基因组。PCV2与1型猪圆环病毒(PCVl)共有近80%的序列同一性。但是， 与PCVl通常无毒力不同，被PCV2感染的猪出现综合征，被称为断奶后多系统消耗综合 征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)。PMWS 的临床特征有，消 瘦(wasting)，皮肤苍白(paleness of the skin)，赢弱(unthriftiness)，呼吸困难 (respiratory distress), MMi (diarrhea), ^(icterus and iaundice)。 一些病猪@ 现出所有症状，而另一些病猪只有其中的一或两种症状。尸检期间，也可以在多个组织和器 官上出现显微镜检可见的和肉眼可见的损伤，其中淋巴器官是最常见的损伤部位。PCV2核 酸或抗原量与显微镜检发现的淋巴损伤严重性之间有强相关性。被PCV2感染的猪病死率 接近80%。除了 PMWS，PCV2还与数种其它感染有关，包括伪狂犬病(pseudorabies)，猪生 殖呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),Glasser病，链 球菌脑膜炎(streptococcal meningitis)，沙门氏杆菌病(salmonellosis)，断奶后大肠杆 菌病(postweaning colibacillosis)，饮食性肝功能病(dietetic hepatosis), URit^ 性支气管月市炎(suppurative bronchopneumonia)。PCV2的第2开放阅读框(0RF2)蛋白在SDS-PAGE凝胶上电泳时具有近30kDa的分 子量，其过去被用于作为PCV2疫苗的抗原性成分。获得0RF2以用于此类疫苗的典型方法 通常是扩增编码0RF2的PCV2 DNA,用0RF2DNA转染病毒载体，用含0RF2 DNA的病毒载体 感染细胞，允许病毒在细胞内表达0RF2蛋白，将细胞裂解，从细胞中提取0RF2蛋白。这些 方法通常在用病毒载体感染细胞后还需要约4天时间。但这些方法的缺点是，提取过程既 费钱又费时。而且，从细胞中回收到的0RF2的量不很多；因此，需要用较大量的病毒载体感 染较大量的细胞，以便获得足够量的重组表达的蛋白来用于疫苗等方面。 因此，本领域需要赋予保护性免疫应答的致免疫组合物，所述应答抵抗PCV2感染 和猪肺炎支原体感染，减少所述感染的发生率，和/或减轻所述感染的严重性，或防止与所 述感染有关的临床表现。具体地，本领域需要包含猪肺炎支原体抗原和PCV-2抗原的组合 疫苗，其中所述抗原的量足以在单次给予所述疫苗后赋予保护性免疫应答，所述应答抵抗 PCV2感染和猪肺炎支原体感染，减少所述感染的发生率，和/或减轻所述感染的严重性，或 防止与所述感染有关的临床表现。所述疫苗将改进猪疫苗的顺应性(compliance)。发明概述本发明克服了现有技术固有的困难，为本领域提供了显著的进步。在本发明一个 方面，提供了在猪体内激发抗猪肺炎支原体的保护性免疫应答的致免疫组合物。优选地，所 述致免疫组合物包含2型猪圆环病毒的抗原和猪肺炎支原体的抗原。还更优选地，每一剂 中猪肺炎支原体抗原的量具有至少1. 22的相对效力(RP)值，其中，相对效力值1. 22是指，小鼠被给予了四十分之一(1/40)的所述量的猪肺炎支原体抗原后，至少95%的小鼠，优选 100%的小鼠，在处理后的21天内或第21天之时，在猪肺炎支原体特异性抗体检测试验中 测得，产生了可检测的量的抗体。因此，至少95%、优选100%的小鼠在处理后的21天内或 第21天之时诱导出可检测的猪肺炎支原体特异性抗体应答所需的猪肺炎支原体抗原量的 40倍，足以在与2型猪圆环病毒的抗原一起给药后，赋予保护性免疫应答，以抵抗猪肺炎支 原体感染，减少所述感染的发生率，和/或减轻所述感染的严重性，或防止与所述感染有关 的临床表现。换而言之，如上所述的猪肺炎支原体抗原的量，当混合为组合疫苗并被给药 时，已被显示能克服任何与PCV2抗原之间的负面干扰。因此，本发明还涉及包含2型猪圆环 病毒抗原和猪肺炎支原体抗原的致免疫组合物，其中，每一剂中猪肺炎支原体抗原的量具 有至少1. 22的相对效力(RP)值，所述RP值1. 22对应于在至少95%、优选100%的小鼠体 内、在处理后的21天内或第21天之时诱导出可检测的猪肺炎支原体特异性抗体应答所需 的猪肺炎支原体抗原量的40倍。在一些优选形式中，所述组合物还包括或包含佐剂。各种 佐剂都可用于本发明，可由本领域技术人员来进行选择，但尤其优选卡波姆(carbomer)，更 优选卡波普(Carbopol)。有利地，本发明的致免疫组合物当作为单剂(single dose)对猪 给药时，赋予保护性免疫应答，所述应答抵抗猪肺炎支原体感染，减少所述感染的发生率， 和/或减轻所述感染的严重性，或防止与所述感染有关的临床表现。所述单剂对猪给药后 激发了持续至少100，更优选至少110，更优选至少120，还更优选至少130，更优选至少140， 还更优选至少150，更优选至少160，还更优选至少170，更优选至少180，最优选至少184 天的免疫力。换而言之，一剂本发明的致免疫组合物，无需加强免疫或后续用药，就在至少 100 (110，120，130，140，150，160，170，180，等)、最优选至少184天内，使单个动物或一组动 物的猪肺炎支原体感染临床表现的发生率或严重性减少。至于抗体检测试验，本领域技术 人员能找到并利用相应产品。优选ELISA试验，尤其IDEXX Herdchek猪肺炎支原体测试试 剂盒(IDEXX Laboratories, Inc.，ffestbrook, ME)。具体地，IDEXX Herdchek 猪肺炎支原 体测试试剂盒(IDEXX Laboratories, Inc. , ffestbrook, ME)可用作本发的参考试验。
在本发明另一方面中，提供了在猪体内激发抗PCV2的保护性免疫应答的致免疫 组合物。优选地，所述致免疫组合物包含2型猪圆环病毒的抗原和猪肺炎支原体的抗原。 还更优选地，每一剂中PCV2抗原的量具有至少1.38的相对效力(RP)值，其中，相对效力值 1.38是指，小鼠被给予了二十分之一(1/20)的所述量的PCV2抗原后，至少85%的小鼠，在 处理后的21天内或第21天之时，在PCV2特异性抗体检测试验中测得，产生了可检测的量 的抗体。优选地，相对效力值1.38是指，小鼠被给予了十分之一(1/10)的所述量的PCV2 抗原后，至少95 %的小鼠，优选100 %的小鼠，在处理后的21天内或第21天之时，在PCV2 特异性抗体检测试验中测得，产生了可检测的量的抗体。因此，至少85 %的小鼠在处理后的 21天内或第21天之时诱导出可检测的PCV2特异性抗体应答所需的PCV2抗原量的20倍， 或优选地，至少95%、优选100%的小鼠在处理后的21天内或第21天之时诱导出可检测的 PCV2特异性抗体应答所需的PCV2抗原量的10倍，足以在与猪肺炎支原体抗原一起给药后， 赋予保护性免疫应答，以抵抗PCV2感染，减少所述感染的发生率，和/或减轻所述感染的严 重性，或防止与所述感染有关的临床表现。换而言之，如上所述的PCV2抗原的量，当混合为 组合疫苗并被给药时，已被显示能克服任何与猪肺炎支原体抗原之间的负面干扰。因此，本 发明还涉及包含2型猪圆环病毒抗原和猪肺炎支原体抗原的致免疫组合物，其中，每一剂
6中PCV2抗原的量具有至少1. 38的相对效力(RP)值，所述RP值1. 38对应于在至少85%的 小鼠体内、在处理后的21天内或第21天之时诱导出可检测的PCV2特异性抗体应答所需的 PCV2抗原量的20倍。根据另一方面，本发明还涉及包含2型猪圆环病毒抗原和猪肺炎支原 体抗原的致免疫组合物，其中，每一剂中PCV2抗原的量具有至少1. 38的相对效力(RP)值， 所述RP值1. 38对应于在至少95%、优选100%的小鼠体内、在处理后的21天内或第21天 之时诱导出可检测的PCV2特异性抗体应答所需的PCV2抗原量的10倍。在该实施方案的一些优选形式中，所述组合物还包括或包含佐剂。各种佐剂都可 用于本发明，可由本领域技术人员来进行选择，但尤其优选卡波姆，更优选卡波普。有利地， 本发明的致免疫组合物当作为单剂对猪给药时，赋予保护性免疫应答，所述应答抵抗PCV2 感染，减少所述感染的发生率，和/或减轻所述感染的严重性，或防止与所述感染有关的临 床表现。所述单剂对猪给药后激发了持续至少100，更优选至少110，更优选至少120，还 更优选至少130，更优选至少140，还更优选至少150，更优选至少160，还更优选至少170， 更优选至少180，最优选至少184天的免疫力。换而言之，一剂本发明的致免疫组合物，无 需加强免疫或后续用药，就在至少100(110，120，130，140，150，160，170，180，等)、最优选 至少184天内，使单个动物或一组动物的PCV2感染临床表现的发生率或严重性减少。至 于抗体检测试验，本领域技术人员能找到并利用相应产品。优选ELISA试验，尤其优选 Nawagitgul, P.等人(其教导和内容都引入本文做参考)在Modified indirect porcine circovirus(PCV) type 2-based and recombinant capsid protein(0RF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9 :33_40 (2002)中 所述方法。在本发明另一方面，提供了含有有效量的猪肺炎支原体抗原和有效量的PCV2抗 原的致免疫组合物。优选地，猪肺炎支原体抗原和PCV2抗原分别如上述具有至少1. 22和 1. 38的RP值，其中对于猪肺炎支原体而言RP值为1. 22、以及对于PCV2而言RP值为1. 38 是指，接受四十分之一的猪肺炎支原体所述量和十分之一的PCV2抗原所述量的小鼠，在处 理后的21天内或第21天时，有95%、优选100%在猪肺炎支原体和PCV2特异性抗体检测 试验中测得产生了可检测的量的抗体。因此，至少95%、优选100%的小鼠在处理后的21 天内或第21天之时诱导出可检测的猪肺炎支原体特异性抗体应答所需的猪肺炎支原体抗 原量的40倍，以及至少95%、优选100%的小鼠在处理后的21天内或第21天之时诱导出 可检测的PCV2特异性抗体应答所需的PCV2抗原量的10倍，已显示足以在与猪肺炎支原体 抗原一起给药后，赋予保护性免疫应答，以抵抗PCV2感染和/或猪肺炎支原体感染，减少所 述感染的发生率，和/或减轻所述感染的严重性，或防止与所述感染有关的临床表现。换而 言之，上述PCV2抗原量和猪肺炎支原体抗原量，当混合为组合疫苗并被给药时，已显示能 克服两种抗原之间的任何负面干扰。因此，本发明还涉及包含2型猪圆环病毒抗原和猪肺 炎支原体抗原的致免疫组合物，其中，每一剂中猪肺炎支原体抗原和PCV2抗原的量分别具 有至少1. 22和1. 38的相对效力值，其中，对于猪肺炎支原体而言RP值为1. 22对应于在至 少95%、优选100%的小鼠体内、在处理后的21天内或第21天之时诱导出可检测的猪肺炎 支原体特异性抗体应答所需的猪肺炎支原体抗原量的40倍，且其中，对于PCV2而言RP值 为1. 38对应于在至少85%的小鼠体内、在处理后的21天内或第21天之时诱导出可检测 的PCV2特异性抗体应答所需的PCV2抗原量的20倍。优选地，对于PCV2而言RP值为1. 38对应于在至少95%、优选100%的小鼠体内、在处理后的21天内或第21天之时诱导出可检 测的PCV2特异性抗体应答所需的PCV2抗原量的10倍。在该实施方案的一些优选形式中， 所述组合物还包括或包含佐剂。各种佐剂都可用于本发明，可由本领域技术人员来进行选 择，但尤其优选卡波姆，更优选卡波普。有利地，本发明的致免疫组合物当作为单剂对猪给 药时，激发保护性免疫应答。所述单剂对猪给药后激发了持续至少100，更优选至少110，更 优选至少120，还更优选至少130，更优选至少140，还更优选至少150，更优选至少160，还 更优选至少170，更优选至少180，最优选至少184天的免疫力。换而言之，一剂本发明的 致免疫组合物，无需加强免疫或后续用药，就在至少100 (110，120，130，140，150，160，170， 180，等)、最优选至少184天内，使单个动物或一组动物的猪肺炎支原体感染和PCV2感染 临床表现的发生率或严重性减少。至于抗体检测试验，本领域技术人员能找到并利用相应 的方法和产品。优选ELISA试验，对于PCV2抗体检测试验尤其优选Nawagitgul，P.等人 (其教导和内容都引入本文做参考)在Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (0RF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9 :33_40 (2002)中所述方法，对于猪肺炎支 原体抗体检测试验尤其优选IDEXX Herdchek猪肺炎支原体测试试剂盒。在本发明另一方面中，提供了在猪体内激发抗猪肺炎支原体的保护性免疫应答的 方法。总体上，所述方法包括对有需要的动物，优选猪，给予本发明的致免疫组合物的步骤。 优选地，所述致免疫组合物包含2型猪圆环病毒的抗原和猪肺炎支原体抗原。还更优选地， 每一剂中猪肺炎支原体抗原的量具有至少1. 22的相对效力(RP)值，其中，对于猪肺炎支原 体而言RP值1. 22是指，小鼠被给予了四十分之一的所述量的猪肺炎支原体抗原后，至少 95%、优选100%的小鼠，在处理后的21天内或第21天之时，在猪肺炎支原体特异性抗体 检测试验中测得，产生了可检测的量的抗体。因此，本发明还涉及在猪体内激发抗猪肺炎支 原体的保护性免疫应答的方法，包括对所述猪给予含2型猪圆环病毒的抗原和猪肺炎支原 体抗原的致免疫组合物，其中，每一剂中猪肺炎支原体抗原的量具有至少1. 22的相对效力 值，其中，所述RP值1. 22对应于在至少95%、优选100%的小鼠体内，在处理后的21天内 或第21天之时，诱导出可检测的量的猪肺炎支原体特异性抗体应答所需的量的40倍。在 一些优选形式中，所述组合物还包括或包含佐剂。各种佐剂都可用于本发明，可由本领域 技术人员来进行选择，但尤其优选卡波姆，更优选卡波普。有利地，本发明的致免疫组合物 当作为单剂对猪给药时，激发保护性免疫应答。所述单剂对猪给药后激发了持续至少100， 更优选至少110，更优选至少120，还更优选至少130，更优选至少140，还更优选至少150， 更优选至少160，还更优选至少170，更优选至少180，最优选至少184天的免疫力。换而言 之，一剂本发明的致免疫组合物，无需加强免疫或后续用药，就在至少100 (110，120，130， 140，150，160，170，180，等)、最优选至少184天内，使单个动物或一组动物的猪肺炎支原体 感染临床表现的发生率或严重性减少。至于抗体检测试验，本领域技术人员能找到并利用 相应产品。优选ELISA试验，尤其优选IDEXX Herdchek猪肺炎支原体测试试剂盒(IDEXX Laboratories, Inc.，ffestbrook, ME)。在本发明另一方面中，提供了在猪体内激发抗PCV2的保护性免疫应答的方法。总 体上，所述方法包括对有需要的动物，优选猪，给予本发明的致免疫组合物的步骤。优选地， 所述致免疫组合物包含2型猪圆环病毒的抗原和猪肺炎支原体抗原。还更优选地，每一剂中PCV2抗原的量具有至少1.38的相对效力(RP)值，其中，对于PCV2而言RP值1.38是指， 小鼠被给予了二十分之一的所述量的PCV2抗原后，至少85%的小鼠，在处理后的21天内 或第21天之时，在PCV2特异性抗体检测试验中测得，产生了可检测的量的抗体。优选地， 对于PCV2而言RP值为1. 38是指，小鼠接受十分之一的所述量的PCV2抗原后，至少95%、 优选100%的小鼠在处理后的21天内或第21天之时产生可检测的量的抗体。因此，本发 明还涉及在猪体内激发抗PCV2的保护性免疫应答的方法，包括对所述猪给予含PCV2抗原 和猪肺炎支原体抗原的致免疫组合物，其中，每一剂中PCV2抗原的量具有至少1. 38的相对 效力值，其中，所述RP值1. 38对应于在至少85%的小鼠体内，在处理后的21天内或第21 天之时，诱导出可检测的量的PCV2特异性抗体应答所需的量的20倍。优选地，所述RP值 为1. 38对应于在至少95%、优选100%的小鼠体内、在处理后的21天内或第21天之时诱 导出可检测的PCV2特异性抗体应答所需的PCV2抗原量的10倍。在该实施方案的一些优 选形式中，所述组合物还包括或包含佐剂。各种佐剂都可用于本发明，可由本领域技术人员 来进行选择，但尤其优选卡波姆，更优选卡波普。有利地，本发明的致免疫组合物当作为单 剂对猪给药时，激发保护性免疫应答。所述单剂对猪给药后激发了持续至少100，更优选至 少110，更优选至少120，还更优选至少130，更优选至少140，还更优选至少150，更优选至 少160，还更优选至少170，更优选至少180，最优选至少184天的免疫力。换而言之，一剂 本发明的致免疫组合物，无需加强免疫或后续用药，就在至少100 (110，120，130，140，150， 160，170，180，等)、最优选至少184天内，使单个动物或一组动物的PCV2感染临床表现的 发生率或严重性减少。至于抗体检测试验，本领域技术人员能找到并利用相应的方法和产 品。优选ELISA试验，尤其优选Nawagitgul，P.等人(其教导和内容都引入本文做参考) 在Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein(0RF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9 :33_40(2002)中所述方法。 在本发明另一方面，提供了在猪体内激发抗猪肺炎支原体感染和PCV2感染的保 护性免疫应答的方法。在优选形式中，该方面包括含有效量的猪肺炎支原体抗原和有效量 的PCV2抗原的致免疫组合物。优选地，猪肺炎支原体抗原和PCV2抗原分别如上述具有至 少1. 22和1. 38的RP值，其中对于猪肺炎支原体而言RP值为1. 22、以及对于PCV2而言RP 值为1. 38是指，接受四十分之一的猪肺炎支原体所述量和十分之一的PCV2抗原所述量的 小鼠，在处理后的21天内或第21天时，有95%、优选100%在猪肺炎支原体和PCV2特异性 抗体检测试验中测得产生了可检测的量的抗体。因此，本发明还涉及在猪体内激发抗猪肺 炎支原体和PCV2的保护性免疫应答的方法，包括对所述猪给予含PCV2抗原和猪肺炎支原 体抗原的致免疫组合物，其中，每一剂中猪肺炎支原体抗原和PCV2抗原的量分别具有至少 1. 22和1. 38的相对效力值，其中，对于猪肺炎支原体而言RP值为1. 22对应于在至少95%、 优选100%的小鼠体内、在处理后的21天内或第21天之时诱导出可检测的猪肺炎支原体 特异性抗体应答所需的猪肺炎支原体抗原量的40倍，且其中，对于PCV2而言RP值为1. 38 对应于在至少85%的小鼠体内、在处理后的21天内或第21天之时诱导出可检测的PCV2特 异性抗体应答所需的PCV2抗原量的20倍。优选地，对于PCV2而言RP值为1. 38对应于在 至少95%、优选100%的小鼠体内、在处理后的21天内或第21天之时诱导出可检测的PCV2 特异性抗体应答所需的PCV2抗原量的10倍。在该实施方案的一些优选形式中，所述组合物还包括或包含佐剂。各种佐剂都可用于本发明，可由本领域技术人员来进行选择，但尤其 优选卡波姆，更优选卡波普。有利地，本发明的致免疫组合物当作为单剂对猪给药时，激发 保护性免疫应答。所述单剂对猪给药后激发了持续至少100，更优选至少110，更优选至少 120，还更优选至少130，更优选至少140，还更优选至少150，更优选至少160，还更优选至少 170，更优选至少180，最优选至少184天的免疫力。换而言之，一剂本发明的致免疫组合物， 无需加强免疫或后续用药，就在至少100 (110，120，130，140，150，160，170，180，等)天、最 优选至少184天内，使单个动物或一组动物的猪肺炎支原体感染和PCV2感染临床表现的发 生率或严重性减少。至于抗体检测试验，本领域技术人员能找到并利用相应的方法和产品。 优选ELISA试验，对于PCV2抗体检测试验尤其优选Nawagitgul，P.等人(其教导和内容 都弓 I入本文做参考)在 Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein(0RF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9 =33-40(2002)中所述方法，对于猪肺炎支原体抗体检测试 验尤其优选IDEXX Herdchek猪肺炎支原体测试试剂盒。本文中，“保护性免疫应答”是指，猪肺炎支原体感染或PCV2感染的临床、病理学、 或组织病理学症状的发生率减小或严重性减轻，包括彻底阻止这类症状。在本发明另一方面中，提供了制备用于激发抗PCV2和猪肺炎支原体的免疫应答 的组合物的方法，所述组合物优选抗原性组合物或致免疫组合物，例如疫苗。总体上，所述 方法包括将构建体转染到病毒中的步骤，其中所述构建体包含i)来自PCV2 0RF2的重组 DNA, ii)用经转染的病毒感染生长培养基中的细胞，iii)使病毒从PCV2 0RF2表达重组 蛋白，iv)从上清中回收所表达的0RF2蛋白，以及，ν)将回收的蛋白与合适的佐剂和/或 其它可药用载体组合，与猪肺炎支原体菌苗和合适的佐剂一起，制备组合物。由于所述致 免疫组合物中各种成分的长期稳定性，该组合物可以在混合后长达3年内对动物给药。本 文所述组合物的优选形式具有猪肺炎支原体成分，该成分的RP值大于约1. 22，更优选约 1. 22-4. 5，更优选约1. 22-3. 5，最优选约1. 22-2. 8。猪肺炎支原体的RP值大于约1. 22是 指，用RP值1.22之猪肺炎支原体抗原量的四十分之一量处理后，95%、更优选100%的小鼠 在21天内或第21天时，用猪肺炎支原体-特异性抗体检测试验测得，产生了可检测的量的 抗猪肺炎支原体抗体。“佐剂”在本文中可包括氢氧化铝和磷酸铝，皂苷(saponin)如Quil A， QS-21(Cambridge Biotech Inc. , Cambridge ΜΑ), GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals, Inc.，Birmingham, AL)，油包水乳剂，水包油乳剂，水包油包水乳剂。乳剂可尤其基于轻液 体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线 性烷基的酯，更尤其植物油，油酸乙酯，丙二醇二 _ (辛酸酯/葵酸酯)，甘油三_ (辛酸酯/ 葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用 以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(marmide) 的酯(例如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的 酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选 乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见 Hunter 等，The Theory and Practical Application of Adjuvants(Ed. Stewart-Tul1,D. E. S. ). John Wiley and Sons, NY, pp51_94(1995)and Todd et al. , Vaccine 15: 564-570(1997)。例如，可使用〃 Vaccine Design, The Subunit and Adiuvant Approach ", M-Powell和M. Newman编，Plenum Press, 1995的第147页描述的SPT乳剂，以及该书第183 页所述的MF59乳剂。另一例佐剂是从丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及顺丁烯二酸酐和链烯基 (alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。有利的佐剂化合物是交联的丙烯酸或甲基丙烯 酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联。这些化合物已知被称为卡波姆 (Phameuropa Vol. 8，No. 2，June 1996)。本领域技术人员还可参见美国专利2，909，462， 它描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟 基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基 (aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2_4个碳原子的基团，例如乙烯基，烯 丙基，和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自 身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售；(BF Goodrich, Ohio, USA) 特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交联。这其 中，可提及卡波普974P，934P和971P。最优选使用卡波普971P。在顺丁烯二酸酐和链烯基 衍生物的众多共聚物中，顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)也可以考虑。这些 聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其 中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。其它合适的佐剂包括，但不限于，RIBI佐 MMMi (Ribi Inc.), Block co-polymer (CytRx, Atlanta GA), SAF-M(Chiron, Emeryville CA)，单磷酰脂质AOiionophosphoryl lipid Α)，Avridine脂质-胺佐剂，大肠杆菌不耐热肠 毒素(重组或其它)，霍乱毒素，IMS 1314或胞壁酰二肽，等等。优选地，佐剂添加量为约100 μ g-约IOmg/剂。还更优选地，佐剂添加量为约 100 μ g"约IOmg/剂。还更优选地，佐剂添加量为约500 μ g-约5mg/剂。还更优选地，佐剂 添加量为约750 μ g-约2. 5mg/剂。最优选地，佐剂添加量为约Img/剂。因此，根据另一方面，制备用于激发抗PCV2和猪肺炎支原体的免疫应答的抗原组 合物例如疫苗的方法包括i)将PCV2 0RF2蛋白与猪肺炎支原体菌苗以及合适的佐剂混 合。优选地，佐剂是卡波姆，更优选是卡波普971P。还更优选地，卡波普971P的添加量是约 500 μ g-约5mg/剂，更优选约750 μ g-约2. 5mg/剂，最优选约Img/剂。此外，疫苗组合物可包括一或多种可药用载体。本文中，“可药用载体"包括任 何和所有溶剂，分散介质，包衣，稳定剂，稀释剂，保存剂，抗细菌和抗真菌剂，等渗剂，吸收 延迟剂，等等。所述致免疫组合物还可包含一或多种免疫调节剂，如白细胞介素，干扰素，或其它 细胞因子。所述致免疫组合物还可包含庆大霉素和硫柳汞。虽然用于本发明的佐剂和添 加剂的量和浓度可以由专业人员很容易地确定，但本发明涉及组合物，其含有约50μ g_约 2000μ g佐剂，优选约250μ g/ml剂疫苗组合物。在另一优选实施方案中，本发明涉及疫苗 组合物，其包含约lug/ml-约60 μ g/ml抗生素，更优选少于约30 μ g/ml抗生素。“PCV2抗原”是指含有至少一种抗原的任何组合物，所述抗原当对猪给药时，可诱 导、刺激或增强抵抗PCV2感染的免疫应答。优选地，所述PCV2抗原是完整的PCV2病毒，优选为灭活形式，改良的PCV2活病毒或减毒的PCV2病毒，含有至少PCV2的免疫原性氨基酸 序列的嵌合病毒，任何其它含至少PCV2的免疫原性氨基酸序列的多肽或成分。术语"免疫 原性蛋白”、“免疫原性多肽”或“免疫原性氨基酸序列”在本文中是指，在宿主体内激发对 含有所述免疫原性蛋白、免疫原性多肽、或免疫原性氨基酸序列的病原体的免疫应答的任 何氨基酸序列。“免疫原性蛋白”、“免疫原性多肽”或“免疫原性氨基酸序列”在本文中包括 任何蛋白的全长序列，其类似物，或其免疫原性片段。“免疫原性片段"是指蛋白的片段， 其包括一或多种表位，并因此激发抗相应病原体的免疫应答。这类片段可用任意多种表位 作图技术来鉴定，所述技术是本领域众所周知的。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed. ,1996)HumanaPress, Totowa, New Jersey。例如，可如下鉴定线性表位在固相支持物上同时合成大量肽，这些 肽对应于蛋白分子的各个部分，使仍附着在支持物上的这些肽与抗体反应。这样的技术是 本领域已知的，见例如美国专利 4，708，871 ;Geysen et al. (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 3998-4002 ；Geysen et al. (1986)Molec. Immunol. 23 :709_715。同样地，可以如下 很容易地鉴定构象表位通过例如X-线晶体成像和2-维核磁共振确定氨基酸的空间构象。 参见例如Epitope Mapping Protocols，出处同上。合成的抗原也可以包括在该定义中，例 如，多表位，侧翼表位，以及其它重组或合成衍生的抗原。参见例如Bergmarm et al. (1993) Eur.J. Immunol. 23 :2777_2781 ；Bergmann et al. (1996)，J. Immunol. 157 :3242_3249 ； Suhrbier, A. (1997)，Immunol, and Cell Biol. 75402-408 ；Gardner et al.，(1998) 12th World AIDSConference, Geneva,Switzerland,June 28-July 3,1998。最优选地，可用于本发明的疫苗组合物包含PCV2 0RF2蛋白，优选表达在体外培养 的细胞中，并从所述细胞中回收获得。PCV2 0RF2蛋白的优选例参见W02006-072065，其教 导和内容全部引入本文作参考。简言之，本文中用于制备组合物以及还用于本文所述方法中的PCV20RF2 DNA和 蛋白是PCV2分离株中的高度保守结构域，并因此，任何PCV20RF2都可用作本文所述PCV2 0RF2 DNA和/或多肽的来源。优选的PCV20RF2蛋白是SEQ ID N0. 11。优选的PCV 0RF2 多肽是SEQ ID N0. 5，但本领域技术人员能理解，该序列可以有多达6-10%的序列同源性的 变动、但仍保留使其可用于致免疫组合物中的抗原性。经修饰的抗原与多核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4编码的PCV2 ORF 2蛋白相比，能赋予至少70%、优选80%、更优 选90%的保护性免疫力，就认为该经修饰的抗原仍保留了抗原性。“致免疫组合物”在本文 中是指，在宿主中激发“免疫应答”的PCV2 0RF2蛋白，所述应答是针对PCV2 0RF2蛋白的 细胞介导免疫应答和/或抗体介导免疫应答。优选地，该致免疫组合物能针对PCV2感染和 与其有关的临床表现赋予保护性免疫力。在一些形式中，PCV2 0RF2蛋白的免疫原性部分 在组合物中用作抗原性成分。术语“免疫原性部分”在本文中分别是指，PCV2 0RF2蛋白和 /或多核苷酸的截短的和/或替代的形式，或片段。优选地，所述截短形式和/或替代形式， 或片段包含全长0RF2多肽的至少6个连续氨基酸。更优选地，所述截短形式和/或替代形 式，或片段具有全长0RF2多肽的至少10个，更优选至少15个，还更优选至少19个连续氨 基酸。这方面优选的两种序列是本文的SEQ ID NOs. 9和10。还可理解，所述序列可以是更 大的片段或截短形式的一部分。本文另一优选的PCV2 0RF2多肽由SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4编码。但本领域技术人员能理解，，该序列可以有多达6-20%的序列同源性的变动、但仍保留使其可用于致免疫组合物中的抗原性。在一些形式中，0RF2的截短形式或替换形 式，或片段被用作组合物中的抗原性成分。优选地，所述截短形式和/或替代形式，或片段 包含全长0RF2核苷酸序列(例如SEQ ID NO :3或SEQ IDNO 4)的至少18个连续核苷酸。 更优选地，所述截短形式和/或替代形式，或片段具有全长0RF2核苷酸序列(例如SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4)的至少30个，更优选至少45个，更优选至少57个连续核苷酸。
“序列同一性”如本领域已知的那样，是指两个或更多个多肽序列或者两个或更 多个多核苷酸序列，即参考序列和需要与该参考序列比较的给定序列之间的关系。序列 同一性如下确定根据给定序列与参考序列的链之间的配对情况，以产生最高水平序列 相似性为目的，将给定序列与参考序列进行最佳比对，然后比较这两个序列。通过这种比 对，使一个位置比对一个位置，得到序列同一性，例如，在某一个位置的核苷酸或氨基酸残 基相同时，序列在该位置是“同一的”。再将该位置同一性的个数除以参考序列的核苷酸 或残基总数得到％序列同一性。序列同一性可以很容易地用已知方法计算，所述方法包 括但不限于，Computational Molecular Biology, Lesk, Α. N. , ed. , Oxford University Press, New York(1988), Biocomputing :Informatics andGenome Projects, Smith, D. W. , ed. , Academic Press, New York(1993) ；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. , and Griffin, H. G. , eds. , Humana Press, New Jersey(1994)； Sequence Analysis in MolecularBiology, von Heinge, G. , Academic Press (1987)； Sequence Analysis Primer,Gribskov,M. and Devereux,J. ,eds. ,M.Stockton Press, New York(1991) ；andCarillo, H.，and Lipman, D.，SIAM J. Applied Math. ,48 1073(1988), 其教导引入本文作参考。优选的确定序列同一性的方法被设计成使所测试的序列最为匹 配。确定序列同一性的方法可在确定给定序列之间序列同一性的公共计算机程序中编辑。 这类程序包括，但不限于，GCG 程序包(Devereux，J.，etal.，Nucleic Acids Research, 12(1) 387(1984)), BLASTP，BLASTN and FASTA(Altschul，S. F. et al.，J. Molec. Biol.， 215:403-410(1990)。BLASTX 程序可从 NCBI 和其它来源获得(BLAST Manual, Altschul, S. et al. ,NCVI NLM NIHBethesda, MD 20894，Altschul，S. F. et al. ,J. Molec. Biol. ,215 403-410(1990)，其教导引入本文做参考)。这些程序用缺省空隙权重实现对序列的最佳比 对，以便在给定序列和参考序列之间产生最高水平的序列同一性。例如，一个多核苷酸与 参考核苷酸序列具有至少例如85 %，优选90 %，更优选95 %的“序列同一性”是指，该给定 多核苷酸的核苷酸序列除了相对于参考核苷酸序列的每100个核苷酸而言可能包含多达 15个，优选多达10个，更优选多达5个点突变以外，与参考序列相同。换而言之，在具有与 参考核苷酸序列至少85%，优选90%，更优选95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸中，多 达15%，优选10%，更优选5%的核苷酸在参考序列中被缺失或被另一核苷酸取代，或者， 数量上占参考序列总核苷酸的多达15%，优选10%，更优选5%的核苷酸可被插入该参考 序列中。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置，或这些末端 位置之间的任何位置，可以是单个地散在参考序列的众多核苷酸之间，也可以是以一个或 多个连续序列的形式散在参考序列中。类似地，一个多肽与参考氨基酸序列具有至少例如 85%，优选90%，更优选95%的序列同一性是指，该多肽的给定氨基酸序列除了相对于参 考氨基酸序列的每100个氨基酸而言可能包含多达15个，优选多达10个，更优选多达5个 氨基酸改变以外，与参考序列相同。换而言之，为获得与参考氨基酸 列有至少85%，优选90%，更优选95%同一性的给定多肽序列，参考序列中多达15%，优选多达10%，更优选多 达5%的氨基酸残基被删除或被另一氨基酸取代，或者，数量上占参考序列氨基酸总数的多 达15 %，优选多达10 %，更优选多达5 %的氨基酸可被插入该参考序列中。参考序列的这些 改变可发生在参考氨基酸序列的氨基端位置或羧基端位置，或这些末端位置之间的任何位 置，可以是单个地散在参考序列的众多残基之间，也可以是以一个或多个连续序列的形式 散在参考序列中。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而有别。但是，在确定序列 同一性时，保守取代不算是匹配。“序列同源性”在本文中是指，确定两序列之间相关程度的方法。为确定序列同源 性，将两个或多个序列最佳比对，需要时引入空隙。但与“序列同一性”不同，在确定序列同 源性时，保守氨基酸取代都算做匹配。换而言之，为获得与参考氨基酸序列有95%序列同源 性的多肽或多核苷酸，参考序列中85 %，优选90 %，更优选95 %的氨基酸残基或核苷酸必 需匹配，或者包含被另一氨基酸或核苷酸保守取代的情况，或者，数量上占参考序列氨基酸 残基或核苷酸总数的多达15 %，优选多达10 %，更优选多达5 %的氨基酸或核苷酸(不包括 保守取代)可被插入该参考序列中。优选同源序列包含至少50个，更优选100个，更优选 250个，更优选500个核苷酸的序列。“保守取代”是指，将氨基酸残基或核苷酸用另外的具有相似特性(包括大小、疏水 性等)的氨基酸残基或核苷酸替换，使得总体功能不发生显著改变。“分离的，，是指“经人工手段，，从其天然状态分离，即如果它出现在自然界，则相对 于它原来的环境发生改变，或脱离原环境，或两者。例如，在活体生物中天然存在的多核苷 酸或多肽不是“分离的”，但相同的多核苷酸或多肽与其天然状态下共存的物质分开就是 “分离的，，，本文采用的就是这样的术语。优选地，所述PCV20RF2蛋白是i)含有 SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO 10 或 SEQ ID NO 11的多肽；ii)任何与多肽i)至少80%同源的多肽，iii)多肽i)和/或ii)的任何免疫原性部分，iv)iii)的免疫原性部分，包含序列 SEQ ID N0:5，SEQ ID NO 6, SEQID N0:9，SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11中的至少10个连续氨基酸，ν)由包含SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4的DNA编码的多肽。vi)由与多核苷酸ν)至少80%同源的多核苷酸编码的任何多肽，vii)多核苷酸ν)和/或vi)编码的多肽的任何免疫原性部分，viii) vii)的免疫原性部分，其中编码所述免疫原性部分的多核苷酸包含序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4中的至少30个连续氨基酸。优选任一种所述免疫原性部分具有由序列SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4编码的 PCV2 0RF2蛋白的免疫原性特征。如上所说，组合物中PCV2 0RF2部分的相对效力(RP)为至少1. 38，更优选为约 1. 38-4. 5，还更优选为约1. 38-3. 5，更优选为约1. 38_3，最优选为约1. 38-2. 75。与确定猪 肺炎支原体的RP值为至少1. 22相似，PCV2的RP值大于约1. 38是指，小鼠用RP值1. 38 的PCV2抗原量的二十分之一量处理，在处理后或给予PCV2抗原后的21天内或第21天时，用PCV2-特异性抗体检测试验测得，85%的小鼠产生可检测的量的抗PCV2抗体。优选地， PCV2的RP值大于约1. 38是指，小鼠用RP值1. 38的PCV2抗原量的十分之一量处理，在处 理后或给予PCV2抗原后的21天内或第21天时，用PCV2-特异性抗体检测试验测得，95%、 优选100%的小鼠产生可检测的量的抗PCV2抗体。本发明中致免疫组合物所用的PCV2 0RF2蛋白可以用任何方式来衍生，包括分离 和纯化PCV2 0RF2，标准的蛋白合成，以及重组方法学。优选的获得PCV2 0RF2多肽的方法 还可参见WO 2006-072065，其对应于美国专利申请系列号11/034，797，其教导和内容引入
本文作参考。根据另一实施方案，所述PCV2 抗原是 Ingelvac CircoFLEX，(Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, St Joseph, MO, USA) ,CircoVac (Merial SAS, Iyon, France), Circo Vent(Intervet Inc. , Millsboro, DE, USA), Suvaxyn PCV-2 One Dose (Fort Dodge Animal Health, Kansas City，KA，USA)，或上述任一种疫苗中包含的任一种 PCV2 抗原。最优选地，所述PCV2抗原是包括在Ingelvac CircoFLEX中的PCV2抗原，或者是 Ingelvac CircoFLEX。“猪肺炎支原体抗原”是指，包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪 肺炎支原体感染的免疫应答的抗原的任何组合物。优选地，所述猪肺炎支原体抗原是猪肺 炎支原体全细胞菌苗，优选灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪肺炎支原体细菌， 含有至少猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它含至少猪肺炎支原体 的免疫原性氨基酸序列的多肽或成分。优选猪肺炎支原体抗原是灭活的猪肺炎支原体菌 苗。更优选猪肺炎支原体抗原衍生自猪肺炎支原体J菌株。最优选猪肺炎支原体菌苗是包 ^Ingelvac MycoFlex ￡|Ε (Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, St Joseph, M0, USA)中的猪肺炎支原体灭活菌苗，或者就是Ingelvac MycoFlex。然而，可用于本发明的 猪肺炎支原体抗原还可选自包括在以下疫苗组合物中的任一种抗原=Porcilis猪肺炎支 原体，Myco Silencer BPM, Myco Silencer BPME，Myco Silencer ME, Myco Silencer Μ, Myco Silencer Once, Myco Silencer MEH(all of Intervet Inc. , Millsboro, DE, USA)Stellamune Mycoplasma(Pfizer Inc. , New York, NY, USA), SuvaxynMycoplasma, Suvaxyn M. hyo, Suvaxyn MH-One (都来自 Fort Dodge AnimalHealth, Overland Park, KS, USA (Wyeth)。注射时间表是弹性的。本文所述组合物可以在早至3周龄时，直至猪为了接种的 目的提前至少2周暴露于猪肺炎支原体时，投入使用。本发明的组合物可以以任何常规方 式来应用，所述方式包括皮内、气管内、或阴道内。组合物优选肌肉内或鼻内应用。在动物 机体中，将上述药物组合物经静脉注射或直接注射到靶组织中是有利的。全身应用时，优 选静脉、脉管内(intravascular)、肌肉内、鼻内、动脉内(intra-arterial)、腹腔、口服、 或鞘内(intrathecal)途径。更为局部的应用可以通过皮下、真皮内(intradermalIy)、
内(intracutaneously) > 内(intracardially) > Bf 内(intralobally) > H 内 (intramedullarly)、肺内(intrapulmonarily)，或者，直接进入或接近需要治疗的组织 (结缔组织、骨组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织)。根据治疗所希望达到的持续时间和 效果，本发明的组合物可以给药一次或数次，还可以间歇给药，例如以每天给药的频率给药 数日、数周或数月，以及给药不同剂次(dosages)。但是，如本文详述，猪肺炎支原体菌苗和PCV2 ORF 2的组合提供了一种致免疫组合物，其仅在一剂给药后，就在接受该组合物的猪 体内，针对猪肺炎支原体和/或PCV2感染，产生了有效免疫力和/或减弱了与感染有关的 临床表现的严重性或减少了所述症状的发生率。“下降”或“减少临床、病理学和/或组织学症状的发生率或减弱其严重性”应该是 指，接受疫苗的动物和未接受疫苗或致免疫组合物的“对照”动物，都感染了衍生出疫苗中 免疫活性成分的病原体或被所述病原体攻击后，在接受疫苗的动物中，所述任一种症状的 发生率或严重性减小。在此上下文中，术语“下降”或“减少”是指疫苗组与上述对照组相 比，减少至少10%，优选25%，更优选50%，最优选100%。“临床表现(Clinical signs) ”应指，能直接从活体动物观察到的病原体感染的 表现，如症状(symptoms)。代表性实例取决于所选的病原体，但可包括诸如流鼻涕(nasal discharge)，嗜睡(lethargy)，咳嗽，高热(elevated fever)，增重或减重，脱水，腹泻，肿胀 (swelling)，跛行(lameness)等等。PCV2临床表现可包括消瘦，皮肤苍白，赢弱，呼吸困难， 腹泻，和黄疸。猪肺炎支原体感染的临床表现包括，干咳，性能下降，以及肺损伤。“病理学”表现应指能在显微镜下观察到、或通过生化测试在分子水平观察到、或 用肉眼在尸检时观察到的感染的表现。PCV2的病理学表现包括多组织和器官的显微镜检损 伤和肉眼可见的损伤，以淋巴器官为最常见的损伤部位。“组织病理学”表现应指感染所致组织改变的表现。在本发明另一实施方案中，猪肺炎支原体抗原，优选猪肺炎支原体菌苗，与来自另 一种引起猪疾病的生物的抗原组合。在这样的情况下，猪肺炎支原体成分的RP值如上述。 在本发明另一实施方案中，PCV2抗原与来自另一种引起猪疾病的生物的抗原组合。在这样 的情况下，PCV2成分的RP值如上述。此外，在本发明另一实施方案中，PCV2抗原和猪肺炎 支原体抗原，优选猪肺炎支原体菌苗，与来自另一种引起猪疾病的生物的抗原组合。在这样 的情况下，猪肺炎支原体成分和PCV2成分的RP值如上述。优选另一种引起猪疾病的生物选自胸膜肺炎放线杆菌 (Actinobacilluspleuropneumonia) (1)；腺病毒(2) ；Alpha 病毒如东部马脑炎病 _ (Easternequine encephalomyelitis viruses) (3) ； H iW 双 个生 ff # K (Bordetellabronchiseptica) (4)；短电累旋体(Brachyspira spp. ) (5),优选猪病疾 短螺旋体(B. hyodyentheriae) (6)；大肠柔毛短螺旋体(B. piosicoli) (7)，猪布氏 杆菌病(Brucella suis),优选牛型变种(biovars) 1，2，和3型(8)；典型猪瘟病毒 (Classical swine fever virus) (9)；梭状芽抱杆菌(Clostridium spp.) (10)，优选 艰难梭菌(Cl. Difficile) (11)，产气荚膜梭菌(Cl. Perfringens)A, B，和 C 型(12)， 诺维氏梭菌(Cl. Novyi) (13)，糜烂梭菌(Cl. Septicum) (14)，破伤风梭菌(Cl. tetani) (15)；冠状病毒(Coronavirus) (16)，优选猪呼吸道冠状病毒(PorcineRespiratory Corona virus) (17)；猪附红细胞体(Eperythrozoonosis suis) (18)；猪红斑丹毒丝 菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)(19)大肠埃希氏菌(Escherichia coli) (20)； 附猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，优选1，7和14亚型(21)猪血凝性脑脊髓炎 病毒(Hemagglutinating encephalomyelitis virus) (22)；日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus) (23)；胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis) (24)钩端螺旋 体(Leptospira spp.) (25)，优选澳洲型钩端螺旋体(Leptospira australis) (26)；
16犬型钩端螺旋体(L印tospiracanicola) (27)；流感伤寒型钧端螺旋体(Leptospira grippotyphosa) (28) ； Hj ifil Jt ^ 螺旋{φ (Leptospira icterohaemorrhagicae) (29)；以及问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans) (30)；波蒙那钩端螺旋体 (Leptospira Pomona) (31) ； ii ^ ^ il 旋 W (Leptospira tarassovi) (32)；免 枝杆菌(Mycobacterium spp.) (33)优选鸟分枝杆菌(M. avium) (34)，胞内分枝杆菌 (M. intracellulare) (35)以及牛分枝杆菌(M. bovis) (36)；多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida) (37)；猪巨细胞病毒(Porcine cytomegalovirus) (38)；猪微小病毒(Porcine Parvovirus) (39)；猪生殖呼吸综合征(PRRS)病毒(40)伪狂犬病毒(Pseudorabies virus) (41)；轮状病毒(Rotavirus) (42)；沙门氏菌(Salmonella spp.) (43)，优选鼠伤寒沙门氏 菌(S. thyphimurium) (44)和猪霍乱沙门氏菌(S. choleraesuis) (45)；猪葡萄球菌(Staph. Hyicus) (46)；葡萄球菌(Staphylococcus spp. ) (47)优选链球菌(Streptococcus spp.) (48)，优选猪链球菌(Strep. Suis) (49)；猪疱疹病毒(50)；猪流感病毒(51)；猪痘病毒 (52)；猪痘病毒(53)；水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus) (54)；猪的水疱疹 (vesicular exanthema)病毒(55)；哈德焦钩端螺旋体(Leptospira Hardjο) (56)；猪圆环 病毒(57)；禾口 / 或猪滑液支原体(Mycoplasma hyosynoviae) (58)。下文中关于猪病原体的任何引述可通过命名该病原体，例如多杀巴斯德氏菌，或 通过引述上文所示该病原体之后的括号0中的数字编号来进行。例如，多杀巴斯德氏菌可 以表述为多杀巴斯德氏菌或表述为(37)。因此，本发明涉及对猪进行治疗和/或预防的组合疫苗，其包括有效减少猪肺炎 支原体和/或PCV2感染的发生率或减轻其严重性的免疫因子，以及有效治疗和/或预防 由(1)，(2)，(3)，(4)，(5)，(6)，(7)，(8)，(9)，(10)，(11)，(12)，(13)，(14)，(15)，(16)， (17)， (18)， (19)， (20)， (21)， (22)， (23)， (24)， (25)， (26)， (27)， (28)， (29)， (30)， (31)， (32)， (33)， (34)， (35)， (36)， (37)， (38)， (39)， (40)， (41)， (42)， (43)， (44)， (45)， (46)， (47)，(48)，(49)，(50)，(51)，(52)，(53)，(54)，(55)，(56)，(57)和 / 或(58)中任何猪病 原体引起的感染的免疫活性成分，或者是所述猪病原体的免疫活性成分。“免疫活性成分”在本文中是指，在施用该成分的动物体内诱导或刺激免疫应答的 成分。根据优选实施方案，所述免疫应答针对该成分或针对含有该成分的微生物。根据另 一优选实施方案，所述免疫活性成分是减毒的微生物，包括改良的活病毒(MLV)，灭活的微 生物或至少微生物的免疫活性部分。“微生物的免疫活性部分”在本文中是指微生物中含有蛋白、糖(sugar)和或糖蛋 白的级分，其包含至少一种抗原，该抗原在施用该抗原的动物体内诱导或刺激免疫应答。根 据优选实施方案，所述免疫应答针对微生物的所述免疫活性部分，或针对含有该免疫活性 部分的微生物。根据另一方面，组合疫苗中的另一种免疫活性成分选自Enterisol Ileitis， Enterisol Ileitis FF, Enterisol SC-54，Enterisol SC-54FF，Enterisol ERY-ALC， Ingelvac APP ALC，Ingelvac AR4, Ingelvac HP-I，Ingelvac HPE-I，Ingelvac PRRS MLV, Ingelvac PRRS ATP, Ingelvac PRV-Gl，Reprocyc PRRS PLE，Reprocyc
PLE, Tetguard , Toxivac AD+E, Toxivac Plus Parasuis,(者β * 自 Boehringer Ingelheim, St. Joseph, MO, USA) ；Circovent, Porcilis Coli, Porcilis ERY+PARV0,Porcilis Ery,PorcilisGlasser,Porcilis Parvo,Porcilis Porcoli DF,Porcilis APP, Porcilis AR-T,PorcilisAR-T DF,Porcilis Porcoli,Porcilis Porcoli Diluvac forte, Porcilis PRRS, PorcilisPorcol 5, Porcilis Aujeszky, Porcilis Begonia Diluvac, Porcilis Begonia I. D. A. L. , Porcilis Begonia Unisole, Porcilis M. hyo, Porcilis Atrinord, Rhinogen BPE，Rhinogen CTE 5000，Rhinogen CTSE，Score, Sow Bac E II，Sow Bac CEII，Sow Bac TREC，ProSystem CE，ProSystem RCE，ProSystem TREC, ProSystem Pillmune，ProSystem R0tamune 带Imugan II，ProSystem Rota, ProSystem Rotamune KV. ProSystem TG- Emune Rota 带 Imugan II， ProSystem TGE/Rota，ProSystem TG- Emune 带 Imugen , ProSystem TGE， MaGESTIC 7，MaGESTIC 8，MaGESTic 带Spur ,MaGESTic 7 带Spur , MaGESTic 8 带 Spur , End- FLUence 带 Imugen II，End- FLUence 2，PRRomiSE , PRV-Begonia 带 Dlluvac Forte ,Argus SC/ST，Str印 Bac, Str印 Bac 带Imugen II， CoIisorb, Heptavac, Lambivac, Porcovac plus, Erysorb Parvo 者β 来自 Intervet Inc. , Millsboro, DE, USA) ；Hyoresp, Circovac, Neocolipor, Parvoruvac, Parvosuin, Progressis, Viraf lu, Akipor 6. 3, Jespur gl-, Jesflu gl_ (都来自 Merial LTD, Duluth, GA) ；ER BAC PLUS，ERBAC , ERBAC PLUS/LEPTOFERM- 5 ，ER BAC Liiptoferm- 5 , Farrowsure , Farrowsure B，FARROWSURE PLUS B, FARROWSURE PLUS, FARROWSURE PRV, FARROWSURE B-PRV, FLUSURE , FLUSURE RTU, FLUSURE /ER BAC PLUS, FLUSURE/ER BAC PLus , FLUSURE / RESPISURE , FLUSURE / RESPISURE RTU, FLUSURE /RESPISURE- ONE /ER BAC PLUS, FLUSURE/RespiSure 1 ONE /ER BAC Plus , FLUSURE /RESPISURE ONE , FLUSURE/ RESPISURE 1 ONE , FLUSURE/Farrowsure Plus, FLUSURE/Farrowsure Plus B, LITTERGUARD LT-C，LITTERGUARD LT, Pleuro Guard 4，Pneumosuis III， Stellamune One, Stellamune Uno, StellamuneOnce, Stellamune Mono, Respisure One, Respisure , Respisure 1 ONE , Respisure 1 One /ER Bac Plus , Enduracell T, Zylexis (formerly known asBaypamune), Atrobac 3, BratiVac , BratiVac ~B, Leptoferm-5. . Parvo- Vac /Leptoferm- 5 , PR- Vac "Killed, PR- Vac , PR-Vac Plus.(都来自 Pfizer Inc. ,New York, NY, USA) ； Suvaxyn MH One, Suvaxyn RespiFend MH, Suvaxyn Aujeszky Bartha+Diluent, SuvaxynAujeszky Bartha+o/w, Suvaxyn Aujeszky-Flu, Suvaxyn Aujeszky 783+o/w, Suvaxyn Ery, Suvaxyn Flu, M. hyo Suvaxyn Parvo ST, Suvaxyn Parvo/E, Suvaxyn RespiFend APP，Suvaxyn RespiFend HPS, Suvaxyn RespiFend MH/HPS，Suvaxyn RespiFend MH，Suvaxyn AR/T/E, Suvaxyn EC-4, Suvaxyn E, Suvaxyn -E, Suvaxyn Ε-oral，Suvaxyn PLE, Suvaxyn PLE/ PrV gpl-，Suvaxyn LE+B, Suvaxyn PLE+B, Suvaxyn PLE+B/PrVgpl-, Suvaxyn SIV, Suvaxyn SIV/Mh-one, Suvaxyn p, Suvaxyn PrV gpl-, Suvaxyn PCV-2 One Shot(都来自 Fort Dodge Animal Health, Overland Park, KS, USA (Wyeth)； SCOURMUNE , SCOURMUNE -C, SCOURMUNE _CR，AR- PAC -PD+ER，AR- PARAPAC +ER，M+ Rhusigen , M+ PAC , MaxiVac Excell 3，MaxiVac HlNl， MaxiVac H3N2，MaxiVac —FLU，MaxiVac _M+, MaxiVac Excell , MaxiVac Excell 3，PARAPAC , PNEU PAC , PNEU PAC _ER，PNEU PAC +ER，PRV/Marker Gold , PRV/Marker Gold , PRV/Marker Gold -MaxiVac FLU, Rhusigen , Gletvax 6， Covexin 8, M+PAC, Gletvax plus, M-Parapac. . SS PAC (者β * 自 Schering-Plough Animal Health Corporation, Kenilworth, NJ, USA) ；AMERVAC-PRRS, AUSKIPRA-BK, AUSKIPRA-GN, COLISUIN-CL，COLISUIN-TP，ERYSIPRAVAC，GRIP0RK, HIPRASUIS- GLAS SER, MYPRAVAC SUIS，NEUMOSUIN,PARVOSUIN,PARVOSUIN-MR,PARVOSUIN-MR/AD, RINIPRAVAC-DT, SUIPRAVAC-PRRS, SUIPRAVAC-RC, TOXIPRA PLUS(都来自 Laboratorios Hipra S. A.， Amer, Girona, Spain) ；Clostricol, Coliporc Plus, Haeppovac, Per-C-Porc, Porciparvac, RESPIPORC ART+EP, RESPIPORC FLU, Respiporc M.hyo 1 SHOT, Rhusiovac, Rotlauf-Lebendimpfstoff, Salmoporc, Suisaloral, AK-vac MK35(都 来 自 IDT Impfstoffwerk DessaTornau, Tornau, Germany) ；Mypravac Suis, (Albrecht GmbH, Germany) ；Haemo Shield P· Parapleuro Shield P· Parapleuro Shield P+BE, Rhinicell FD, Rhini Shield TX4, Prefarrow Shield 9, Prefarrow Strep Shield , Clostratox BCD，Clostratox C，Clostratox Ultra C 1300，Porcine Ecolizer 3+C， Porcine Pili Shield. +C, Porcine Pili Shield Porcine Ecolizer 3, Ery Serum.. Ery Shield. . Ery VacOral, Ery Shield +L5, PanSTAR Ery, Erycel 1. . Parvo Shield E, Parvo Shield L5E，Parvo Shield L5, Parvo Shield , Para Shield ，PneumoSTARSIV， PneumoSTAR Myco, Lepto Shield 5,Myco Shield. . SalmoShield 2, SalmoShield Live, Amitox Tet. . C. Perfringens Type A Toxoid(都来自 Novartis Animal Health, Basel, Switzerland) ；Nitro-Sal (Akro)；或包括在上述组合物中的任何抗原。优选实施方案详述以下实施例描述了恩发明优选的材料和方法。但应理解，这些实施例仅为举例，不 应将它们视为对本发明总体范围的限制。实施例1本项研究设计是为了评价，PCV2-猪肺炎支原体在全剂量和2x1/2剂量时，在组合 产物有两种不同含量的猪肺炎支原体时的组合效力，而且也是为了证实组合产物与单价猪 肺炎支原体相比的任何干扰。材料和方法将猪分为6组。所有攻击组(组1-5)每组有大约19只猪。对照组含有未给予治 疗也未受攻击的猪(组6)，该组有5只猪。所有猪在本研究的第61天尸检。研究时间表见 表1。表 权利要求
在猪体内激发抗猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，M.hyo)的保护性免疫应答的致免疫组合物，所述致免疫组合物包含2型猪圆环病毒的抗原和猪肺炎支原体的抗原，其中每一剂中猪肺炎支原体抗原的量具有至少1.22的相对效力(RP)值，其中猪肺炎支原体的RP值为1.22是指，小鼠被给予了四十分之一(1/40)的所述量的猪肺炎支原体抗原后，95％的小鼠，优选100％的小鼠，在处理后的21天内或第21天之时，在猪肺炎支原体特异性抗体检测试验中测得，产生了可检测的量的抗体。
2.权利要求1的致免疫组合物，每一剂中2型猪圆环病毒的抗原的量具有至少1.38的 相对效力(RP)值，其中2型猪圆环病毒的抗原的RP值为1.38是指，小鼠被给予了十分之 一 (1/10)的所述量的2型猪圆环病毒抗原后，95%的小鼠，优选100%的小鼠，在处理后的 21天内，在2型猪圆环病毒特异性抗体检测试验中测得，产生了可检测的量的抗体。
3.权利要求1或2的致免疫组合物，还包含佐剂。
4.权利要求3的致免疫组合物，所述佐剂为卡波姆(carbomer)。
5.权利要求4的致免疫组合物，所述卡波姆是卡波普(Carbopol)。
6.权利要求1-5之一的致免疫组合物，所述致免疫组合物以单剂对猪给药时，激发抗 猪肺炎支原体的保护性免疫应答。
7.权利要求2-5之一的致免疫组合物，所述致免疫组合物以单剂对猪给药时，激发抗 猪肺炎支原体和2型猪圆环病毒的保护性免疫应答。
8.权利要求1-7之一的致免疫组合物，所述致免疫组合物对猪给药时，激发了持续至 少130天的抗猪肺炎支原体和/或2型猪圆环病毒的免疫力。
9.权利要求8的致免疫组合物，所述致免疫组合物对猪给药时，激发了持续至少150天 的抗猪肺炎支原体和/或2型猪圆环病毒的免疫力。
10.权利要求8的致免疫组合物，所述致免疫组合物对猪给药时，激发了持续至少184 天的抗猪肺炎支原体和/或2型猪圆环病毒的免疫力。
11.权利要求1-10之一的致免疫组合物，其中所述特异性抗体检测试验是ELISA。
12.权利要求1-11之一的致免疫组合物，其中用于检测猪肺炎支原体特异性抗体的特 异性抗体检测试验是IDEXX Herdchek猪肺炎支原体测试试剂盒。
13.权利要求2-12之一的致免疫组合物，其中用于检测2型猪圆环病毒特异性抗体的 特异性抗体检测试验是，用于检测猪圆环病毒(PCV)抗体的基于2型PCV且基于重组衣壳 蛋白(0RF2)的改良、间接 ELISA，例如 Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9 33-40(2002)所述。
14.在猪体内激发抗猪肺炎支原体的保护性免疫应答的方法，包括对所述猪给予致免 疫组合物，该组合物包含2型猪圆环病毒的抗原和猪肺炎支原体的抗原，其中每一剂中猪 肺炎支原体抗原的量具有至少1. 22的相对效力(RP)值，其中猪肺炎支原体的RP值为1. 22 是指，小鼠被给予了四十分之一(1/40)的所述量的猪肺炎支原体抗原后，95%的小鼠，优 选100%的小鼠，在处理后的21天内或第21天之时，在猪肺炎支原体特异性抗体检测试验 中测得，产生了可检测的量的抗体。
15.权利要求14的方法，其中每一剂中2型猪圆环病毒的抗原的量具有至少1.38的相 对效力(RP)值，其中2型猪圆环病毒的抗原的RP值为1.38是指，小鼠被给予了十分之一 (1/10)的所述量的2型猪圆环病毒抗原后，95%的小鼠，优选100%的小鼠，在处理后的21 天内，在2型猪圆环病毒特异性抗体检测试验中测得，产生了可检测的量的抗体。
16.权利要求14或15的方法，其中所述组合物还包含佐剂。
17.权利要求16的方法，所述佐剂是卡波姆。
18.权利要求17的方法，所述卡波姆是卡波普。
19.权利要求14-18之一的方法，所述致免疫组合物以单剂对猪给药时，激发抗猪肺炎 支原体的保护性免疫应答。
20.权利要求14-18之一的方法，所述致免疫组合物以单剂对猪给药时，激发抗猪肺炎 支原体和2型猪圆环病毒的保护性免疫应答。
21.权利要求14-20之一的方法，所述致免疫组合物对猪给药时，激发了持续至少130 天的抗猪肺炎支原体和/或2型猪圆环病毒的免疫力。
22.权利要求21的方法，所述致免疫组合物对猪给药时，激发了持续至少150天的抗猪 肺炎支原体和/或2型猪圆环病毒的免疫力。
23.权利要求21的方法，所述致免疫组合物对猪给药时，激发了持续至少184天的抗猪 肺炎支原体和/或2型猪圆环病毒的免疫力。
24.权利要求14-23之一的方法，其中所述特异性抗体检测试验是ELISA。
25.权利要求14-24之一的方法，其中用的特异性抗体检测试验是IDEXXHerdchek猪 肺炎支原体测试试剂盒。
26.权利要求15-25之一的方法，其中用于检测2型猪圆环病毒特异性抗体的特异性 抗体检测试验是，用于检测猪圆环病毒(PCV)抗体的基于2型PCV且基于重组衣壳蛋白 (0RF2)的改良、间接 ELISA，例如 Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9 33-40(2002)所述。
全文摘要
本发明提供了多价组合疫苗，其包括有效减少猪肺炎支原体感染发生率或减轻猪肺炎支原体感染的严重性的免疫因子(优选猪肺炎支原体菌苗)，或含有猪肺炎支原体菌苗的致免疫组合物，以及至少一种引起猪的其它疾病的致免疫活性成分(优选PCV2)，其中用于所述多价疫苗的优选的PCV2抗原是PCV2 ORF 2蛋白。
文档编号A61K39/02GK101980720SQ200980110512
公开日2011年2月23日 申请日期2009年1月23日 优先权日2008年1月23日
发明者迈克尔·鲁夫, 马克·艾克梅耶 申请人:贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司