专利名称：由来源于原核细胞的重组n-糖基化蛋白制备生物共轭物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物共轭物，尤其是生物共轭疫苗，由重组糖蛋白制备，命名为N-糖 基化蛋白。该发明包括一种或多种诱导N-糖基化蛋白，含有最优化的氨基酸共识序列，编 码这些蛋白的核酸序列以及相应的载体和宿主细胞。另外，本发明还针对于使用所述蛋白、 核酸、载体及宿主细胞用于制备生物共轭疫苗。进一步，本发明提供了制备生物共轭疫苗的 方法。
背景技术：
糖基化蛋白是含有一个或多个共价结合糖聚合物的蛋白质。N-连接的蛋白糖 基化是存在于真核生物内质网上的一个必要及保守的过程。它对于蛋白质的折叠、齐聚、 稳定性、质量控制、分泌蛋白和膜蛋白的分类及运输都很重要(Helenius，Α.，and Aebi, Μ. (2004).Roles of N-Iinked glycans in the endoplasmic reticulum. Annu. Rev. Biochem. 73，1019-1049)。蛋白糖基化对于蛋白质的抗原性、稳定性及半衰期有深刻的影响。另外，糖基化还 可以辅助色谱法纯化蛋白，例如，结合于固相的凝集素配体亲和色谱可与蛋白的糖基化基 团反应。因此，已经建立实践用于在真核细胞中生产重组糖基化蛋白，从而提供生物及医药 上有用的糖基化标品。已经证实食源性致病菌空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)也能够N-糖基化其 自身白勺蛋白质(Szymanski, et al. (1999). Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni. Mol· Microbiol· 32，1022—1030) 。 M ■胃白勺 糖基化系统由12个基因编码，位于所谓的pgl基因簇中。破坏N-糖基化会影响空肠弯 曲菌的入侵及致病性，但不会像大部分真核生物那样致命(Burda P. and Μ. Aebi, (1999). The dolichol pathway of N-Iinked glycosylation. Biochim Biophys Acta 1426(2) 239-57)。在大肠杆菌中同时重组表达pgl基因簇和糖蛋白受体有可能重建空肠弯曲菌蛋 白白勺 N—H-Uil禾呈(ffacker et al. (2002). N-Iinked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E.coli.Science 298,1790-1793)。腹泻是一种主要的健康疾病，它与频繁的国际旅行以及经济影响有关。旅行者的 腹泻主要归因于获得性肠道疾病，例如当一个人从一个发达国家到发展中国家旅行时。如 今，每年有超过5千万的人从发达国家到发展中国家旅行，而这些旅行者中有将近50%的 人报告他们会在逗留时间的前两周内腹泻。自从二十世纪七十年代以来，尽管各地的旅游 业努力改善当地的基础设施，但旅行者腹泻的发病率没有明显的下降。旅行者是通过摄取受污染的食物以及较少的自来水而得了腹泻。细菌是旅行者腹 泻的主要原因，至少80%的感染者是由于这个原因。在全世界与旅行者腹泻相关的细菌中， 最常分离到的是产肠毒素大肠杆菌(ETEC)，然后是痢疾杆菌和空肠弯曲菌。杆菌性痢疾仍然是一种严重且常见的疾病。除了造成水样腹泻，志贺氏菌还是痢 疾(发烧、腹痛、便中含血和粘液)的主要原因。男子是这种细菌的天然宿主。每年感染痢 疾的人数大约超过2亿。其中大约5百万需要住院治疗，1百万人会死亡。这种杆菌性痢疾病主要源于三种血清型S. dysenteriae, S. flexneri以及S. sonnei。S. dysenteriae和S. flexneri是热带地区感染的主要原因，死亡率可达20 %。 杆菌性痢疾既以地方性又以流行性疾病存在。在很多热带国家中，地方性感染主要源于 S. flexneri,而主要的S. dysenteriae流行病存在于中美洲、中非以及东南亚。这些流 行病是很大的公共健康危害。在工业化国家中，主要来自于S. sonnei而少部分来自于 S. flexneri的感染仍然存在。在抵抗细菌性痢疾方面，共轭疫苗已经显示出有希望的结果。I型S. dysenteriae 的0-特异性多糖已被用于合成一种共轭疫苗，该疫苗在小鼠体内已引起免疫反应。这样的 疫苗或已通过化学法合成并偶联于人血清白蛋白，或者开发用于志贺氏菌中0-多糖已被 纯化的地方。S. sonnei和S. flexneri的0-特异性多糖也已经通过化学法偶联于绿脓杆菌 外毒素，并且在小鼠体内引起明显的免疫反应。另外，它们在人体中已显示出免疫原性和安 全性。然而，化学偶联是昂贵且耗时的过程，不能总产生可靠且重复性好的疫苗。当在商业 规模上寻求开发这样的生物共轭疫苗时，这会导致生产质量管理规范(GMP)问题
发明内容
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-方面，本发明涉及一种生物共轭疫苗，包括一种插入共识序列的蛋白载体，共
识序列为D/E-X-N-Z-S/T，序列中X和Z可以为除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸；来源于 至少一种病原细菌的至少一种抗原多糖，链接于蛋白载体上，其中，至少一种抗原多糖是至 少一种细菌性0-抗原，这些抗原来自于志贺氏菌、大肠杆菌以及绿脓杆菌其中的一种或多 种；并且可选一种佐剂。 另一方面，本发明涉及一种志贺氏菌痢疾生物共轭疫苗，包括一种包含绿脓杆菌 外毒素(EPA)的蛋白载体，且被修饰为含有至少一种共识序列D/E-X-N-Z-S/T，序列中X和
Z可以为除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸；至少-
以下结构并且可选一种佐剂。
-条多糖链连接于蛋白载体上并且含有
权利要求
一种生物共轭疫苗，包括一种蛋白载体，包含插入的共识序列，D/E X N Z S/T，其中X和Z可以为除脯氨酸外的任何天然氨基酸；来源于至少一种细菌的至少一种抗原多糖，链接于蛋白载体上，其中，至少一种抗原多糖是至少一种细菌性O 抗原，这些抗原来自于志贺氏菌、大肠杆菌以及绿脓杆菌其中的一种或多种；并且任选一种佐剂。
2.根据权利要求1的生物共轭疫苗，其中蛋白载体是一种被修饰的绿脓杆菌外毒素 (EPA)，含有至少一个共识序列。
3.根据权利要求2的生物共轭疫苗，其中EPA含有两个共识序列。
4.根据权利要求1的生物共轭疫苗，其中，至少一种细菌性0-抗原来源于志贺氏痢疾 杆菌01。
5.根据权利要求1的生物共轭疫苗，其中至少一种细菌性0-抗原来源于肠外致病大肠 杆菌(ExPEC)。
6.根据权利要求2的生物共轭疫苗，其中被修饰的EPA含有SEQID NO 7所提供的序列。
7.根据权利要求1的生物共轭疫苗，其中至少一种细菌性0-抗原来源于志贺式痢疾杆 菌01，福氏志贺氏菌2a、福氏志贺氏菌3a、福氏志贺氏菌3b、福氏志贺氏菌6、宋内氏志贺氏 菌中的一种或多种。
8.根据权利要求1的生物共轭疫苗，其中至少一种细菌性0-抗原来源于大肠杆菌04 K52 (ExPEC)，大肠杆菌 04 :K6 (ExPEC)，大肠杆菌 06 :K2 (ExPEC)，大肠杆菌 06 :K54 (ExPEC)， 大肠杆菌022 (ExPEC)，大肠杆菌075 (ExPEC)，大肠杆菌083 (ExPEC)，大肠杆菌07，大肠杆菌 09，大肠杆菌016，大肠杆菌0121，大肠杆菌0157 (EHEC)中的一种或多种。
9.根据权利要求1的生物共轭疫苗，其中至少一种细菌性0-抗原来源于绿脓杆菌011。
10.一种志贺氏生物共轭疫苗，包括一种包含绿脓杆菌外毒素(EPA)的蛋白载体，且被修饰为含有至少一种共识序列D/ E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以为除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸；至少一条多糖链连接 于蛋白载体上并且含有以下结构
11.根据权利要求10的志贺氏生物共轭疫苗，其中蛋白载体为被修饰的ΕΡΑ，含有两个 共识序列。
12.—种志贺式痢疾杆菌01生物共轭疫苗，包括 一种蛋白载体，具有SEQ ID NO 7所提供的序列； 至少一条多糖链连接于蛋白载体上，并且含有如下结构
13.一个包含SEQ ID NO 5序列的质粒。
14. 一段包含SEQ ID NO 5的基因序列。
15. 一段包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列。
16. 一段包括SEQ ID NO 7的氨基酸序列。
17. 载体 PGVXN64。
18.一种表达系统，用于生产至少抵抗一种细菌的生物共轭疫苗，包括 一段编码一种寡糖转移酶(OST/OTase)的核酸序列； 一段编码蛋白载体的核酸序列；来自于至少一种细菌的至少一个抗原多糖合成基因簇，该抗原多糖为细菌0-抗原。
19.根据权利要求18的表达系统，其中寡糖转移酶(OST/OTase)具有SEQID NO :2所 提供的序列。
20.根据权利要求18的表达系统，其中蛋白载体已被修饰为含有至少一个共识序列， D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以为除脯氨酸外的任何天然氨基酸。
21.根据权利要求18的表达系统，其中所选的蛋白载体由AcrA和EPA组成，已被修饰 为含有至少一个共识序列，D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以为除脯氨酸外的任何天然氨基酸。
22.根据权利要求18的表达系统，其中编码蛋白载体的核酸序列包含SEQID NO :6。
23.根据权利要求18的表达系统，其中的细菌选自于致病菌集合，志贺氏菌、大肠杆 菌、绿脓杆菌011或土拉弗朗西斯菌。
24.一种表达系统，用于生产抵抗志贺式痢疾杆菌01的生物共轭疫苗，包括 一段含有SEQ ID NO 2的PgIB的核酸编码序列；一段含有SEQ ID NO 6的修饰EPA编码序列；以及 含有SEQ ID NO 5的一个多糖合成基因簇。
25.—种工程细菌，含有权利要求24的表达系统，其中编码PgIB的核酸序列以及编 码修饰的EPA的核酸序列稳定的整合于大肠杆菌基因组中，多糖合成基因簇以质粒形式引 入。
26.根据权利要求25的细菌，其中细菌为大肠杆菌。
27.一种在生物反应器重生产01-生物共轭疫苗的方法，包括以下步骤在细菌中表达修饰后的EPA，含有至少一种共识序列，D/E-X-N-Z-S/T，序列中X和Z 可以为除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸，或者是AcrA ；PgIB ；以及一条或多条01-多糖； 培养细菌一段时间来生产一定量的01-生物共轭疫苗，含有连接于一条或多条01-多 糖上的AcrA或者修饰的EPA ； 提取周质蛋白；以及从提取到的周质蛋白中分离01-生物共轭疫苗。
28.—种生产志贺式痢疾杆菌生物共轭疫苗的方法，所述方法包括 通过在一个重组生物中使用糖基转移酶组装痢疾杆菌多糖；将上述多糖连接至所述重组生物中的一个或多个目标蛋白的一个天冬酰胺残基上，其 中所述的一个或多个目标蛋白包含至少一个或多个T-细胞抗原决定簇。
29.—种生产志贺式痢疾杆菌生物共轭疫苗的方法，所述方法包括在一种原核生物中引入一种编码代谢机制的遗传信息，该代谢机制执行目标蛋白的 N-糖基化，从而得到一种修饰的原核生物，其中，表达一个或多个重组目的蛋白所需的遗传 信息被引入所述的原核生物中，代谢机制包括特异性的糖基转移酶用于把痢疾杆菌的一 种多糖组装至一种脂载体上，以及一种寡糖转移酶，该寡糖转移酶将多糖共价结合于目标 蛋白的天冬酰胺残基上，目标蛋白含有至少一种T-细胞抗原决定簇； 将修饰的原核生物进行培养；以及 从培养基中得到糖基化的蛋白。
全文摘要
本发明针对于生物共轭疫苗，例如O1-生物共轭疫苗，内容包括含有至少一种共识序列的蛋白载体，共识序列为D/E-X-N-Z-S/T，序列中X和Z可以为除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸；来源于至少一种病原细菌的至少一种抗原多糖，链接于蛋白载体上，而且，任选一种佐剂。另一方面，本发明还针对于一种在生物反应器中使用一些步骤生产O1-生物共轭疫苗的方法。
文档编号A61K39/385GK101983070SQ200980110137
公开日2011年3月2日 申请日期2009年2月19日 优先权日2008年2月20日
发明者F·弗尔南德兹, M·威特, M·瓦克, M·科沃瑞克 申请人:格林考瓦因有限公司