专利名称：新的猪肺炎支原体菌株及其疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的猪肺炎支原体以及疫苗组合物，属于兽用疫苗领域。
背景技术：
猪肺炎支原体是猪支原体肺炎的病原体。猪支原体肺炎是猪的ー种慢性消耗性呼吸道病，临床感染率极高。该疾病导致持续几周的持续性咳嗽、被毛失去光泽、生长迟缓和外观不壮实。猪群一旦感染猪肺炎支原体，便难以清除，不仅严重影响猪群的生长发育，用药量增加，而且容易继发感染PRRSV (猪蓝耳病病毒)、PCV (猪圆环病毒)等，从而导致多种疫苗接种失败。猪肺炎支原体作为猪呼吸道病综合征的重要病原之一，毎年的经济损失估计在2亿 2. 5亿美元之间。直接或间接对养猪业造成了巨大的经济损失。目前，世界上预防和控制猪肺炎支原体感染的有效的手段是对猪群进行疫苗免疫。大多数疫苗均为含有佐剂的全菌体灭活疫苗，通常情况下这些疫苗均能提供较好的保护作用，如改善临床症状，減少肺损伤，減少因猪肺炎支原体感染用药，提高生长效率等。目前，广泛应用的疫苗是以猪肺炎支原体J株或P株作为抗原的灭活疫苗，使用J株或P株制备的疫苗在全球很多国家销售和使用。然而，由于猪群中的流行株的变异，在临床上仍能观察到不同的猪群疫苗免疫后免疫效果方面存在差异，即存在ー些免疫效果欠佳的群体。临床上观察到的这些差异原因是由于猪群中的流行株与疫苗株间存在抗原差异造成的(Villarreal等，BMC Veterinary Research 2012，8:2)。有研究表明，目前猪群中流行的毒株在基因水平、蛋白水平以及毒力方面与疫苗使用的猪肺炎支原体J株或P株存在较大的差异(如文献 Stakenborg 等，Vet Microbiol 2005，109:29-36 ;Calus 等，Vet Microbiol2007,120:284-91. ;Vicca 等 Vet Microbiol 2003,97:177-190. ;Meyns 等，Prev Vet Med2004, 66:265-275中所报道的 内容)。上述文献资料表明，疫苗使用的猪肺炎支原体J株对猪支原体肺炎的临床预防和 治疗效果欠佳。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供ー种经分离鉴定为免疫原性更好的猪肺炎支原体毒株，并以该毒株为抗原研制保护效果更好的疫苗。即发明人意外发现ー株猪肺炎支原体毒株，该毒株具有良好的免疫原性，与当前广泛使用的猪支原体肺炎疫苗株J株相比，具有更好的免疫原性，制备成疫苗后有更好的免疫保护效果。S卩，本发明的第一方面是提供一种猪肺炎支原体菌株，菌株名称为HN0613株，保藏编号为CCTCC M2012230，保藏单位为位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏日期:2012年6月13日。本发明还提供了上述猪肺炎支原体HN0613株制备的猪肺炎支原体抗原与含有该猪肺炎支原体抗原的猪支原体肺炎疫苗。优选地，本发明所述的猪支原体肺炎疫苗中，猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体HN0613株的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或任何其它含猪肺炎支原体HN0613株免疫原性氨基酸序列的多肽或亚単位抗原。更优选地，所述的猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体全菌抗原(即，灭活的猪肺炎支原体HN0613株)。优选地，本发明所述的猪支原体肺炎疫苗中，猪肺炎支原体抗原的含量为所述的灭活的猪肺炎支原体HN0613株抗原抗原的含量为IO7 IO9CCU /头份(以每头份2ml计，下同)，即灭活的猪肺炎支原体抗原在灭活前猪肺炎支原体含量为IO7 IO9CCU /头份(2ml);更优选地，所述的灭活的猪肺炎支原体HN0613株抗原含量为灭活前f2X IO8CCU/头份；最优选地，灭活的猪肺炎支原体HN0613株的含量为灭活前2X IO8CXU /头份(2ml)。优选地,本发明所述的猪支原体肺炎疫苗中，还包括疫苗佐剂,所述佐剂指包含一种或多种物质的组合物，能够增强猪肺炎支原体的免疫原性和功效的物质。优选地，本发明所述的疫苗佐剂为Gel 01 (法国SCIPPIC)、氢氧化铝胶、矿物油、可代谢油、卡波姆(Carbomer)、蜂胶、ISA206 (法国 SCIPPIC)、ISA760VG (法国 SCIPPIC)的一种或几种的组合。更优选地，本发明所述的疫苗佐剂为卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol )、Gel 01 (法国SCIPPIC)、铝胶；最优选地，发明所述的疫苗佐剂为Gel 01 (法国SCIPPIC)。 如本发明后续实施例所证明的，本发明的猪肺炎支原体HN0613株抗原制备的猪支原体肺炎疫苗，相对于猪肺炎支原体J株和P株的疫苗，可以更有效地预防和治疗猪肺炎支原体引起的猪支原体肺炎及相关疾病。此外，发明人还意外地发现，本发明的猪肺炎支原体HN0613株抗原与其他的猪病原体抗原的配合更好，包括但不限于以下的猪病原体抗原猪圆环病毒2型抗原、猪流感病毒(SIV)抗原、猪生殖呼吸综 合征抗原(PRRSV)、副猪嗜血杆菌(HPS)抗原、猪伪狂犬病毒(PRV)抗原、猪波氏杆菌抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原，与本发明的本发明的猪肺炎支原体HN0613株抗原与其他的猪病原体抗原相互无干扰；特别地令人惊奇的是，当本发明的猪肺炎支原体HN0613株抗原与猪圆环病毒2型的抗原相配合时,不仅两种抗原之间无干扰，而且相对于两种抗原独立制备的疫苗(即猪肺炎支原体单苗和猪圆环病毒2型单苗)而言，免疫效カ均有了显著地提高。基于上述认识，本发明的另一方面是提供了一种预防或治疗猪圆环病毒2型(PCV2)、猪肺炎支原体感染的抗原组合物，其包含至少ー种猪圆环病毒2型抗原和至少ー种猪肺炎支原体抗原。本发明的预防和治疗猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体感染的疫苗组合物中，包含灭活的猪圆环病毒2型或PCV 0RF2蛋白、灭活的猪肺炎支原体以及疫苗佐剂。猪圆环病毒2型抗原是指含有至少ー种PCV2抗原形式的任何组合物，所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗PCV2感染的免疫应答。优选地，所述PCV2抗原是PCV2全病毒、优选为灭活的PCV2全病毒、含有PCV2免疫原性氨基酸序列(如0RF2蛋白)的嵌合病毒，任何其它至少含PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚単位或其他成分。PCV2抗原还可以包含以下组合物的任ー种抗原:如梅里亚公司(Merial)的CirCOVaC ;
辉瑞公司(Pfizer)的Suvaxyn PCV2;哈尔滨维科生物技术开发公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)；福州大北农生物技术有限公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBN-SX07株)和基因工程亚单位疫苗(如勃林格殷格翰公司(Boehringer-1ngelheim)的Ingelvac (； I !'CO F LEX )
因PCV2基因组大小为1767bp或1768bp，不同毒株之间核苷酸序列同源性较高，均在90%以上，因此PCV2SH株(GenBank登录号为AY686763)、PCV2LG株(GenBank登录号为HM038034), PCV2DBN-SX07-2 (GenBank 登录号为 HM641752)均在本发明之内。优选地，本发明中猪圆环病毒2型抗原为灭活全病毒抗原，优选PCV2SH株，保藏号为 CGMCC No. 23890，公开于专利文献 CN101240264A。优选地，本发明所述的灭活的猪圆环病毒2型每剂量或每头份含量灭活前为3X IO5 0 IO8 tlTCIDン头份，更优选本发明所述的灭活的猪圆环病毒2型含量为灭活前Ixio60TCID50/ 头份。优选地，本发明中猪圆环病毒2型抗原为含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位或其他成份，更优选地，猪圆环病毒2型抗原为PCV2亚单位抗原，最优选地，猪圆环病毒2型抗原为PCV20RF2蛋白。其中，本发明PCV20RF2蛋白，优选序列表SEQN01. DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ N02.氨基酸序列的蛋白或与其同源性在75%以上优选80%、更优选90%的蛋白能达到本发明目的的蛋白序列。本发明对PCV20RF2蛋白没有特别的限制，只要其具有保留对PCV2的免疫原性，任何PCV20RF2蛋白都可用作本文所述PCV20RF2DNA和/或多肽的来源。优选地，所述PCV20RF2蛋白的含量为2 20 U g/头份，优选5 U g/头份。猪肺炎支原体抗原是指含有灭活的猪肺炎支原体抗原，所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪肺炎支原体感染的免疫应答。猪肺炎支原体包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株。优选地，所述猪肺炎支原体抗原是完整的猪肺炎支原体，优选为灭活形式，更优选为猪肺炎支原体HN0613株。
正如本领域技术人员所知，不同的微生物野外分离株在基因序列上有微小的变异，然而，当变异不影响其蛋白质合成、结构或者主要作用功能区时，该微生物之他种野外分离株即使基因序列无法百分之百相同，其基本的生理功能并不会有所改变。但是同源性比较如果针对全部的基因来进行比对，在实际上是非常巨大的工程，不太可行，目前国际上常使用16S Ribosomal RNA (16S rRNA)来进行细菌型的分辨，因此在相似性的比较上可以用16S rRNA来进行比对而得到其同源性。所以本发明所使用的支原体抗原并不限定于本发明所使用的野外分离株，16s rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长(包含约50个功能域)因此，本发明包括与猪肺炎支原体(HN0613株)16S rRNA的同源性在80%上以上的菌株，更优选与HN0613株16S rRNA同源性在至少90%，至少95%，至少95% 99%的猪肺炎支原体菌株，即不改变猪肺炎支原体16S rRNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的猪肺炎支原体，获得与本发明猪肺炎支原体16S rRNA高度同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似免疫原性的抗原组合物。优选地，本发明所述的灭活的猪肺炎支原体为HN0613株，保藏号为CCTCCM2012230。优选地，本发明所述的灭活的猪肺炎支原体灭活前含量为IO7 IO9CXU /头份。更优先的猪肺炎支原体含量为2 X IO8CCU /头份优选地，本发明所述的疫苗佐剂混合物为Gel 01 (法国SCIPPIC)、氢氧化铝胶、矿物油、可代谢油、卡波姆(Carbomer)、蜂胶、ISA206(法国 SCIPPIC)、ISA760VG(法国 SCIPPIC)的一种或几种的组合。更优选地，本发明所述的疫苗佐剂为卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol), Ge I Ol (法国SCIPPIC)、铝胶；最优选地，发明所述的疫苗佐剂为Gel 01 (法国SCIPPIC)。优选地，本发明所述的所述的疫苗佐剂的用量为5% 30%重量，所述的疫苗组合物中抗原成份的混合物用量为70% 95%重量，即PCV2抗原、灭活的猪肺炎支原体的用量
为70% 95%重量。 由上可知，本发明的猪肺炎支原体HN0613株抗原制备的猪支原体肺炎疫苗，是ー种可以有效预防和治疗目前的流行的猪支原体肺炎的疫苗；由后续实施例所证明，本发明的猪支原体肺炎疫苗，免疫效果明显高于目前大量使用的猪肺炎支原体J株和P株疫苗，具有不影响增重、肺病变损失小的优点。其次，本发明的猪肺炎支原体HN0613株抗原与其他的猪病原体抗原配合好，相互不影响各自的免疫效カ的发挥，特别令人惊奇地是，当猪肺炎支原体HN0613株抗原与PCV2的抗原(灭活的PCV2抗原或PCV20RF2蛋白抗原)可以显著地提高各自的免疫效カ，因此，在临床使用中，可起到打一针该疫苗即可预防猪圆环病毒病、猪支原体肺炎两种种病的目的，和现有的疫苗相比较，本发明的技术方案对猪肺炎支原体有更好的保护效果。
图1为Friis固体培养基猪肺炎支原体菌落狄氏染色图；图2为猪肺炎支原体PCR鉴定图。
具体实施例方式菌株(毒株)的来源所选用的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2，PCV2)毒株为PCV2b基因型SH株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期2008年3月4日，保藏号为CGMCC23890。所选用的猪肺炎支原体HN0613株，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期:2012年6月13日，保藏号为CCTCCM2012230。PBS 液配方IOOOml 蒸馏水中加入 NaCl 9g、Na2HPO4 12H20 6g、NaH2PO4. 2H200. 4g，pH 7. 2。本发明其他化学试剂，如无特别说明，均为分析纯，并购自国药集団。本发明实施例中肺病变指数评分标准根据7个肺叶病变程度进行评定，最大得分为28分。特异性损伤的肺叶面积为0%时，记为0分，1% 25%记为I分，26% 50%记为2分，51% 75%记为3分，大于75%为4分。本发明实施例统计分析方法为统计7个肺叶的肺病变指数，确定病变程度。用SPSS计算机软件进行ANOVA分析，比较各组间差异，确定病变差异的有效性。为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1、猪肺炎支原体HN0613株的分离鉴定1.材料与方法1.1 材料1.1.1病料来源2006年从河南省各地采集疑似猪支原体肺炎病变肺脏，共16份。1.1. 2培养基猪肺炎支原体Friis培养基购自BD公司；猪血清购自GIBCO公司；酚红指示剂购自美国AMRESC0公司。1.1. 3生化试剂化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，狄氏染色试剂盒购自于重庆庞通医疗器械有限公司。生化鉴定试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司。1. 1.4阴、阳性血清兔抗猪肺炎支原体J株特异性血清，按參考文献方法制备(Meens, J. , Selke, M. , Gerlach,G.F.,2006.1dentification and immunologicalcharacterization of conserved Mycoplasma hyopneumoniae lipoproteins Mhp378 andMhp651. Vet. Microbiol. 116:85 - 95.)。未免兔血清作为阴性血清。1. 2 方法1. 2.1病料处理取疑似支原体肺炎病变肺脏，在超净台内用无菌手术剪刀剪取发病部位边缘组织，放入无菌平皿，将病肺组织剪成l_2mm3碎块，接种Friis肉汤，37°C培养，每日观察培养液的PH值变化。培养液变色时，取第一代经0. 45 ii m过滤器过滤的培养物0. 5ml接种到1.5ml含青霉素2000U/ml的Frris肉汤培养基中，37°C继续培养，培养基变黄后直接取培养物进行移植传代，如培养物变色，进行涂片，分别进行革兰氏染色和瑞氏染色，镜检。如革兰氏染色未发现细菌，同时瑞氏染色发现支原体样菌体时，取0. 2ml培养物涂布于Frris平板固体培养基表面，置37°C,5%C02条件下培养,姆日观察是否有支原体样菌落。取支原体样单个菌落接种于Friis肉汤，培养基颜色变黄后取0. 2ml培养物涂布于Frris平板固体培养基表面置37°C，5%C02条件下进行纯化培养，如此进行纯化培养2次。将最后一次纯化培养生长的支原体样菌落接种Frris液体培养基所得的颜色变黄培养物保存于_70°C备用。1. 2. 2菌落狄氏染色按參考文献进行(曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术[M].北京北京农业大学出版社.1992. 49 50，126 129，371 373.)，采用无菌方法从固体培养基上切下菌落，放到载玻片上，在两边垫上竹签，滴上狄氏染色液后再盖上ー块玻片，置于4°C染色30min后低倍镜下观察結果。1. 2. 3PCR鉴定及测序分析用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA模板。PCR引物參考文献进行合成IJ.Caron, M. Ouardani, and S.Dea.Diagnosis and Differentiation of Mycoplasmahyopneumoniae and Mycoplasma hyorhmis Infections in Pigs by PCR Amplificationof the p36 and p46Genes[J]. Journal of clinical microbiology, 2000，38(4):1390 1396 )。FSp36，5 ’-GGGCCGATGAAACCTATTAAAATAGCT-3’ Rsp36，5 ’-GCCGCGAAATTAAATATTTTTAATTGCATCCTG-3’，上海生工合成。PCR 反应体系超纯水 34.5 y IUOXPCR Buffer 5 u l.dNTP4ロ1、引物各2111、模板2111、TaqDNA聚合酶0.5 ill。按下列參数进行PCR反应预变性940C 3min ；94°C 30s，53°C退火 30s，72°C延伸 90s，35 个循环后；72°C终延伸 lOmin。扩增结束后取上述产物琼脂糖凝胶电泳检测。直接将有特异性条带的PCR产物及引物提交至上海生エ进行测序分析。1. 2. 4生化试验生化试验參考文献进行(曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术[M].北京北京农业大学出版社.1992. 49 50，126 129，371 373.)。主要进行洋地黄皂甙敏感性试验、尿素酶试验、葡萄糖分解试验、精氨酸水解试验、三苯基氯化四氮唑(TTC)还原试验、七叶甙水解试验、甘露醇分解试验、薄膜和斑点形成试验。1. 2. 5生长抑制试验(GIT)Friis平板接种0.1ml对数生长期的猪肺炎支原体培养物，将未稀释的抗血清25ul吸附于灭菌的6mm滤纸片，将吸有血清的滤纸片贴附于平板表面，培养至菌落可见。正常兔血清处理的纸片作为阴性对照。培养观察圆纸片周围有无菌落抑制环的产生。抑制宽度达2mm以上时判为猪肺炎支原体阳性。1. 2. 6分离菌株的致病性将分离菌株培养物经气管注射I 2周龄健康易感猪3头，每头5ml (HN0613,108CCU/ml)。另设3头条件相同的对照猪，各气管注射培养基5ml，作为对照。试验猪、对照猪隔离饲养。攻毒后按常规饲养，饲料中无抗生素。观察28日，每日测体温。注射28日后剖检，根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。试验组与对照组进行肺病变指数差异分析。对试验猪及对照猪按1. 2. 4进行猪肺炎支原体的分离，对分离株按1. 2. 3方法进行PCR鉴定。 2.结果2.1培养结果16份病料中仅有I份病料接种的培养基7日后变黄色，过滤接种后5日培养液变黄，培养液均匀混浊，转接于含青霉素的Friis培养基变色后，革兰氏染色未发现细菌，瑞氏染色发现支原体样菌体。转接于固体培养基后，菌落生长入培养基内部。菌落呈典型煎荷包蛋状，与支原体菌落形态相符，命名为HN0613株猪肺炎支原体。2. 2狄氏染色结果在低倍镜下观察到，在Friis固体培养基的猪肺炎支原体的菌落被染成不褪色的中心深蓝色菌落(參见附图1)，与支原体菌落染色特性相符。2. 3PCR 鉴定所提取的分离培养物模板经PCR扩增后，再经琼脂糖凝胶电泳检测，待检病料或培养物均在750bp IOOObp之间接近IOOObp的位置有一条带，与预期948bp相符(參见附图2，其中l.Marker DL 2000; 2.病料分离株HN0613; 3.致病性试验分离株；4.阴性对照)。2. 4序列测定与分析将所分离菌株PCR扩增产物测序与GenBank中进行blast比较。结果显示，HN0613分离菌株P36基因序列与NCBI中公布的Mhp P36基因序列相应序列同源性为98%以上。测序结果见SEQ ID Nq. 4。2. 5生化及血清学鉴定分离菌株生化反应与猪肺炎支原体生化特性相符(表I)。表1HN0613分离株生化及生长抑制试验结果表
权利要求
1.一种猪肺炎支原体，其特征在于，所述猪肺炎支原体为保藏号为CCTCC M2012230的猪肺炎支原体HN0613株。
2.一种预防或治疗猪支原体肺炎相关疾病的猪支原体肺炎疫苗，其特征在于，含有猪肺炎支原体HN0613株制备的猪肺炎支原体抗原。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述的猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体HN0613株，或含有猪肺炎支原体HN0613株的免疫原性氨基酸序列嵌合病毒，或任何其它含猪肺炎支原体HN0613株免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位抗原。
4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述的灭活的猪肺炎支原体HN0613株抗原的含量为I X IO7 I X IO9CXU/头份。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物还包括佐剂。
6.一种含猪肺炎支原体抗原的疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物含有猪肺炎支原体抗原，与以下猪病原体抗原的一种或几种的组合猪圆环病毒2型、猪流感病毒抗原、猪生殖呼吸综合征抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪波氏杆菌抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原。
7.一种预防和治疗猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体感染的疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物含有至少一种猪肺炎支原体抗原，和至少一种猪圆环病毒2型抗原。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物含有猪肺炎支原体HN0613株抗原和猪圆环病毒2型抗原。
9.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪肺炎支原体HN0613株抗原为灭活的猪肺炎支原体HN0613株，或含有猪肺炎支原体HN0613株的免疫原性氨基酸序列嵌合病毒，或任何其它含猪肺炎支原体HN0613株免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位抗原的任意一种或几种的组合。
10.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型抗原选自灭活的或活的猪圆环病毒2型2a、2b、2c或2d基因型的抗原的一种或几种的组合；猪圆环病毒2型的免疫原性氨基酸序列嵌合病毒，或任何其它含猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位抗原的任意一种或几种的组合。
11.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型2b基因型的抗原，或猪圆环病毒2型ORF2蛋白。
12.根据权利要求11所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型抗原为杆状病毒表达的PCV20RF2蛋白。
13.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型抗原的含量为 3 X IO5.0 Ixio8 0TCID50/ 头份。
14.根据权利要求13所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型抗原的含量为 IXIO6 ciTCID5q/ 头份。
15.根据权利要求11所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型的ORF2蛋白含量为2 20 μ g/头份。
16.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的所述的灭活的猪肺炎支原体HN0613株抗原含量为I X IO7 I X IO9CXU/头份。
17.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物还包括佐剂，所述佐剂的用量为5% 30%重量，所述的疫苗组合物中抗原成份的用量为70% 95%重量。
18.一种制备权利要求Γ17任意一项所述疫苗组合物的方法，其特征在于，为将猪肺炎支原体抗原、猪圆环病毒2型抗原浓缩并混合而获得的。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤将猪圆环病毒2型病毒液或PCV2 ORF2蛋白液与猪肺炎支原体菌液处理并浓缩后混合，然后将混合液与疫苗佐剂混合，以500转/分钟搅拌10分钟即获得疫苗组合物；优选地，所述猪圆环病毒2型病毒液为浓缩后配成疫苗，疫苗中猪圆环病毒2型含量为灭活前I X IO6 0TCID50/头份；所述的猪肺炎支原体菌液浓缩后配成疫苗，疫苗中猪肺炎支原体含量为灭活前I X IO8CCU/头份。
全文摘要
本发明提供一株经分离鉴定为免疫原性更好的猪肺炎支原体毒株HN0613株，还提供了上述猪肺炎支原体HN0613株制备的猪肺炎支原体抗原与含有该猪肺炎支原体抗原的猪支原体肺炎疫苗。本发明还提供了一种猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体的二联组合疫苗，包含PCV 2抗原(灭活的猪圆环病毒2型抗原或PCV2ＯＲＦ2蛋白)、灭活的猪肺炎支原体以及疫苗佐剂。本发明的组合疫苗，可起到打一针该疫苗即可预防猪圆环病毒病和猪支原体肺炎目的，对猪肺炎支原体感染的预防保护效果。
文档编号A61P31/20GK103031258SQ201210224389
公开日2013年4月10日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司