一株猪肺炎支原体菌株的制作方法
【专利摘要】一株猪肺炎支原体菌株，它涉及一株猪肺炎支原体菌株。它已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC?No.8096，保藏日期为2013年8月15日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号，它命名为猪肺炎支原体（Mycopasma?hyopneumoniae）HDZK-Mhp57。本发明中猪肺炎支原体HDZK-Mhp57，制备的无细胞培养基中活菌滴度高达1012CCU/mL；免疫原性好，肺炎病变减少率可达90%以上，可大大降低兽用生物制品的生成成本，可用于制备成预防用兽用生物制品或兽药，为研制猪支原体肺炎灭活疫苗、基因工程疫苗和猪肺炎支原体诊断试剂盒奠定了基础。
【专利说明】一株猪肺炎支原体菌株
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株猪肺炎支原体菌株。
【背景技术】
[0002]猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine, MPS),又称猪气喘病或猪地方流行性肺炎，MPS是一种慢性、接触性、非致命性的呼吸系统疾病，国内发病率达80%以上，该病即可影响猪群生产性能和增重及饲料报酬，又可继发感染其它传染病，是养猪业重点控制的传染病之一。猪支原体肺炎的病原体是猪肺炎支原体(Mycopasma hyopneumoniae,Mhp)，可通过病猪与健康猪直接接触或通过气溶胶传播，一般传播距离可达到4.7km，最新研究发现其传播距离可远至9.2km,因此，Mhp极难防控。猪感染Mhp后会出现呼吸困难、机体消瘦、免疫抑制等。
[0003]猪肺炎支原体是软皮纲、支原体目、支原体科、支原体属、猪肺炎支原体种。Mhp无细胞壁，具有高度多形性，大小不等，在液体培养物和肺触片中常呈球状，直径约
0.2-0.5 μ m,并由小球状串连成环状,直径约0.8-20 μ m,偶有新月状、长链状和丝状。猪肺炎支原体体外培养对生长条件要求苛刻，营养要求高且生长速度缓慢，分离过程中受猪的其他支原体(如猪鼻支原体)的影响，导致猪肺炎支原体分离筛选难度较大。
【发明内容】
[0004]本发明目的是提供一株猪肺炎支原体菌株。
[0005]一株猪肺炎支`原体菌株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.8096，保藏日期为2013年8月15日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路I号院3号，它命名为猪肺炎支原体(Mycopasma hyopneumoniae) HDZK_Mhp57。
[0006]猪肺炎支原体(Mycopasma hyopneumoniae) HDZK_Mhp57,它的菌落形态为典型的支原体煎荷包蛋形菌落；生理生化特征:葡萄糖反应阳性、甘露糖反应阳性、精氨酸反应阴性、尿素酶反应阴性、抗血清抑制生长实验阳性、荧光抗体实验为阳性。
[0007]猪肺炎支原体(Mycopasma hyopneumoniae) HDZK_Mhp57的分子生物学鉴定结果:其16S rRNA序列与NCBI中公布的相近种属的猪肺炎支原体HN0613的同源性为98%，为一新支原体菌株。
[0008]本发明一株猪肺炎支原体菌株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.8096，保藏日期为2013年8月15日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路I号院3号，它命名为猪肺炎支原体(Mycopasma hyopneumoniae)HDZK_Mhp57。
[0009]本发明中猪肺炎支原体(Mycopasma hyopneumoniae) HDZK_Mhp57,制备的无细胞培养基中活菌滴度高达1012(XU/mL ;免疫原性好，肺炎病变减少率可达90%以上，可大大降低兽用生物制品的生成成本。猪肺炎支原体(Mycopasma hyopneumoniae)HDZK_Mhp57可用于制备成预防用兽用生物制品或兽药，为研制猪支原体肺炎灭活疫苗、基因工程疫苗和猪肺炎支原体诊断试剂盒奠定了基础。【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为【具体实施方式】中的荧光抗体试验结果图。
【具体实施方式】
[0011]【具体实施方式】一:本实施方式一株猪肺炎支原体菌株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.8096，保藏日期为2013年8月15日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路I号院3号，它命名为猪肺炎支原体(Mycopasmahyopneumoniae) HDZK_Mhp570
[0012]本实施方式中一株猪肺炎支原体菌株，它的分离过程如下:
[0013]一、取支原体肺炎病变肺脏，在超净台内用无菌手术剪刀剪取发病部位边缘组织，放入无菌平皿，将病变肺脏组织剪成小块，接种Friis肉汤，37°C培养至培养液变色；
[0014]二、培养液变色后，取0.5mL经0.45 μ m滤器过滤的培养物加入到1.5mL加了青霉素的Friis肉汤培养液中，37°C培养；
[0015]三、每隔一周传代一次，前两周要在培养液中加入50%的猪鼻支原体特异性血清，传至第九周对培养物进行稀释涂板，筛选单落，重复三次后保存菌株。
[0016]鉴定按以下步骤:
[0017]一、镜检
[0018]Friis平板接种培养物，37°C培养；挑取单菌落涂片，分别进行革兰氏染色和瑞氏染色，镜检；
`[0019]结果:
[0020]病变组织接种到Friis培养液中，6d后培养液变色；过滤接种后在5_6d后培养液变为黄色；接种到平板37°C培养6-7d后出现典型的支原体煎荷包蛋形菌落。
[0021]革兰氏染色未发现细菌，瑞氏染色法发现支原体菌体。
[0022]二、生化试验
[0023]尿素酶试验:从Friis平板中挑取菌株，接种到尿素培养基中，37°C培养，24h后观察，如为阴性则继续培养至四日做最终判断。
[0024]葡萄糖分解试验:从Friis平板中挑取菌株，接种于含葡萄糖的液体培养基中培养，观察颜色变化。
[0025]精氨酸水解试验:从Friis平板中挑取菌株，接种于含精氨酸及酚红指示剂的液体培养基中培养，观察颜色变化。
[0026]甘露糖分解试验:从Friis平板中挑取菌株，接种于含甘露糖的液体培养基中培养，观察颜色变化。
[0027]结果:
[0028]葡萄糖反应阳性、甘露糖反应阳性、精氨酸反应阴性、尿素酶反应阴性。
[0029]三、生长抑制试验
[0030]Friis平板接种培养物，将未稀释的抗血清吸附于灭菌的滤纸片，将吸有血清的滤纸片贴附于平板表面，37°C培养至菌落可见；同时，以正常血清处理的滤纸片做对照。
[0031]结果:[0032]在吸有抗血清的滤纸片周围形成了直径约为200mm的抑菌圈，而正常血清处理的滤纸片无抑菌圈。
[0033]四、荧光抗体试验
[0034]取培养液涂片，自然干燥后丙酮固定IOmin ;之后，用PBS轻轻漂洗数次，滴加猪肺炎支原体荧光抗体，放入湿盒中37°C感作30min，PBS冲洗，半干时在荧光显微镜下观察。
[0035]结果:如图1所示，荧光抗体试验结果为阳性。
[0036]分子生物学鉴定结果:其16S rRNA序列与NCBI中公布的相近种属的猪肺炎支原体HN0613的同源性为98%，为一新支原体菌株，命名为猪肺炎支原体(Mycopasmahyopneumoniae) HDZK_Mhp570
[0037]猪肺炎支原体(Mycopasma hyopneumoniae) HDZK_Mhp57,制备的无细胞培养基中活菌滴度高达1012(XU/mL ;免疫原性好，肺炎病变减少率可达90%以上，可大大降低兽用生物制品的生成成本。猪肺炎支原体(Mycopasma hyopneumoniae)HDZK_Mhp57可用于制备成预防用兽用生物制品或兽 药。
【权利要求】
1.一株猪肺炎支原体菌株，其特征在于它已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.8096，保藏日期为2013年8月15日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路I号院3号，它命名为猪肺炎支原体(Mycopasma hyopneumoniae)HDZK- Mhp57。
【文档编号】C12R1/35GK103484414SQ201310498958
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】赵凯, 刘洪斌, 张凤强, 毛春玲 申请人:黑龙江大学