专利名称：单剂量猪肺炎支原体疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过对约3至10日龄动物施以单剂有效量猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)(M.hyo)疫苗来治疗或预防由猪肺炎支原体感染所致动物疾病或病症的方法。所述猪肺炎支原体疫苗可以是完全或部分灭活细胞或改良活体制剂、亚单位疫苗、或核酸或DNA疫苗。根据本发明施用的猪肺炎支原体疫苗可用合成或重组方法制备。
背景技术：
猪肺炎支原体(M.hyo)是一种能引发猪地方性动物肺炎的细菌病原体。地方性动物肺炎是导致下列症状的慢性疾病食物转化不良、发育障碍及继发性肺部感染易感性。猪肺炎支原体很容易通过呼吸道分泌物以及通过母猪-猪仔传递而进行传播，并在猪场中大规模流行。美国约有99％的猪群被感染，养猪业每年因此耗费约3亿美元。
已知的抵御猪肺炎支原体的疫苗大多数都是基于含佐剂的猪肺炎支原体全细胞灭活制剂。此外，基于免疫原性多肽或蛋白质的疫苗可以通过猪肺炎支原体基因的克隆和重组表达的方法进行合成或制备。能够在体内表达所述多肽或蛋白质的猪肺炎支原体基因也可用作疫苗。
全细胞灭活猪肺炎支原体疫苗的例子包括RESPISURE和STELLAMUNE，其均可从美国辉瑞公司获得。
另外，一些重组制备的可用作亚单位疫苗的猪肺炎支原体免疫原性多肽和蛋白质在本领域中已有描述。公开号为WO96/28472的国际专利申请中描述了6种猪肺炎支原体蛋白抗原，其分子量分别为46-48、52-54、60-64、72-75、90-94和110-114kDa，而且公开了分子量为52-54、60-64和72-75kDa的抗原的部分蛋白质序列以及分子量为46-48kDa的抗原的全长核苷酸序列和氨基酸序列。
编码猪肺炎支原体蛋白质P46的基因，即p46，也已经被Futo等人克隆(1995；J.Bacteriol 1771915-1917)。该小组的研究表明体外表达的基因产物可用于诊断猪肺炎支原体感染的抗体免疫应答而不与其他种类的支原体发生交叉反应(Futo等，1995；J.Clin.Microbiol.33680-683)。Futo等人描述的p46基因的序列和诊断用途进一步公开于欧洲专利0475185A1。
Wise和Kim(1987，J.Bacteriol.，1695546-5555)报道了名为p70、p65(P65，同上)、p50和p44的4种猪肺炎支原体膜整合蛋白质，后3种经共价脂连接而被修饰，可诱导强的体液免疫应答。对该免疫应答的保护效果未做研究。编码P65蛋白质的基因也已克隆，其序列和在疫苗及诊断中的用途已描述于美国专利5,788,962。
国际专利申请WO91/15593公开了猪肺炎支原体的5种蛋白质，其表观分子量分别为150、90、85、70和43kDa。其中提供了编码85kDa蛋白质(蛋白质C)的编码基因的全长序列，以及编码其他4种蛋白质的部分核苷酸序列。
Faulds的美国专利US5,252,328公开了免疫反应性猪肺炎支原体蛋白质的氨基末端序列，其分子量为36、41、44、48、64、68、74.5、79、88.5、96和121kDa。其他根据电泳迁移率鉴定的而未公开蛋白质序列的蛋白质的表观分子量为22.5、34和52kDa。尽管US5,252,328提及这些蛋白质可用于疫苗制剂，但未报道任何疫苗实验结果。
国际专利申请WO 95/09870公开了纯化猪肺炎支原体粘附素的生化方法，所述粘附素是支原体的膜整合蛋白，负责粘附到宿主的上呼吸道上皮细胞的纤毛上。WO 95/09870也建议了这些蛋白质的测试方法及用途，例如在疫苗和诊断方面的用途。
King等人的研究论文(1997；Vaccine 1525-35)公开的分子量为124kDa的粘附素Mhpl是P97的一个菌株变体。
Wilton等人(1998，Microbiology 1441931-1943)测定出了P97的一种94kDa变体。此外，研究表明p97基因是还编码名为P102的第二种蛋白质的操纵子的一部分，该第二种蛋白质的推测分子量约102kDa(Hsu等，1998，Gene 21413-23)。Minion和Hsu在国际专利申请WO 99/26664中提出P102可用于疫苗，但未报道疫苗实验。
没有任何一种已知的猪肺炎支原体疫苗被报道在对大约3-10日龄的猪施以单剂量治疗时是有效的。这样的疫苗将消除对多剂量的需求，并因此大大减少世界范围内猪群大规模接种疫苗相关的费用和劳动力。因此需要一种对约3至10日龄猪施以单剂量疫苗接种以有效地保护和预防由猪肺炎支原体感染所致疾病或病症的猪肺炎支原体疫苗。
发明概述本发明提供一种治疗或预防由猪肺炎支原体感染所致动物疾病或病症的方法，所述方法包括对约3至10日龄动物施以单剂有效量的猪肺炎支原体疫苗。
本发明方法可消除对额外剂量的需求，所述额外剂量旨在产生或维持抵御猪肺炎支原体的免疫力。本发明的单疫苗接种方法能为血清反应阴性和血清反应阳性的猪提供抵御毒性猪肺炎支原体的保护。本发明方法能有效地治疗或预防由猪肺炎支原体感染导致的症状，例如预防和减轻猪肺的病灶。
本发明方法包括对猪施以单剂有效量的猪肺炎支原体疫苗，所述疫苗包含完全或部分细胞制剂(如菌菌或改良活体制剂)，亚单位疫苗，例如这样一种亚单位疫苗，其包含一个或多个猪肺炎支原体衍生多肽或蛋白质或者所述多肽或蛋白质的免疫原性片段，或编码所述多肽、蛋白质或免疫原性片段的一个或多个猪肺炎支原体基因，所述基因或核酸能在体内进行表达。猪肺炎支原体疫苗中提供的猪肺炎支原体多肽、蛋白质及其免疫原性片段和基因或核酸可以用本领域公知技术来合成或重组制备。
根据本发明施用的猪肺炎支原体疫苗可包括附加成分，如佐剂。可以使用的多种佐剂包括那些此处描述的以及本领域公知的。
发明详述本发明包括一种治疗或预防由猪肺炎支原体感染所致动物疾病或病症的方法，所述方法包括对约3至10日龄动物施以单剂有效量猪肺炎支原体疫苗。
本发明的单剂疫苗接种方法可消除对猪施用额外剂量的需求，该额外剂量旨在产生和/或维持抵御猪肺炎支原体的免疫力。
为清楚公开，并且非限制性的，对本发明的详细描述将分成如下几个部分，各部分描述或说明某些特征、实施例或发明的应用。
某些实施例中，本发明方法中所使用的疫苗包括部分或全细胞猪肺炎支原体灭活制剂(菌苗)或改良活体疫苗以及药物学上可接受的载体，或者部分或全细胞猪肺炎支原体灭活制剂(菌苗)或改良活体疫苗以及佐剂。
在其他一些具体实施例中，本发明的方法中所使用的疫苗包括免疫原性蛋白质或多肽或其片段以及药物学上可接受的载体，或者免疫原性蛋白质或多肽或其片段以及佐剂。
定义及缩写术语“治疗或预防”在涉及猪肺炎支原体感染时是指抑制猪肺炎支原体细菌的复制、抑制猪肺炎支原体的传播、或防止猪肺炎支原体在其宿主体内定居，以及减轻猪肺炎支原体感染所致疾病或病症的症状。如果细菌荷载量减少、肺部感染减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
术语“猪肺炎支原体疫苗”是指能够用于预防或治疗由猪肺炎支原体感染所致病症或疾病的疫苗，该疫苗可包括任何能够有效治疗或预防猪受猪肺炎支原体感染的疫苗。能够用于本发明的猪肺炎支原体疫苗包括，例如，完全或部分猪肺炎支原体细胞制剂、灭活或改良活体疫苗、亚单位疫苗，所述亚单位疫苗含有一个或多个猪肺炎支原体衍生的多肽或蛋白质或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段、或者编码一个或多个猪肺炎支原体衍生多肽或蛋白质、或其免疫原性片段的一个或多个猪肺炎支原体基因或核酸，且所述基因或核酸能够在猪体内表达。猪肺炎支原体多肽、蛋白质、所述多肽和蛋白质的免疫原性片段、或猪肺炎支原体基因或核酸可用本领域公知技术合成或重组制备。优选的，本发明的方法使用的猪肺炎支原体疫苗为菌苗。
术语“动物”是指全部非人类动物，包括哺乳动物。
术语“猪”是指小猪(piglets)，swine，pigs，porcine，大母猪(sows)，小母猪(gilts)，barrows，公猪(boars)以及猪科的成员。
优选地，本发明的方法施用于非人类哺乳动物，最优选的，猪。
术语“菌苗”是指适用于疫苗用途的灭活的完全或部分猪肺炎支原体细胞制剂。
术语“有效量”是指足以在其施用的受试者体内激发产生免疫应答的猪肺炎支原体疫苗的量。所述免疫应答可以包括但不限于，内在的、细胞的和/或体液的免疫的诱导。
灭活(部分或全细胞)及改良活体疫苗用于本发明方法的传统灭活或改良活体疫苗的制备方法是本领域公知的。
本发明所述的单剂量疫苗接种方法所施用的猪肺炎支原体菌苗可获自多种公众可用的来源。例如，猪肺炎支原体菌苗可从猪肺炎支原体分离物中制取。猪肺炎支原体的很多分离物对本领域普通技术人员来说均为熟知的并可获自，例如美国典型培养物保藏中心，10801Boulevard大学，马纳萨斯(Manassas)，VA 20110-2209。包括例如ATTC序号为25095，25617，25934，27714和27715。
猪肺炎支原体分离物还可用已知技术直接获自自然或实验感染的猪的肺损伤组织。
猪肺炎支原体分离物可用多种已知方法进行灭活，例如，用美国专利5,565,205中公开的二元吖丙啶(BEI)处理细菌分离物、或用如福尔马林、热、BPL、放射或戊二醛进行灭活。
适用于本发明方法的猪肺炎支原体菌苗还可获自多种商业来源。该来源包括但不限于RESPIFEND(Fort Dodge，美国家庭用品公司)，HYORESP(梅里亚公司)，M+PAC(先灵葆雅公司)，PROSYSTEM M(Intervet)，INGLEVAC M(Boehringer)，RESPISURE(辉瑞公司)，和STELLAMUNE MYCOPLASMA(辉瑞公司)。
用于本发明方法的优选的猪肺炎支原体菌苗来源为RESPISURE和STELLAMUNE MYCOPLASMA。
用于本发明方法的特别优选的猪肺炎支原体菌苗来源为RESPISURE-1(辉瑞公司)，包含株系P-5722-3(NL1042)，获自美国普度大学。
优选地，P-5722-3株用BEI灭活并且选用商业可获得的佐剂，优选AMPHIGEN(Hydronics，美国)使其佐剂化。优选剂量为2.0ml。常用防腐剂包括硫柳汞/EDTA。可以加入载体，优选为PBS。制备改良活体疫苗的方法，如经培养传代以减低毒株的毒性，是本领域熟知的。
亚单位疫苗本发明方法的实施可以使用含有纯化的猪肺炎支原体免疫原性蛋白质，多肽及所述蛋白和多肽的免疫原性片段。所述蛋白质和多肽可以用本领域公知技术进行制备。另外，可以采用本领域技术人员所熟知的方法测定蛋白质纯度或均质性，例如，先对样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后再观测染色凝胶上的单个多肽条带。可以使用HPLC或其他本领域熟知的相似方法进行更高的分辨率测定。
在一个具体的实施例中，用于本发明的疫苗包含至少一种猪肺炎支原体蛋白质，如，但不限于，P46，P65，P97，P102，P70，P50和P44。
在另一个实施例中，用于本发明方法的疫苗包含猪肺炎支原体菌苗(灭活的完全或部分细胞或改良活体)或猪肺炎支原体蛋白质或多肽或其免疫原性片段和至少另外一种免疫原(灭活的完全或部分细胞或改良活体)或免疫原性或抗原性蛋白质、多肽或其免疫原性片段，优选为病毒、细菌或寄生虫多肽。所述另外的病原和蛋白质、多肽或其免疫原性片段包括，但不限于猪流感病毒(SIV)，猪生殖和呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory disease virus，PRRS或神秘猪病(mystery swine disease))，断奶后腹泻(post-weaning diarrhea，PWD)和猪增生性肠炎(porcineproliferative enteritis，PPE)。该组合物作为联合疫苗是有益的。
在另一个具体的实施例中，所述蛋白质或多肽的免疫原性片段含有用于本发明方法的免疫原性蛋白质和多肽(包括但不限于P46，P65，P97，P102，P70，P50和P44)中至少10、至少20、至少30、至少40、至少50或至少100个连续氨基酸。
此外，用于疫苗的猪肺炎支原体蛋白为基本纯化的或均质的。本发明方法所采用的蛋白质或多肽一般是从表达编码这些蛋白质的重组核苷酸的宿主细胞中纯化得来的。所述蛋白质的纯化可通过本领域熟知的多种方法实施。参见，比如，“Methods in Enzymology”，AcademicPress，Inc.，San Diego，″蛋白质纯化原理和方法″，1982，Springer-Verlag，New York中所述的技术。
纯化的猪肺炎支原体多肽和蛋白质以及其免疫原性片段还可用已知的合成方法来制备。
疫苗制剂用于本发明的疫苗的合适制剂包括可注射的液体溶液或悬浮液；也可以是在注射前适合溶于或悬浮于液体中的固体形式。也可以制成乳化剂。所述活性免疫原成分常与药物学上可接受并能与该活性成分匹配的佐剂相混合。
可以将所述多肽配制成中性或盐类的疫苗形式。药物学上可接受的盐类包括酸加成盐(与所述肽游离氨基基团形成的)以及与无机酸形成的盐类，所述无机酸如，盐酸或磷酸，或与乙酸、草酸、酒石酸、马来酸等有机酸形成的盐。与游离的羧基形成的盐类也可以衍生自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、或氢氧化三铁等无机碱，以及异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等有机碱。
本发明所述的疫苗制剂含有免疫有效量的猪肺炎支原体免疫原和药物学上可接受的载体。疫苗制剂包含免疫有效量的一种或多种抗原以及药物学上可接受的载体。药物学上可接受的载体是本领域所熟知的，包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、无菌的等渗含水缓冲液及其组合。这种可接受载体的一个实例是含有一种或多种稳定剂的生理平衡培养基，所述稳定剂如稳定的水解蛋白、乳糖等。优选该载体是无菌的。制剂形式应该适合所述的施用方式。
可以用标准方法将纯化后的抗原用于疫苗制剂。例如应该将所述纯化蛋白质调整到一合适的浓度，配以任一合适的疫苗佐剂并包装。合适的佐剂包括，但不限于矿物凝胶，例如氢氧化铝；表面活性剂，例如溶血卵磷脂；糖甙，例如皂甙和Quil A或GPI-0100等皂甙衍生物；阳离子表面活性剂，例如DDA(quaternary hydrocarbon ammoniumhalogenide；Pluronic多元醇；聚阴离子和多原子离子；聚丙烯酸，非离子嵌段多聚物，例如Pluronic F-127(B.A.S.F.，USA)；Avridine和Rantidine；肽；重组突变不稳定毒素，例如白细胞毒素(rmLT)或霍乱毒素(CT)；化学结合或近分子转运体(chemically bound orclose proximity molecular transporters)；矿物油，例如MontanideISA-50(Seppic，Paris，France)；聚羧乙烯，Amphigen(Hydronics，美国)，Omaha，NE.美国，Alhydrogel，(Superfos Bisector，Frederikssund，Denmark)油类乳状液(oil emulsions)，例如BayolF/Arlacel A等矿物油与水的乳状液，或者植物油、水和乳化剂如卵磷脂的乳状液；明矶，MDP，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr MDP)，N-乙酰-去甲(nor)-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺；胆固醇细胞因子及佐剂的组合物。多原子离子可作为分散剂、增稠剂、抗结块剂，从而使疫苗在延长的沉淀期后重悬为单分散悬液。佐剂组合物可以是水剂，胶囊(控释或缓释)或微胶囊等形式。
也可以将所述免疫原引入到脂质体中，或者偶联到多糖和/或其它可用于疫苗制剂的聚合物上。当重组抗原是一种半抗原，即具有抗原性因而能与相关抗体选择性反应，但不具有免疫原性因而不能激发免疫应答的分子时，可以将所述半抗原共价偶联到一种载体或免疫原性分子上；例如，血清白蛋白等大分子蛋白可赋予与其偶联的半抗原免疫原性。可以配制所述半抗原-载体用作疫苗。
基因和核酸疫苗本发明可以使用编码免疫原性蛋白，多肽及所述蛋白质和多肽的免疫原性片段的猪肺炎支原体基因或核酸。该基因和核酸可在体内表达而且可以用本领域熟知方法进行制备。
在一个具体实施例中，用于本发明的疫苗包含至少一种基因或核酸，所述基因或核酸编码猪肺炎支原体蛋白，例如，但不限于，P46，P65，P97，P102，P70，P50和P44。
在另一个具体实施例中，本发明中使用的基因或核酸编码猪肺炎支原体蛋白或多肽的免疫原性片段，所述免疫原性片段含有本发明中所采用的免疫原性蛋白和多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、或至少100连续氨基酸，所述免疫原性蛋白或多肽包括，但不限于P46，P65，P97，P102，P70，P50和P44。
在本发明方法的另一些实施例中，基因或核酸用本领域熟知方法来施用，例如，使用基因枪。
在本发明方法的另一些实施例中，所使用的基因或核酸为DNA疫苗。此外，该核酸或基因可与脂质体或本领域熟知的其它促进转染的因子联合使用。
用于制备和传递DNA疫苗的方法是本领域熟知的。参见，例如，Krishnan，B.R，“DNA疫苗在兽医学中的现状”Advanced Drug DeliveryReviews，Elsevier Science(2000)。
表达系统可以用多种的宿主表达载体系统来表达本发明所述的抗原性蛋白质序列。这类宿主表达系统可以是目的编码序列可以从中产生并随后纯化的载体，也可以是当用合适的核苷酸编码序列转化或转染后能够在原位展示出本发明的猪肺炎支原体基因产物的细胞。这些包括但不限于微生物，例如用含有mhp3编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌、枯草芽胞杆菌)；用含有猪肺炎支原体基因产物编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，糖酵母、毕赤氏酵母)；用含有猪肺炎支原体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有猪肺炎支原体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者用含有取自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒启动子(如腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体转化的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、3T3)。在一个优选实施例中，所述表达载体是细菌系统。
猪肺炎支原体多肽和蛋白质及其免疫原性片段还可用活体重组病毒和细菌载体比如腺病毒或沙门氏菌。实际使用的载体也是本领域熟知且容易获得的或可由本领域技术人员使用本领域熟知方法构建。
剂量和施用方法根据本发明，对约3-10日龄的猪施以单剂有效量的猪肺炎支原体可提供抵御随后猪肺炎支原体攻击的有效免疫力。优选的，对约6-约8日龄的猪施以猪肺炎支原体疫苗。最为优选的，对约7日龄的猪施以猪肺炎支原体疫苗。
单次剂量实施中猪肺炎支原体菌苗疫苗的有效剂量为每剂中包含约1×106至约5×1010变色单位(color changing unit)(CCU)。优选的，能提供有效免疫力的猪肺炎支原体菌苗疫苗单剂包含1×108至约5×1010CCU及更优选的，约5×108至5×1010CCU。
根据本发明，当使用优选的菌苗产品RESPISURE-1时，单剂施用RESPISURE-1的量为约0.5-3.0ml，优选的约1.5ml至约2.5ml，更优选的，约2ml。
本发明包含一个或多个蛋白或多肽或所述蛋白或多肽的免疫原性片段的猪肺炎支原体亚单位疫苗的有效量为约0.01μg至约200μg。
本发明包含一个或多个编码免疫原性蛋白或多肽或所述蛋白或多肽的免疫原性片段的猪肺炎支原体基因或核酸(优选DNA)的猪肺炎支原体疫苗的有效量为约0.1μg至约200mg。
根据本发明，疫苗的施用可以采用本领域所熟知的途径，包括口腔、皮内、肌内、粘膜局部、经皮和肠胃外(例如，静脉内的，腹膜内的，皮内的，皮下，肌肉内)。还可以使用无针头的传递装置进行施用。施用还可以通过联合途径完成，如，首次施用采用肠胃外途径，随后的施用采用粘膜途径。优选的施用途径为肌内施用。
本发明疫苗的有效剂量(免疫剂量)还可以根据模型测试系统中的剂量-反应曲线中推出。
本发明接种疫苗的方法为血清反应阳性和血清反应阴性的小猪均可提供针对猪肺炎支原体的保护性免疫力。血清反应阳性的小猪是指血清中含有抗猪肺炎支原体抗体的小猪。血清反应阴性的小猪是指血清中不含可检测水平的抗猪肺炎支原体抗体的小猪。
本发明进一步描述于，但不限于，下列实施例中。
实施例1猪肺炎支原体菌苗的制备猪肺炎支原体NL1042株用二元吖丙啶(BEI))进行灭活。
在生长期末，将培养物的pH调高至7.8±0.2，并保持pH在此范围内至少一小时。在此期间，加入经滤过灭菌处理的2-溴乙基铵氢溴酸盐(2-BromoEthylAminehydrobromide)(BEA)水溶液至终浓度约4.0mM。在提高的pH下，BEA会化学转化为BEI。培养物于37±2℃下持续搅拌温育至少24小时。
温育24小时后，加入经滤过灭菌处理的硫代硫酸钠水溶液至终浓度约4mM以中和过剩的BEI。再将培养物于37±2℃下持续搅拌温育24小时。
灭活后，但在用硫代硫酸钠中和前，取样品并检测灭活完成情况。将含有0.0026％酚红的新培养基用5-20％接种体接种，并在检测颜色改变前在37±2℃下至少孵育一周，所述颜色改变为灭活失败的表现。大量样本在37±2℃的巯基醋酸盐培养液中，和室温下的胰胨豆胨培养液中，检测无菌状态。灭活的培养物移入灭菌储存容器中并在组装前保存于2-8℃下。
通过体外血清学实验定量最终容器中的抗原以测定效价。用于功效研究中的疫苗效价决定了在失效期时疫苗所必须表现的最小活性。
每一系列或第一亚系的完成产品的整体或最终容器样品用下述方法进行猪肺炎支原体的检测。
菌苗保存于-50℃的100ml的小瓶。小瓶解冻后，等分为15ml并在使用前保存于5+/-2℃。
为检测组装系列的效价，该组装系列的一个样本与参照物进行比较，并确定这一组装系列的RP单位值。组装系列或组装亚系在起始时优选包含至少6.33RP，并且在整个期间至少为5.06RP。
RP指的是相对效价。可以用与参照疫苗相比较的相对抗原量来测定RP值。在本申请中，将参照疫苗RP值确定为1。本发明单剂量产品优选具有6.33RP值，即为参照疫苗的6.33倍。
加入硫柳汞(Merthiolate)作为防腐剂，终浓度不要超过0.01％(w/v)。
加入10％乙二胺四乙酸(EDTA，二钠盐或四钠盐)溶液作为防腐剂，终浓度大约为0.07％(w/v)。
实施例2动物大约1周龄的猪被选用以接种疫苗。其猪肺炎支原体血清状况用ELISA实验进行测定。ELISA值≤0.50的猪为猪肺炎支原体阴性。ELISA值大于0.50的猪为猪肺炎支原体血清阳性。
疫苗猪肺炎支原体菌苗RESPISURE-1(辉瑞公司)用来给猪免疫接种。使用该疫苗前，用与参照猪肺炎支原体菌苗相比较的相对抗原量来确定其效价。参照疫苗(RP＝1.0)每剂量包含大约8000单位的抗原(在灭活前收获的存活细胞的大约1-2×108CCU)，用能测定疫苗中猪肺炎支原体抗原的固相免疫实验对其进行检测。
在制备RESPISURE-1中使用的同一液体佐剂(AMPHIGEN)用作安慰剂(即，没有细菌细胞。)攻击接种体(challenge inoculum)以10ml均分的肺组织匀浆形式提供的攻击接种体，冻于-70℃，并被视为猪肺炎支原体株11(L1 36)的衍生物。解冻该接种体并用Friis Mycoplasma Broth稀释为1∶25的稀释液，并在接种前保持冰浴。每只猪在以下每个实施例中的特定日时经鼻接受5ml的剂量(每个鼻孔2.5ml的1∶25悬液)。攻击的每一天，肺接种体的一等份要进行培育以确定不存在细菌的感染。其后在三天中的每一天，用滴定法测定第二等分，结果显示了接种体包含大约106-107变色单位(CCU)的猪肺炎支原体。
实验步骤猪在母猪体上时即用耳部标记进行识别[(-1)天]。该猪按照普遍随机分组法被分配至围栏中和治疗组中。猪的分组是基于窝和断奶围栏进行的。
在第0天，猪经肌内接种2ml剂量的猪肺炎支原体菌苗RESPISURE-1(辉瑞公司)，或经肌内接种2ml剂量的安慰剂。每只猪在以下每个实施例中的特定日时经鼻接受5ml剂量的1∶25悬液。全部猪每天都要监测和检查疾病的临床症状。
在攻击第1天后的特定时间，无痛处死全部猪并作尸检。取出肺并进行评测。尸检测定包括评估支原体呼吸系统疾病相关的病理程度。
每一片肺叶都要检测，并画出病灶的草图以评估其占每片肺叶的百分比。并记录总的病灶程度。
数据分析根据猪肺炎支原体感染的典型肺病灶百分比来评估功效。治疗组(接种组)中猪的全部肺病灶的百分比显著(P≤0.05)小于安慰剂组中的猪。
总病变肺百分率每片肺叶的百分数用下面的单个肺叶与肺总质量的比例来加权平均左头叶10％，左中叶10％，左尾叶25％。右头叶10％，右中叶10％，右尾叶25％，其他为10％。然后将加权的肺叶值相加即可得出总病变肺百分率(Pointon等，1992)。
实施例3评测猪抵御毒性猪肺炎支原体攻击的保护作用，所述猪为于3-8日龄施以单剂量猪肺炎支原体菌苗RESPISURE-1(辉瑞公司)的猪肺炎支原体血清型阳性的猪。
在疫苗接种时或其前后，对RESPISURE-1进行五个复制效价测定实验。用与疫苗参照物相比的相对抗原量来测定相对效价(RP)。疫苗参照物的RP＝1.0，包含大约8000单位的猪肺炎支原体抗原。五项实验的RP值分别为5.42，3.96，4.71，5.49和4.36。
第0天，T02治疗组中的猪(见下面表1)经肌内接种剂量为2ml的猪肺炎支原体菌苗RESPISURE-1(辉瑞公司)。T01组中的猪经肌内接种剂量为2ml的安慰剂。在第178，179和180天，每只猪均经鼻接种剂量为5ml的1∶25的攻击接种体悬液。这三天中的每一天，在接种时培养一等份攻击物，以确定不含细菌污染。第二等份用反滴定法来确定攻击储存物中包含大约107CCU/ml的猪肺炎支原体。所有的猪每日都要进行检测并检查疾病的临床症状。
攻击第一天后30天，无痛处死全部猪并作尸检。将肺取出并进行评估。尸检测定包括评估支原体呼吸系统疾病相关的病理程度。每一片肺叶都要检测，并画出病灶的草图以评估其占每片肺叶的百分比。并记录总的病灶百分数。
表1治疗组接种物数量接种后0天第178天1攻击第179天1攻击第180天1攻击T01 安慰剂26 26 2626 26T02 疫苗 26 26 2422232231毒性猪肺炎支原体接种体271和73号猪由于丢失耳部标记而在攻击前从研究中除去，因为这些猪会导致无法确定每只动物的身份。36号猪由于麻醉并发症在第178天死亡。31号猪由于麻醉并发症在第179天死亡。
表2中总结了肺病灶结果。该结果显示疫苗接种的猪(T02)的肺炎所致肺病灶的最小均方值显著(P＝0.0385)低于给予安慰剂的猪(T01)(2.0对4.5％)。
表2.总病变肺百分率的总结治疗组化合物猪的数量最小均方值范围T01 安慰剂26 4.5a0-36.75T02 疫苗 22 2.0b0-13.75a，b不同的上标值具有显著的统计学意义(P＝0.0385)。
该结果显示，将猪肺炎支原体菌苗RESPISURE-1给予大约1周龄的猪单疫苗接种，可诱导出其对随后毒性猪肺炎支原体攻击的抵抗力。
实施例4评测猪抵御毒性猪肺炎支原体攻击的保护作用，所述猪为于3-8日龄施以单剂量猪肺炎支原体菌苗RESPISURE-1的猪肺炎支原体血清型阴性的猪。
在疫苗接种时或其前后，进行针对疫苗的五项复制效价实验。用与疫苗参照物相比的相对抗原量来测定RP。疫苗参照物的RP＝1.0，包含大约8000单位的猪肺炎支原体抗原。五项实验的RP值分别为5.42，3.96，4.71，5.49和4.36。
第0天，T02治疗组中的猪经肌内接种剂量为2ml的猪肺炎支原体菌苗RESPISURE-1。T01组中的猪经肌内接种剂量为2ml的安慰剂。在第173，174和175天，每只猪均经鼻接种剂量为5ml的1∶25的攻击接种体悬液。这三天的每一天中，在接种时培养一等份攻击物，以确定不存在细菌污染。第二等份用反滴定法来确定攻击储存物中包含大约106CCU/ml的猪肺炎支原体。所有的猪每日都要进行检测并检查疾病的临床症状。
攻击第一天后29天，无痛处死全部猪并作尸检。将肺取出并进行评估。尸检测定包括评估支原体呼吸系统疾病相关的病理程度。每一片肺叶都要检测，并画出病灶的草图以评估每叶相加的总百分比。并记录总的病灶程度。
表3治疗组接种物数量接种后0天 第173天1攻击第174天1攻击第175天1攻击T01 安慰剂26 2625224424T02 疫苗 26 26233205201毒性猪肺炎支原体2123号猪由于慢性脓毒性多关节炎而在第19天被无痛处死。
3222号猪于第40天死亡。尸检发现大量心包积液和心外膜出血。102号猪由于直肠脱垂而于第95天无痛处死。204号猪于第145天死亡。由于尸体高度腐烂所以未作尸检。
4244号猪在第一天攻击后由于麻醉并发症于第174天死亡。
5用NEEA对3只猪评分表4中总结了肺病灶结果。分析显示疫苗接种的猪(T02)的肺炎所致肺病灶的最小均方值显著(P＝0.0001)低于给予安慰剂的猪(T01)(0.3对5.9％)。
表4.总肺病灶百分数的总结病变肺的百分数治疗组接种物猪的数量 最小均方值范围T01 安慰剂24 5.9a0-36T02 疫苗 20 0.3b0-6a，b不同的上标值具有显著的统计学意义(P＝0.0001)。
该结果显示，将猪肺炎支原体菌苗RESPISURE-1给予猪单疫苗接种，可诱导出其对随后毒性猪肺炎支原体攻击的抵抗力。
实施例5测评猪抵御毒性猪肺炎支原体攻击的保护作用，所述猪为于3-8日龄施以单剂量猪肺炎支原体菌苗RESPISURE-1的猪肺炎支原体血清型阴性的猪。
在疫苗接种时或其前后，进行针对菌苗的五项复制效价实验。用与疫苗参照物相比的相对抗原量来测定RP。疫苗参照物的RP＝1.0，包含大约8000单位的猪肺炎支原体抗原。五项实验的RP值分别为5.42，3.96，4.71，5.49和4.36。
第0天，T02治疗组中的猪经肌内接种剂量为2ml的猪肺炎支原体菌苗。T01组中的猪经肌内接种剂量为2ml的安慰剂。在第76，77和78天，每只猪均经鼻接种(每鼻孔2.5ml)剂量为5ml的1∶25的攻击接种体悬液。这三天的每一天中，在接种时培养一等份攻击物，以确定不存在细菌污染。第二等份用反滴定法来确定攻击储存物中包含大约106CCU/ml的猪肺炎支原体。所有的猪每日都要进行检测并检查疾病的临床症状。
攻击第一天后29天，无痛处死全部猪并作尸检。将肺取出并进行评估。尸检测定包括评估支原体呼吸系统疾病相关的病理程度。每一片肺叶都要检测，并画出病灶的草图以评估其占每片肺叶的百分比。并记录总的病灶百分数。
表5中总结了该实验设计。
表5治疗组接种物数量免疫后0天第1761天攻击第1771天攻击第1781天攻击T01 安慰剂26 26 23223 23T02 疫苗 26 26 21321 211毒性猪肺炎支原体接种物2237和139号猪于第-1天检测为猪肺炎支原体阳性。于第14天将其从研究中除去并被无痛处死。220号猪由于母猪碾压于第3天死亡。
3238，240和277号猪于第-1天检测为猪肺炎支原体阳性。于第14天将其从研究中除去并被无痛处死。280号猪由于食欲下降和萎靡于第7天无痛处死。177号猪由于慢性衰竭综合症于第40天死亡。
表6总结了肺病灶结果。全部分析显示出免疫接种的猪(T02)的肺炎所致肺病灶百分率的最小均方值显著地(P＝0.0001)低于施以安慰剂的猪(T01)(0.5对9.9％)。
表6.总病变肺百分率总结病变肺百分比治疗组接种物猪数目最小均方值范围T01 安慰剂239.9a0至40.5T02 疫苗 210.5b0至5a，b不同的上标值为统计学差异(P＝0.0001)
权利要求
1.一种在动物中治疗或预防因猪肺炎支原体感染而引发的疾病或病症的方法，该方法包括对约3至约10日龄的动物施用单剂有效量的猪肺炎支原体疫苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述猪肺炎支原体疫苗配剂为灭活的、全部或部分猪肺炎支原体细胞制剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述单剂量猪肺炎支原体疫苗每剂量包含约1×106至约5×1010变色单位(CCU)。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述疫苗的施用量为约0.5至约3.0ml。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述猪肺炎支原体细胞制剂为RESPISURE-1。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述猪肺炎支原体疫苗还包含猪肺炎支原体以外的病毒或细菌抗原。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述病毒或细菌抗原选自猪流感病毒(SIV)、猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRS或神秘猪病)，断奶后腹泻(PWD)和猪增生性肠炎(PPE)。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述猪肺炎支原体制剂经肌内注射施用。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述猪在免疫接种后能被保护多至25周。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述猪肺炎支原体疫苗还包含佐剂。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述猪肺炎支原体疫苗为亚单位疫苗。
12.根据权利要求12所述的方法，其中所述亚单位疫苗包含一个或多个免疫原性多肽或蛋白质或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段。
13.根据权利要求13所述的方法，其中所述多肽或蛋白质选自P46，P65，P97，P102，P70，P50和P44。
14.根据权利要求1所述的方法，其中猪肺炎支原体疫苗包含一个或多个编码一个或多个免疫原性多肽或蛋白质或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段的基因或核酸，且所述基因或核酸可在体内表达。
15.根据权利要求15所述的方法，其中所述基因或核酸选自p46，p65，p97，p102，p70，p50，和p44。
全文摘要
本发明涉及一种通过对约3至10日龄动物施以单剂有效量猪肺炎支原体(M.hyo)疫苗来治疗或预防由猪肺炎支原体感染所致动物疾病或病症的方法。所述猪肺炎支原体疫苗可以是完全或部分灭活细胞或改良活体制剂、亚单位疫苗、或核酸或DNA疫苗。根据本发明施用的猪肺炎支原体疫苗可用合成或重组方法制备。
文档编号A61K39/116GK1551781SQ02813344
公开日2004年12月1日 申请日期2002年6月7日 优先权日2001年7月2日
发明者R·L·凯赫, R L 凯赫, L·G·萨巴迪尼, 萨巴迪尼 申请人:辉瑞产品公司