专利名称：重组猪肺炎支原体疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及猪肺炎支原体(Mycoplasma huyopneumoniae,M.hyopneumoniae或Mhyo)，具体涉及一种抗原性Mhyo蛋白。更具体地说，本发明涉及一种抵御地方性动物性肺炎、尤其是猪的地方性动物性肺炎而起保护作用的疫苗。
背景技术：
猪的地方性动物性肺炎，也称为支原体性肺炎，它是由Mhyo引起的。该疾病是一种慢性的非致命性疾病，影响所有年龄的猪。受感染的猪仅仅表现出轻微的咳嗽和发热症状，但是该疾病对于经济却有明显影响，因为它降低了饲料效率，并减少了猪的体重。地方性动物性肺炎通过受感染猪肺部呼出的支原体空气播散经鼻途径在猪之间传播。在最初感染了Mhyo后，猪还可能被其它种类支原体(猪鼻支原体和絮状支原体)以及其它细菌病原体二次感染。
Mhyo是一种小的原核微生物，它能独立地存活，但是通常发现它与真核细胞结合在一起，因为它绝对需要外源甾醇和脂肪酸。这些需求通常是其在含血清介质中生长所必需的。Mhyo与细胞膜而不是与细胞壁结合。Mhyo的基因组长度约为1000000个碱基对。
支原体和宿主细胞表面的物理性结合是地方性动物肺炎发作和持续的基础。Mhyo感染猪的呼吸道，在气管、支气管和细支气管中定居。该支原体产生一种纤毛静止(ciliostatic)因子，该因子使呼吸道上的纤毛停止抖动。最终，纤毛退化，使得猪易受第二种病原体感染。在受感染的动物可观察到愈合的紫色至灰色区域的特征性病损。对宰杀的动物进行调查，显示30-80％的猪有病损。来自13个州的37个饲养场的结果表明，99％饲养场的猪有地方性动物肺炎之典型肺炎病损症状。因此，非常需要有效的预防和治疗措施。
抗生素如冠截耳素、三甲氧苄二氨嘧啶、四环素和林可霉素具有一定的效果，但是昂贵且需要长期使用。另外，这些抗生素没有表现出有效根除了Mhyo的传播或重新感染。预防维持饲养场无病原体有时可行，但是通常会再次引入Mhyo。由于猪肺炎的严重的经济后果，人们已经找到了抗Mhyo的疫苗以及表明存在该感染的诊断性测试方法。含有在含血清培养基中生长的支原体之制剂的疫苗已上市，但是价格昂贵，并且因免疫材料中存在血清成分而会引起副反应。提供疫苗的其它尝试还未成功，因此该疾病仍十分普遍。
因此，需要一种抵抗猪体内支原体感染的疫苗以及一种生产该疫苗的廉价方法。还需要一种诊断性试验来检测猪群中是否存在猪支原体感染。
发明概述本发明提供一种纯化的或分离的以重组或合成方法制得的猪肺炎支原体蛋白P102，以及作为P102一部分的多肽或肽，当将它们给予猪时，它们诱发产生的抗体能与Mhyo结合。较佳的P102和多肽具有
图1所示的氨基酸序列，或该序列的片段。
本发明还提供用于制备P102和前述多肽的重组DNA分子。较佳的重组DNA分子特征是选自图2所示序列的DNA序列、编码图1和5所示氨基酸序列的DNA序列、与那些DNA序列的任何一个杂交并编码Mhyo P102的DNA序列、编码上述任一DNA序列所编码的Mhyo抗原的DNA序列、和与上述DNA序列遗传密码简并并编码Mhyo的一个抗原的DNA序列。本发明还提供含有这些蛋白或DNA序列的表达载体和宿主细胞。
本发明还包括一种用于免疫猪抵抗Mhyo感染的疫苗，免疫方法是给予猪(例如通过注射)制得的并随后分离的P102、多肽、或含有本发明DNA序列的表达载体，给予的量应足以引起抗体的形成。本发明还提供一种基于本发明的P102、多肽或针对它们产生的抗体的诊断性测试，用于测试猪群中的Mhyo感染。
本发明的其它优点和特征将在本发明较佳实施方案的详细描述、附图和实施例部分明显看出。
附图简述图1示出了P102的氨基酸序列。
图2示出了编码Mhyo P102的DNA序列。
图3示出了P97操纵子克隆的限制性图谱。
图4示出了P102克隆的限制性图谱。
图5示出了翻译的P102的氨基酸序列与几个克隆的序列的序列对比。
图6示出了P97毗连序列群的开放读框，以及用来筛选基因组文库的探针。
图7示出了Mhyo DNA与图6的探针杂交分析的结果。
发明详述现在将详细参看本发明的较佳实施方案，结合附图和下述实施例来解释本发明的原理。这些实施方案描述地非常详细，足以使本领域技术人员实施本发明，并且应当理解在不脱离本发明的思路和范围内还可采用其它实施方案，并作结构上和化学上的变化。
在本申请中采用了下列缩略语aa，氨基酸；Ab，抗体；bp，碱基对；CHEF，夹持均相电场(clamped homogenous electric rield)；H，嗜血杆菌；kb，千碱基或1000个碱基对；Kn，卡那霉素；LB，Luria-Bertoni培养基；M，支原体；mAb，单克隆抗体；ORF，开放读框；PCR，聚合酶链反应R，抗性；Tn，转座子;::，新的接头(融合物或插入物)。下表1中给出了氨基酸的一个字母和三个字母密码符号。
用于下文描述的术语“蛋白质”指微生物表达的、用常规方法(如制备性层析，免疫学分离或通过金属螯合柱)与其它蛋白、全细菌和细胞物质分开、分离或从中纯化出来的蛋白质。下文描述中所用的术语“突变体”指具有少量修饰或保守性变化的氨基酸或DNA序列，从而该序列导致蛋白质具有与天然Mhyo P102基本上等价的功能。
术语“保守性变化”指一个氨基酸残基用另一个生物学上相似的残基来代替，或替换DNA序列中的核苷酸来达到相同的结果。保守性变化的例子包括用一个疏水性残基(异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)来代替另一个疏水性残基，或用一个极性残基来代替另一个极性残基，例如用精氨酸来代替赖氨酸，用谷氨酸来代替天冬氨酸，或用谷氨酰胺来代替天冬酰胺等。术语“保守性变化”还包括用替换的氨基酸来代替未经替换的亲代氨基酸，只要该替换的多肽所产生的抗体也能和未替换的多肽发生免疫反应。
本发明还涉及分离的、纯化的和/或重组体形式的猪肺炎支原体蛋白P102，以及该P102蛋白或其片段作为猪疫苗或诊断工具的应用。本发明已经对P102进行了分离、特征分析和命名，发明者已显示出P102能在猪体内引起免疫反应保护猪抵抗毒性攻击。对应于重组P102的DNA序列、含有该序列的表达载体和宿主也在本发明的范围内。本发明还提供一种含有分离的、纯化的和/或重组的P102、或编码P102的DNA序列的疫苗，用于免疫猪以抵抗Mhyo感染，还提供一种基于P102、用于测试猪群中感染的诊断性工具。
任何Mhyo菌株均可作为起始材料来制备本发明的P102。合适的Mhyo菌株可以从各种来源获得，包括从保藏机构如美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas,VA)和NRRL培养物保藏中心(Agricultural Research Service,U.S.Department ofAgriculture,Peoria,IL)获得。单单ATCC就列出6个Mhyo菌株可售。鉴于该疾病的广泛传播，还可通过从患病动物的肺分泌物或组织回收Mhyo并接种到合适的培养基中来获得菌株。
现在参看附图，图1显示了Mhyo P102的氨基酸序列。可以看出，P102包含904个氨基酸，从下表2中可以详细看出氨基酸的分布。P102缺少半胱氨酸，等电点(pI)为9.28。该蛋白质被命名为“P102”是因为它的分子量为102.3千道尔顿。据认为P102可能是跨膜蛋白，因为该蛋白的N端存在推定的25个氨基酸的跨膜结构域(氨基酸10-34)。尽管不希望受理论束缚，目前认为该蛋白序列的其余部分形成了一个或多个α螺旋，因为其中存在较高比例(64％)的形成α螺旋的氨基酸。
本发明的蛋白质或多肽具有图1所示的氨基酸序列，或所述序列的片段或突变体能引起识别图1所示氨基酸序列表位的抗体或其它免疫反应。在氨基酸或编码DNA水平上的突变可用来提高蛋白质的产量、它们的免疫原性或抗原性、或与各种纯化方案、佐剂和给药方式的相容性。这些合成或重组的片段和突变，其特征是具有天然的Mhyo P102的一个或多个抗原性位点。
本发明的蛋白或多肽可以是从Mhyo细胞中抽提出的经过纯化或分离的蛋白或多肽，或可以是在编码那些重组蛋白或多肽的DNA序列转化的宿主中产生的重组蛋白或多肽。当然可以理解，这些蛋白或多肽可以包括与Mhyo无关的残基。例如，本发明的重组蛋白或多肽可以是融合蛋白，它含有一个衍生自表达载体或其它来源的蛋白部分以及一个衍生自Mhyo的蛋白部分。这些重组多肽及其融合物可能还包括一个起始的甲硫氨酸。所需的是最终的多肽应表现出天然Mhyo P102的抗原性。
图2中显示了编码本发明的P102蛋白的重组DNA序列，它包含2712个碱基对。所示序列是非模板链，5’端在左侧，3’端在右侧，因此从互补模板链产生的mRNA将与图2所示的序列相同，只是尿嘧啶(U)替代了胸腺嘧啶(T)。起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)用下划线表示。图中还示出了起始密码子上游约24个碱基对，其中包括起始密码子上游10个碱基对处的推定的Shine Dalgamo序列(GGAGGT)，以及起始密码子下游的21个碱基对。P102与任何已知的序列，包括其它细菌粘附素基因均不明显匹配。
本发明涉及编码某种蛋白的DNA序列，包括其不到全长的DNA序列及其突变体，该蛋白能引起识别图1所示氨基酸序列之表位的抗体或其它免疫反应(例如免疫系统的T细胞反应)。因此，本发明的DNA序列可以编码某些蛋白或或多肽，这些蛋白质或多肽可能是全长抗原、抗原片段、抗原衍生物或这些抗原、抗原片段或抗原衍生物与另一蛋白的融合产物。
本发明还提供了用于制备上述蛋白质和多肽的重组DNA分子。较佳的重组DNA分子其特征是其DNA序列选自图2所示的序列，如上所述含有编码本发明重组蛋白质或多肽的序列的克隆或表达载体，与那些DNA序列的任何一个杂交并编码MhyoP102的DNA序列，编码上述任一DNA序列所编码的Mhyo抗原的DNA序列，以及与上述DNA序列遗传密码简并并编码Mhyo的一个抗原的DNA序列。
合适的DNA序列可以通过各种方法(一般通过利用合适的限制性内切核酸酶位点)插入各种表达载体中。合适的载体例如包括由染色体、非染色体以及合成的DNA序列的节段组成的载体，例如SV40的各种已知的衍生物；已知的细菌质粒，例如大肠杆菌的质粒(包括col E1,pCR1,pBR322,pM89及其衍生物)；宿主范围较广的质粒，例如RP4；噬菌体DNA，例如λ噬菌体的多种衍生物，如NM989，以及其它DNA噬菌体，如M13或丝状单链DNA噬菌体，酵母质粒如2μ质粒或其衍生物，病毒DNA如杆状病毒、牛痘、腺病毒、禽痘病毒、或假狂犬病毒，以及从质粒和噬菌体DNA的组合衍生的载体，例如经过修饰可采用噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒。
在各个具体的克隆或表达载体中，可以选出各种位点供插入本发明的DNA序列。这些位点通常用切割它们的限制性内切核酸酶来命名，有各种已知的方法可将DNA序列插入这些位点内形成重组DNA分子。这些方法例如包括，dG-dC或dA-dT加尾，直接连接，用合成接头，外切核酸酶和聚合酶连接的修补反应然后连接，或用DNA聚合酶以及合适的单链模板延伸DNA链然后连接。当然，应当理解，用于本发明的克隆或表达载体不需要有用来插入所选DNA片段的限制性内切核酸酶位点，这种插入可通过另外的方式来产生。
为了表达本发明的DNA序列，将这些DNA序列与表达载体中的一个或多个表达控制序列操作性相连。这些操作性相连可在所选DNA序列插入克隆载体之前或之后实现，它使得表达控制序列能控制并启动所插入的DNA序列表达。
在这些载体中可以采用各种表达控制序列(当其与DNA序列操作性相连时能控制该DNA序列的表达)的任何一种来表达本发明的DNA序列。这些有用的表达控制序列例如包括，SV40的早期和晚期启动子、lac或trp系统、TAC或TRC系统、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油激酶或其它糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子(例如Pho5)、酵母α交配因子的启动子、以及已知能控制基因在原核或真核细胞中或细胞病毒中表达的其它序列，以及它们的各种组合。表达载体还包括用于启动翻译和终止转录的核糖体结合位点的非编码序列。载体可能还包括用来扩增表达的合适序列。在哺乳动物细胞中，可能还要通过将该基因与编码脱氢叶酸还原酶并在宿主中国仓鼠卵巢细胞中加入选择标记的基因连接，来扩增该表达单元。
载体或表达载体，尤其是选用来供插入所选DNA片段的位点以及用于本发明的表达控制序列，是由各种因素来确定的，这些因素例如有易受特定限制性酶作用的位点数目、待表达的蛋白的大小、表达特点(例如起始和终止密码子相对于载体序列的位置)、以及本领域技术人员认同的其它因素。载体、表达控制序列和插入位点的选择由这些因素的平衡来决定，对于一给定的情况而言，并非所有的选择均具有相同的效果。
在本发明的较佳实施方案中，可以采用图3至5所示的各种克隆。图3示出了P97操纵子的各个重叠克隆的限制性图谱，该P97操纵子包括了Mhyo蛋白P97和P102的基因。这些克隆通过与pISM1161的克隆片段作DNA杂交来获得。图中示出了P97结构基因的位置，其转录方向(箭头方向)以及DNA序列分析的区域(黑条柱)。位点用千碱基表示。限制性酶的缩写如下A,AccⅠ；B,BamHⅠ；Bg,BglⅡC,ClaⅠ；E,EcoRⅠ；EⅤ,EcoRⅤ；H,HindⅢ；Hn,HincⅡ；N,NciⅠ；S,SalⅠ。
图4描述了本发明的与P102有关的克隆的限制性图谱。图中显示了具有P97和P102基因边界的P97毗连序列群的物理图谱作为参照，转录方向为从左到右。克隆pISM1232-34和pISM2166的DNA序列之间的同源性与P97操纵子序列表示成有阴影或阴影线的区域，浅灰色阴影线表示高度(＞95％)的P102同源性，黑色表示降低的(＜75％)至没有P102同源性；深灰色表示没有P97同源性，有阴影线的区域表示没有获得该区域的DNA序列信息。图中示出了质粒pISM1165,pISM1168,pISM1169,pISM1170以及pISM1174相对于pISM1232和pISM1233的位置。对于每个克隆或每类克隆给出了限制性酶的模式，其大小用千碱基表示。
图5示出了P102克隆pISM2166、pISM1232、pISM1233和pISM1234的翻译的氨基酸序列与天然P102的序列对比。P102氨基酸的序列对比用MacVectorTM软件6.0.1版(Oxford Molecular Group,Campbell,CA)中的Clustal W序列对比进行。方框区域表示序列相同或相似。pISM1233/3表示pISM1232和pISM1233二者的序列对比。pISM1232的序列显示在序列对比的开头，pISM1233的序列显示在序列对比的最后。
然后，可用含有所需基因与表达控制序列操作性相连的重组DNA分子转化各种合适的宿主，从而使这些宿主(转化子)表达该基因或其片段，并产生该杂合的DNA所编码的多肽或其一部分。重组DNA分子还可用来转化宿主，从而使宿主在复制时产生额外的重组DNA分子作为Mhyo基因或其片段的来源。
各种宿主还可用来产生本发明的抗原和DNA序列。这些宿主例如包括，细菌如大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌，真菌如酵母，以及组织培养物中的动物或植物细胞。选择合适这些应用的宿主受许多因素控制。这些因素例如包括，与所选载体的相容性，副产物的毒性，回收所需多肽的容易程度，表达特征，生物安全性和成本。不应根据这些因素中的单单一个因素来选择针对特定重组DNA分子或多肽的宿主。相反，必须平衡考虑这些因素，并认识到并非所有宿主对于特定重组DNA分子的表达均同样有效。
还应理解，插入克隆或表达载体所选位点的DNA序列可以包括并非编码所需多肽的真实基因部分的核苷酸，或可只包括编码该蛋白质的整个基因的一部分。唯一的要求是无论采用何种DNA序列，转化的宿主均应产生具有天然Mhyo P102抗原性的多肽。
例如，本发明的DNA序列可以在本发明的表达载体中在同一读框内，与编码至少一种真核或原核载体蛋白的DNA序列之一部分、或编码至少一种真核或原核信号序列的DNA序列、或它们的组合融合。这些构建物有助于所需DNA序列的表达，改进纯化或允许所需多肽分泌(较佳的是成熟)出宿主细胞。另外，DNA序列可包括单单一个ATG起始密码子或还有其它密码子，它们与编码所需多肽的第一个氨基酸的序列直接融合。这些构建物能产生例如是本发明一部分的甲硫氨酰基多肽或是其它肽基多肽。然后，在本发明组合物和方法中可用各种已知的方法在细胞内或细胞外切割此N端甲硫氨酸或肽，或和甲硫氨酸一起使用该多肽、或使其它融合物与其连接。
载体中存在的合适的DNA序列在导入宿主后可以表达部分或仅仅一部分其编码的蛋白，只要表达的蛋白足以能够引发识别图1所示氨基酸序列之表位的抗体或其它免疫反应。例如，在采用大肠杆菌作为宿主生物体时，UGA密码子是终止密码子，因此表达的蛋白可能仅仅是编码于载体中的抗原的一个片段，出于这个原因，通常较佳的是将合适DNA序列中的所有UGA密码子转变成非终止密码子。在识别UGA为终止密码子的宿主中绕开此问题的另一种方式是加入一个额外的DNA序列，该序列编码的t-RNA在转化的生物体内将蛋白质编码序列中的UGA密码子翻译成色氨酸。
载体转化的宿主所表达的蛋白可用本领域技术人员能想到的方法来收获，并用于疫苗中来保护非人动物如猪、牛等，抵抗Mhyo引起的地方性动物性肺炎。该蛋白质的用量应能有效地提供保护力抵抗Mhyo引起的地方性动物性肺炎，并可以和合适的生理上可接受的载体(在下文有更详细的描述)联合使用。
在本发明的一个较佳的实施方案中，将P102的基因序列克隆到购自InvitrogenCorp.(Carlsbad,CA)的表达载体pTrcHis Xpress中。用该载体转化大肠杆菌宿主，高水平地产生P102蛋白。pTrcHis Xpress载体产生了一个融合蛋白，该蛋白包含P102与6个串联组氨酸残基的短前导肽融合。然后裂解细胞，使粗制的细胞裂解液通过金属螯合柱(如ProBond柱(Invitrogen,Carlsbad,CA))，纯化P102。
本发明的重组蛋白和多肽还可作为抗原用于诊断目的，用来确定生物学测试样品中是否含有Mhyo抗原或针对这些抗原的抗体。测定动物体内Mhyo感染的这种试验通常包括在可检测的标记的本发明重组蛋白存在下，培育怀疑患有这种病况的动物的含抗体生物学样品，并检测结合反应。
因此，在本发明的这个方面，此重组蛋白可以和能固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白的固相载体(如微量滴定板)结合。然后，用合适的缓冲液洗涤该载体，再用含有抗体的样品处理。然后，用缓冲液第二次洗涤固相载体，除去未结合的抗体。加入标记的重组蛋白，第三次洗涤载体，除去未结合的标记的抗原。然后用常规手段检测结合于所述固体载体上的标记的量。
“固相载体”指能结合抗原或抗体的任何载体。熟知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然的和改性的纤维素(尤其是硝酸纤维素)、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁石。出于本发明的目的，载体的性质可以是一定程度可溶的，或是不溶的。载体材料基本上可以具有任一可能的结构构型，只要结合的分子能结合抗原或抗体即可。因此，载体的构型可以是球形，例如珠粒状，或圆柱形，例如在试管的内表面，或棒的外表面。另外，表面可以是平的，例如是片、试条等。较佳的载体是聚苯乙烯珠。
对Mhyo特异性抗体进行可检测标记的方式之一是连接抗体和酶，并在酶免疫试验(EIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)中使用。该酶在以后接触其底物时会和该底物反应，产生能被分光光度计、荧光光度计或肉眼方法检测的化学物质。可用来可检测标记Mhyo特异性抗体的酶包括，但不局限于，辣根过氧化物酶、苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
检测可以用各种免疫试验来进行。例如，通过对重组蛋白作放射活性标记，可以通过采用放射性免疫试验(RIA)来检测抗体的结合。放射活性同位素可以用诸如γ计数器或闪烁计数器或放射自显影等方法来检测。出于本发明的目的，特别有用的同位素是3H、125I、131I、35S和14C，较佳的是125I。
还可用荧光化合物来标记此重组蛋白。当经荧光标记的蛋白质与波长合适的光接触时，可以靠荧光来检测它的存在。最常用的荧光标记化合物是异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。该蛋白还可用发射荧光的金属如152Eu，或镧系的其它金属来作可检测标记。这些金属可用诸如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合基团来与该蛋白质连接。
该蛋白质还可通过与化学发光或生物发光化合物连接来作可检测性标记。然后，通过检测化学反应期间产生的发光来测定化学发光标记的蛋白质的存在。生物发光是见于生物系统中的一类化学发光，在该系统中一种催化性蛋白提高了化学发光反应的效率。特别有用的化学发光标记化合物是鲁米诺、异鲁米诺、热性吖啶鎓酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶盐和草酸酯。用于标记目的的重要的生物发光化合物是萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。
标记可以用闪烁计数器(例如当可检测的标记是放射活性γ射线时)或荧光计(例如当标记是荧光物质时)来检测。在酶标记的情况下，可以通过采用该酶底物的比色法来检测。另外还可通过肉眼将底物酶促反应的程度与以相似方法制得的标准比较来检测。
检测到可检测标记的抗体的聚集是患病或功能紊乱状态的指标，并可用来衡量样品中的Mhyo。若不存在这些抗体或其它免疫反应，则表明动物既未接种过疫苗，也未受到感染。出于本发明的目的，可用该试验方法检测的细菌可能存在于生物学样品中。可以采用含有该细菌的任何样品，然而，本诊断发明的一个优点是可以避免侵入性地切除组织。因此，较佳的，样品是生物溶液，例如鼻、喉或肺的体液，但是本发明并不局限于仅采用这些样品进行测试。
从动物中取出组织样品，向该样品提供本发明的组合标记抗体，进行原位检测。该抗体(或片段)宜通过将标记的抗体(或片段)施加或覆盖在生物学样品上的方式来提供。通过采用这种方法，不仅可以确定Mhyo的存在，而且还能确定其在受检组织中的分布。利用本发明，本领域普通技术人员将会认识到，为了实现这种原位检测，可以要改进各种组织学方法(例如染色过程)。
另外，可以通过和图2所示序列中含有的重组或合成的DNA序列的反应，或与所述DNA序列等价的任何RNA序列的反应，来测试体液样品中Mhyo P102的基因是否存在。不存在该基因则表明动物既未接种过疫苗，又未受到感染。该试验包括核酸序列的合成、扩增或杂交方法，这些方法均是本领域技术人员所知道的。
本发明还涉及一种疫苗，它包含本发明的重组蛋白和多肽，或编码这些蛋白和多肽的DNA序列，用于免疫或保护非人动物(较佳的是猪)以抵抗Mhyo感染(尤其是地方性动物性肺炎)。术语“保护”或“保护力”当和本文所述的地方性动物性肺炎疫苗一起使用时，指该疫苗能预防Mhyo引起的地方性动物性肺炎，和/或减轻疾病的严重程度。
基于本发明DNA序列的疫苗可以这样制得除去UGA密码子，将所选序列导入合适载体中。然后以合适的方法给予该疫苗，这些方法例如是颗粒轰击、显微注射、电穿孔、磷酸钙转染、脂质体转染和病毒性转染。DNA疫苗及其给药方法是本领域中熟知的，并且在美国专利No.5,836,905；5,703,055；5,589,466和5,580,859中有所描述，这些专利均被纳入本文作为参考。
疫苗可以和各种载体的任一种载体联合使用。典型的载体包括无菌水、盐水、缓冲溶液、矿物油、明矾、合成的聚合物等。溶液中还可采用能改善悬浮性能和分散性能的其它试剂。合适载体的选择取决于给予疫苗的方式。该疫苗通常用于易患地方性动物性肺炎的非人动物，尤其是猪。
该疫苗可以任何合适的方法给予，例如肌内、皮下、腹膜内或静脉内注射。或者，该疫苗可以鼻内或口服给予，例如将活性组分与饲料或水混合在一起，以片剂形式提供等。颗粒轰击、显微注射、电穿孔、磷酸钙转染、脂质体转染和病毒性转染等方法特别适合给予DNA序列疫苗。本领域技术人员能从本文所述中明确知道给予该疫苗的其它方法；因此，本发明的范围并不局限于特定的给药形式。除了本文上述的抗原或片段外，该疫苗还可包括活性组分或佐剂(例如Freund不完全佐剂)。
可用佐剂来增强抗原的免疫原性。对于佐剂作用的机制还未完全知道。认为一些佐剂是通过缓慢释放抗原来增强免疫反应，而另一些佐剂是起协同增效的作用。可采用的佐剂有油和水乳剂、完全Freund佐剂、不完全Freund佐剂、小棒状杆菌、嗜血杆菌、丁酸分支杆菌、氢氧化铝、硫酸葡聚糖、氧化铁、海藻酸钠、Bacto-佐剂、某些合成的聚合物如聚氨基酸以及氨基酸的共聚物、皂苷、碘他角叉菜胶(iotacarrageenan)、RegressinTM、AvridineTM、Mannite monooleate、石蜡油和胞壁酰二肽。
将本发明教导的内容应用到具体的问题或环境上是本领域普通技术人员在阅读了本文的指导后力所能及的。下列实施例中显示的是本发明的产物和方法的实施例。
实施例1文库构建和筛选如Minion,F.C.,VanDyk,C.和Smiley,B.K.,"用大肠杆菌增强的opal阻遏子菌株来筛选猪肺炎支原体文库"，131 FEMS Microbiol.Letters 81-85(1995)中所述的那样(该文纳入本文作参考)，用克隆到EcoRⅠλZAP Ⅱ中的Tsp5091消化的染色体DNA，构建Mhyo染色体DNA基因组文库。用Hanahan,D.,"用质粒转化大肠杆菌的研究"，166J.Mol.Biol.557-80(1983)所述的技术，使该文库在大肠杆菌菌株LE392上生长，用Sambrook,J.,Fritsch,E.F和Maniatis,T.,《分子克隆实验指南》，Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)中的方法，以及Minion等人所述的猪恢复期抗血清进行筛选。
图6描述了P97毗连序列群的开放读框以及用来筛选基因组文库的探针。方框代表ORF，在它们的下方给出了符号。有阴影的方框表示从左到右的转录；白色方框表示从右到左的转录。在图下方显示了用于杂交分析的探针1-4以及用来筛选基因组文库的探针5。用32P放射性标记的探针65％杂交过夜。一个杂交探针是3.3kb的pISM1161克隆片段，该片段含有P97的N端以及图3中所示的上游序列。第二个探针，探针5，是位于图6所示P102结构基因中的一个克隆的400bp DNA片段。
还用如上文所述的Minion等人的Mhyo感染的猪恢复期血清来筛选文库。恢复期血清用下列方法获得。从动物体内取出Mhyo感染的猪肺，对其匀浆，然后冷冻猪等分，制得接种物。然后，将接种物一等分1∶10稀释到硬脂酰(steryl)磷酸缓冲盐溶液中，取10毫升滴注到猪的气管间。28天或56-73天后取血，获得血清。用ExAssistTM辅助噬菌体(Stratagene,La Jolla,CA)在体内从对应的纯化重组λZAP Ⅱ噬菌体上切下含有克隆的Mhyo染色体DNA片段的质粒，并根据生产商说明书(Stratagene,La Jolla,CA)导入到大肠杆菌SOLRTM[el4-(mcrA)Δ(mcrCB-hsdSMR-mλR)171 sbcC recB rec Juvr C umuC::Tn5(KnR)lac gyrA96 relAl thi-l endAl λR(F′proBlaclqZM15)Su-]中。
实施例2DNA测序和序列分析如Strathmann,M.,Hamilton,B.A.,Mayeda,CA.,Simon,M.I.,Meyerowitz,E.M.和Palazzolo,M.J.,"转座子协助的DNA测序"，88 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1247-50(1991)中所述的那样，在质粒pISM1210,pISM1217和pISM2166上进行Tn1000协助的DNA测序。用Strathmann等人所述的大肠杆菌菌株DPWC(F+)和BW26(KnR接受者)进行交配。用SalⅠ、EcoRV和BamHⅠ限制性酶作限制性消化，对插入物作图，选择一系列的Tn1000插入物，根据它们的位置以及用途(除P97序列上游和下游的DNA序列信息外)，用作测序反应的模板DNA。然后如Strathmann等人所述的那样进行DNA测序，在循环测序反应中采用T7和T3载体特异性引物位点和Tn1000末端特异的引物186(5′-ATATAAA CAACGAA TTATCTCC-3′)和188(5′-TAAGTTA TACCATAAACG-3′)。所有序列用自动化373A型荧光DNA测序仪(Perkin-Elmer AppliedBiosystems,Inc.,Foster City,CA)来获得。用MacVectorTM软件6.0.1版(Oxford MolecularGroup,Campbell,CA)进行DNA序列分析。用支原体翻译表来进行翻译。DNA和翻译蛋白序列的同源性搜索分别用BLASTN和BLASTP分析来实现。
实施例3杂交分析在经HindⅢ、HincⅡ、EcoRⅤ、EcoRⅠ和BglⅡ消化的Mhyo染色体DNA上进行杂交分析。在0.7％琼脂糖凝胶上分辨消化的DNA，并印迹到尼龙膜上。该分析中采用了图3和6所示的几个P97操纵子特异性探针，包括从pISM1213获得的758bp的P97的EcoRⅤ-HindⅢ片段(探针1)，含有P97的R1重复序列区的PCR产物(它含有主要的抗原性和纤毛结合表位)(探针2)，以及pISM2139的NciI-HincⅡ片段(探针3)和HincⅡ-KpnⅠ片段(探针4)。
在含有2毫摩尔氯化镁、25皮摩尔各引物、1-50毫微克模板DNA、1.25单位的Taq DNA聚合酶的PCR反应混合物(50微升1X生产商的反应缓冲液)中，用引物TH120(5′-AAGGT AAAAGA GAAGA AGTAG)和TH121(5′-TTGTA AGTGAAAAGC CAGTAT)产生探针2。PCR条件如下DNA 94℃变性5分钟，然后经历35轮的94℃变性1分钟、58℃退火1.5分钟和72℃延伸1分钟，最后是5分钟的72℃延伸步骤。
图7示出了Mhyo DNA与图6所示探针的杂交分析结果。每一条代表与条顶部所示单个探针的杂交。对于探针1和2，用BglⅡ消化染色体DNA。对于探针3和4，消化染色体DNA的限制性酶是HindⅢ(泳道1)、HincⅡ(泳道2)、EcoRV(泳道3)、EcoRⅠ(泳道4)和BglⅡ(泳道5)。泳道6含有6毫微克的对照质粒DNA，其用分离探针的酶来消化。放射自显影用Cohu 4900型高性能CCD相机(Cohu In.,San Diego,CA)和装有Scion Corporation(Frederick,MD)录象板的Macintosh Ⅱci来数字化。用GelReader软件(NCSA,Urbana-Champaign,IL)确定每个条带的大小，大小用千碱基表示。获得TIFE文件，在Adobe Photoshop中装配，在Aldus FreeHand(Adobe SystemInc.,San Jose,CA)中标记。
实施例4P102基因拷贝的克隆和分析将琼脂糖凝胶纯化的Mhyo染色体DNA的3.8，4.2和4.8kb的EcoRⅠ片段克隆到EcoRⅠ消化的pBluescript Ⅱ pSK-(Stratagene,La)中，获得另外的P102克隆。然后用探针3(图6所示)对P102特异性克隆进行集落印迹，筛选出重组克隆。对所得的这些质粒作限制性图谱，并对克隆片段的末端测序。用测序引物(5′-GCGGCTGCTAAAC TAAGACTA)获得额外的pISM1232和pISM1234 3′端序列信息，将其与P97毗连序列群作序列对比。用猪恢复期抗血清筛选基因组文库，获得另一个克隆pISM2166，对其进行完全测序，发现它与P102明显同源。
实施例5P102结构基因的鉴定和特征分析如Tsu,T.,Artiushin,S.和Minion,F.C."猪肺炎支原体的呼吸道纤毛粘附素基因P97的克隆和分析"179 J.Bacteriol.1317-23(1997)中所述的那样，用单克隆抗体F186鉴定含有P97序列的所有上述重组克隆。为了获得含有P97结构基因及其周围序列的其它克隆，我们用含有P97 5′端和翻译起始密码子上游序列的探针进行杂交，筛选基因组文库。用感染Mhyo的猪的恢复期血清筛选文库，鉴定出另一个具有P102序列的克隆。然后对所得克隆进行DNA测序和杂交分析。
用pISM1161的3.3kb片段筛选该基因组文库，结果鉴定出克隆pISM1210，pISM1212-pISM1214和pISM1217(如图3所示)。这些质粒，用最大的两个质粒pISM1210和pISM1217表示，分别覆盖了对应于P97基因上游和下游区域的16kb区域(命名为P97毗连序列群)。用探针5鉴定出的克隆是pISM1165、pISM1168-pISM1170以及pISM1174(图4)。
获得总共9374bp的DNA序列，包括P97的序列。图2示出了包括P102基因的约2750bp的序列。P97操纵子的完整序列已由Hsu,T.和Minion,F.C.,在"猪肺炎支原体的P97纤毛粘附素操纵子的分子分析"，214 Gene 13-23(1998)和Hsu等人(登陆号为U50901)中公开。计算机分析在该9374bp序列中总共鉴定出6个ORF(图6)。P97看来是两个基因操纵子的第一个基因，命名为P97操纵子，在图4和6中示出。两个基因相隔20bp，它包括第二个ORF的ATG起始密码子上游10bp的推定ShineDalgarno序列(GGAGGT)。该ORF的长度为2712bp，能编码102.3kDa的蛋白。该蛋白命名为P102，其计算的pⅠ为9.28，并且缺少Cys(见上表2)。
该蛋白具有高度亲水性，N端具有推定的25个氨基酸的跨膜结构域(氨基酸10-34)。在数据库中搜寻与P102的同源性，发现其与任何已知的序列(包括其它细菌粘附素基因)均不明显匹配。P102的蛋白结构预测表明在疏水性跨膜序列后有高度的α螺旋性(数据未示出)。
为了验证Mhyo染色体中存在P102的其它拷贝这一假想，克隆并分析P102-特异性探针识别的其它EcoRⅠ染色体片段。对分别代表3.8,4.2和4.8kb片段的质粒pISM1232-1234进行限制性位点作图。对3.8和4.2kb克隆片段的末端进行部分测序，提示这两个克隆来自最初P102拷贝的不同染色体区域。图4显示了所克隆的片段与P97毗连序列群的序列对比。pISM1322的3′端以及pISM1233的5′端的DNA序列与P102序列以及P97与P102之间的间插序列有很好的匹配，但是同源性在P97基因序列的3′端突然结束(图4)。pISM1322的5′端显示出不与P97基因或其它任何已知的序列同源。pISM1233的3′端在蛋白质水平上与谷氨酸棒杆菌热休克蛋白ClpB同源(在谷氨酸棒杆菌氨基酸158-256之间的98个氨基酸区域内有62％的相同性和84％的相似性)。在clpB序列上游的是Mhyo丙糖磷酸异构酶基因tpi(登录号为L33478)。用衍生自P102序列的400bp探针从基因组文库获得限制性图谱与pISM1232和pISM1233相似的一系列重叠的克隆(pISM1165、pISM1168-1170以及pISM1174)。图4中显示了这些克隆相对于pISM1232和pISM1233的排列。没有获得这些克隆的序列信息，但是它们的限制性图谱暗示它们和pISM1232以及pISM1233来自相同的染色体区。
从含有4.8kb杂交片段的质粒pISM1234获得的DNA序列信息显示出与P102同源的短的DNA序列与不同源的区域交替。如图5所示，鉴定出两段130bp(与P102的同源性为82％)和177bp(与P102的同源性为95％)的序列，这解释了它与P102特异性探针3反应弱的原因。由于克隆pISM1232-pISM1234没有被完全测序，因此该克隆的片段中可能存在其它未鉴定的但与P102同源的序列。
克隆pISM2166代表了一个与P102几乎完全同源的拷贝。从图4和5中看出，该1624bp的序列只在144-330bp(氨基酸48-110)中显示出差别。P102的限制性图谱与P97操纵子序列的图谱几乎完全相同，除了不存在SalⅠ和AccⅠ位点外(图4)。SalⅠ是Mhyo中少见的切割酶，因此P102拷贝中丢失该位点是明显的。我们的结论是，pISM2166代表了第二个P102拷贝。质粒pISM1232和pISM1233也显示出与P102有良好的匹配(图5)，但是它们的限制性图谱方式以及pISM1232的上游序列显示出这些片段是从第三个染色体位置衍生获得的。质粒pISM1232和pISM1233可能来自同一染色体位置，因为pISM1165、pISM1168-1170以及pISM1174的克隆以相同的限制性图谱方式重叠该区域。经我们的限制性序列分析所识别，质粒pISM1234只有两个短的序列与P102同源。然而，该片段显然衍生自另一个染色体区域。
实施例6P102蛋白在检测猪体内存在猪肺炎支原体感染中的应用(预期实施例)本发明显示具有猪肺炎支原体抗原性的多肽可用于为检测猪群中存在猪肺炎支原体感染而设计的方法以及试剂盒中，从而来识别猪群中哪个猪被该病毒感染，以便对猪群作早期疫苗接种以抵抗该感染。出于该目的，本发明的重组DNA分子转化的宿主所产生的抗原、或针对该抗原产生的抗体，可用于RIA或ELISA。在一类放射性免疫试验中，将针对本发明的一种或多种抗原的抗体(在例如在家兔的实验室动物体内产生)连接到固相上，例如试管内壁上。然后在试管中加入抗原，使其和抗体结合。
然后将每群10-20头猪中之一头猪的血清样品和已知量的放射活性同位素(如放射活性碘)标记的抗原抗体一起加入包被了抗原-抗体复合物的试管中。猪血清中的抗原(Mhyo感染的标记)抗体将与标记的抗体竞争抗原-抗体复合物上游离的结合位点。一旦使血清相互反应后，就除去过量的液体，然后洗涤试管，测定放射活性的量。低的放射活性计数表示阳性结果，即猪血清含有Mhyo抗体。
在一类ELISA测试中，用本发明的一种或多种抗原包被微量滴定板，在其中加入猪血清样品(取自一群10或20头猪中的一头)。在培育一定时间使血清中的抗体与抗原相互反应后，洗涤板，并加入由实验动物产生并与酶连接的抗原抗体制备物，培育使反应发生，然后重新洗涤板。随后，在微量滴定板中加入酶底物，培育一定时间使得酶对底物起作用，测定最终制备物的吸收值。吸收值变化大表明阳性的结果，即测试的猪血清具有抗Mhyo抗体，并受到该细菌感染。
实施例7本发明的抗原和序列在抗猪肺炎支原体感染疫苗中的应用(预期实施例)可采用本领域技术人员已知的标准方法来制备给予猪的本发明的疫苗。例如，可将所选多肽溶解在无菌盐水溶液中。为了长期保藏，可将多肽冻干，在给药前用无菌盐水溶液重建。在冻干前，可以加入防腐剂和其它标准添加剂，如提供体积的那些添加剂，如甘氨酸或氯化钠。相容的佐剂也可与疫苗一起给予。
本发明的疫苗也可用在实验动物(如家兔)中产生的抗本发明多肽的抗体来制得。然后，可将该“被动”疫苗给予猪，以防它们受Mhyo感染。还可将P102 DNA序列直接插入宿主细胞中，从而将该序列导入动物细胞内来体内表达该抗原。
以上的描述、附图和实施例仅仅描述了实现本发明目的、特征和优点的较佳实施方案。这并不意味着本发明局限于所描述的实施方案。在下列权利要求思路和范围内的任何改动均应被认为是本发明的一部分。
本专利要求的新的和希望受到专利保护的内容是
权利要求
1．一种蛋白质，它包含图1所示P102的氨基酸序列的至少一部分，并且具有天然猪肺炎支原体P102的抗原性。
2．根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含图1所示的整个P102氨基酸序列。
3．一种编码权利要求1所述蛋白质的DNA，其中所述DNA是重组或合成的DNA。
4．根据权利要求3所述的DNA，其中所述DNA与至少一个与合适的细菌宿主细胞相容的控制序列操作性相连。
5．一种细菌宿主细胞，它由权利要求3所述的DNA所转化，该DNA与至少一个与所述细菌宿主细胞相容的控制序列操作性相连，其中所述细菌宿主细胞能表达可检测量的由所述DNA编码的蛋白质。
6．一种保护易患病动物抵抗由猪肺炎支原体引起的地方性动物性肺炎的疫苗，该疫苗包含具有天然P102的抗原性的免疫原性蛋白，以及对所述免疫原性蛋白合适的载体。
7．根据权利要求6所述的疫苗，其中所述免疫原性蛋白质具有图1所示的氨基酸序列。
8．根据权利要求6所述的疫苗，其中所述免疫原性蛋白质由图2所示的DNA序列编码。
9．根据权利要求6所述的疫苗，其中所述免疫原性蛋白质具有的氨基酸序列包含图1所示氨基酸序列的至少一部分。
10．根据权利要求6所述的疫苗，其中所述免疫原性蛋白质由一DNA编码，该DNA序列包含图2所示DNA序列的至少一部分。
11．根据权利要求6所述的疫苗，其中所述动物是猪。
12．一种DNA，它在原核或真核宿主细胞中表达具有天然存在的P102之抗原性的多肽产物。
13．根据权利要求12所述的DNA，其中所述DNA选自图2的DNA、图3的DNA、图2 DNA的互补链、图3 DNA的互补链。
14．根据权利要求12所述的DNA，其中所述DNA与选自图2 DNA、图3 DNA、图2 DNA之互补链、图3 DNA之互补链的DNA杂交。
15．一种保护动物抵抗猪肺炎支原体引起的地方性动物性肺炎的方法，该方法包括给予动物一种疫苗，该疫苗包含的活性组分选自能引发识别猪肺炎支原体P102抗原的抗体的蛋白质、编码能引发识别猪肺炎支原体P102抗原之抗体的多肽的DNA，所述疫苗所包括的所述活性组分的量能有效地提供保护以抵抗猪肺炎支原体引起的地方性动物性肺炎。
16．根据权利要求15所述的方法，其中所述蛋白质是猪肺炎支原体P102。
17．根据权利要求16所述的方法，其中所述猪肺炎支原体P102是重组来源的。
18．根据权利要求16所述的方法，其中所述猪肺炎支原体P102由图2的DNA序列编码。
19．根据权利要求16所述的方法，其中所述猪肺炎支原体P102由一DNA序列编码，该DNA序列编码了具有图1氨基酸序列的蛋白质的至少一部分。
20．根据权利要求15所述的方法，其中所述DNA具有图2的DNA序列的至少一部分。
21．一种检测测试样品中存在P102抗体的方法，该方法包括下列步骤提供一份怀疑含有P102抗体的测试样品；在该测试样品中加入一定量的P102或其抗原性片段，加入的量足以使测试样品中的抗P102抗体产生可检测水平的酶活性；和进行一种蛋白试验，以检测测试样品中是否存在P102抗体。
22．一种用来检测测试样品中存在P102抗体的诊断性试剂盒，该试剂盒包含载体和至少一个容器，其中所述至少一个容器内含有标记的P102抗原。
全文摘要
本发明涉及重组DNA或合成方法制得的猪肺炎支原体蛋白,编码该蛋白的DNA序列,含有该DNA序列的表达载体和转化的宿主,基于该蛋白的疫苗,基于该DNA序列的疫苗,用该疫苗治疗猪以预防地方性动物性肺炎的方法,基于该蛋白或针对该蛋白所产生的抗体的诊断性试验,以检测猪群中存在Mhyo感染。
文档编号A61K48/00GK1301180SQ98812847
公开日2001年6月27日 申请日期1998年11月24日 优先权日1997年11月26日
发明者F·C·米尼恩, 舒昌达 申请人:衣阿华州立大学研究基金会股份有限公司