专利名称：：油菜茎基溃疡病菌的pcr检测方法及检测用引物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及农业和植物检疫
技术领域：
，具体涉及一种油菜茎基溃疡病菌的检测方法，尤其涉及一种油菜茎基溃疡病菌的PCR检测方法。此外，本发明还涉及检测油菜茎基溃疡病菌的引物。
背景技术：
：油菜莲基馈荡病菌I^ptosphaeriamaculans(艮L.maculans)禾口油菜黑Jg病菌Leptosphaeriabiglobosa(即L.biglobosa)是世界范围内引起油菜黑胫病的两种病原菌。这两种病菌的形态特征相近，但引起油茎部感染和基部溃疡的能力不同。油菜茎基溃疡病菌L.maculans致病力强，引起茎基部发病。油菜黑胫病菌L.biglobosa致病力较弱，一般引起茎中上部为害，L.maculans是导致油菜黑胫病严重流行和油菜产量损失的主要原因。目前，我国仅有L.biglobosa分布，但是油菜的国际贸易和种子资源交流十分频繁，我国每年都要从澳大利亚、乌克兰、加拿大等油菜茎基溃疡病发生国进境大量油菜籽，2009年我国进境油菜总量超过320万吨。因此，进境油菜籽中油菜茎基溃疡病菌的快速检测已经成为口岸检疫部门的新课题。目前油菜茎基溃疡病菌检测技术包括滤纸培养法和PCR方法，PCR以其快速、准确和灵敏的特点受到广泛应用。Taylor(TaylorandBorgman,1993)等根据一段重复序列设计特异引物，建立了检测强致病力菌株的PCR方法；Mahukuetal.(1995)从ITS序列设计引物来检测强毒力的L.maculans；1995年，Mahuku等曾设计了ITS区的特异引物HV17S/HV26C检测强毒力菌株(即油菜茎基溃疡病菌)(Mahukuetal.1995)，序列分析发现下游引物3’端与GenBank中部分油菜茎基溃疡病菌菌株的序列不能完全匹配。2006年，Liu等根据ITS序列设计了检测L.maculans的引物LmacF/LmacR(Liuetal.2006)，试验中应用该引物检测进境油菜籽样品时，部分样品的扩增容易出现假阳性的结果。此外，PCR反应的退火温度也影响扩增的特异性。国内的油菜黑胫病是由L.biglobosa引起，主要分布于浙江、安徽、湖北、湖南、四川和内蒙古等油菜主产省区。我国尚未发生油菜茎基溃疡病，其病原菌为检疫性有害生物L.maculans.两种病菌都以子囊壳和菌丝在病残株中越夏和越冬，抗逆性强。主要通过空气、病残体和种子传播，病残体和带菌种子是远距离传播的主要方式。目前，在全球变暖的大气候下，油菜茎基溃疡病还在欧洲、美洲、澳洲等地蔓延，给油菜产业带来巨大的损失。中国是世界最大的油菜生产国家，种植面积达700多万公顷，年产量1000万吨以上。且国内的油菜种植品种对油菜茎基溃疡病缺乏抗病性，油菜产区气候与国外该病流行地区相似。如果油菜茎基溃疡病菌传入我国，将会给我国的油菜生产带来毁灭性的打击。2009年8月以来，上海口岸已经从澳大利亚、乌克兰和加拿大等国进境的多批次油菜籽中截获油菜茎基溃疡病菌和油菜黑胫病菌。各地检疫部门应加强防范意识，积极有效的开展进境油菜籽的检疫。有关部门可采取预防措施进行监测和防控，此外，积极开展我国油菜和十字花科植物的抗性资源筛选，培育抗病品种，以应对生物安全隐患，保护我国油菜生产安全。
发明内容本发明要解决的技术问题在于提供一种油菜茎基溃疡病菌的PCR检测方法；为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一方面，提供一种油菜茎基溃疡病菌的PCR检测方法，包括如下步骤(1)设计引物，该引物的序列为Lmb3:5，-caccaattggatccccta-3，(SEQIDNO.1)或其互补链；Lmb45'-aggcgagtcccaagtggaaca-3，(SEQIDNO.2)或其互补链；(2)收集菌丝并提取DNA；(3)采用步骤⑴设计的引物分别进行PCR检测。步骤(2)中，所述收集菌丝并提取DNA具体为菌株用PDA培养基繁殖后收集菌丝，液氮研磨后取菌丝粉，用植物基因组提取试剂盒提取DNA。步骤(3)中，所述PCR检测的反应体系为30μL，包括3μL10XPCRBuffer、3μLdNTP、3yLMgCl2、步骤(1)上下游引物各0.5μL、1μL模板DNA、IUTaq聚合酶，加无菌水补至30μL。步骤(3)中，所述PCR检测的反应程序为94°C预变性3min;然后以94°C30s,56°C30s,72°C40s扩增30个循环；最后72°C延伸5min。在本发明的另一方面，提供一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的引物，其序列为Lmb3:5，-caccaattggatccccta-3‘(SEQIDNO.1)或其互补链；Lmb45'-aggcgagtcccaagtggaaca-3‘(SEQIDNO.2)或其互补链。目前，根据病菌的寄主专化性和地理来源的不同，L.maculans种下分为两个亚种^ML,^LtSL.maculanssubsp·brassicae禾口L·maculanssubsp.lepidii，|1]"胃的寄i为培芸薹属Brassicaspp.。为了针对性检测油菜等栽培芸薹属寄主上的L.maculanssubsp.brassicae，本发明根据Genbank中L.maculans的ITS序列，设计引物Lmb3/4特异性检测油菜籽样品中的有害生物L.maculanssubsp.brassicae，建立了L.maculans的PCR检测方法。对供试的58个菌株进行检测，试验结果表明，引物Lmb3/4可特异性检测L.maculans,且检测的灵敏度很高。引物Lmb3/4能扩增供试的22个L.maculans菌株，得到276bp的预期条带，供试的30个Lbiglobosa菌株以及6个相关种菌株没有扩增产物。检测灵敏度为4pg菌丝DNA，油菜籽样品的检测试验表明这种PCR方法可用于进境油菜籽样品中L.maculans的快速检测。图1是本发明实施例中PCR的检测灵敏度结果示意图；图2是本发明实施例中油菜籽样品的PCR检测电泳图。具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，或按制造厂商建议的条件。1材料方法1.1供试菌株试验用L.maculans和L.biglobosa部分菌株由本实验室(上海出入境检验检疫局)从加拿大、澳大利亚和乌克兰等国进境油菜籽样品中分离纯化，部分菌株由深圳、江苏和宁波出入境检验检疫局技术中心提供，国内Lbiglobosa菌株由安徽农科院李强生老师提供，菌株编号和来源见表1。表1试验菌株mmIi分离时间PCR反应IsolateCodeOriginYearPCRreactionL.maculanssubsp.8129-5澳大利亚Australia2009+brassicae8129-17澳大利亚Australia2009+8129-25澳大利亚Australia2009+6382-1澳大利亚Australia2009+6382-2澳大利亚Australia2009+6382-3澳大利亚Australia2009+8080-1乌克兰Ukraine2009+333-13乌克兰Ukraine2009+333-15乌克兰Ukraine2009+420-3乌克兰Ukraine2009+434-1乌克兰Ukraine2009+434-2乌克兰Ukraine2009+434-3乌克兰Ukraine2009+895-1加拿大Canada2009+3-4加拿大Canada2009+3-9加拿大Canada2009+3-20加拿大Canada2009+15-2加拿大Canada2009十15-3加拿大Canada2009+15-5加拿大Canada2009+17-2加拿大Canada2009+17-3加拿大Canada2009+J-4a加拿大Canada2009+J-Ila加拿大Canada2009+L.biglobosasubsp.6382-53澳大利亚Australia2009一brassicae6382-54澳大利亚Australia2009-7873-1乌克兰Ukraine2009-7873-2乌克兰Ukraine2009-6555-1乌克兰Ukraine2009-6555-2乌克兰Ukraine2009一1602-1乌克兰Ukraine2009-1602-2乌克兰Ukraine2009-333-10乌克兰Ukraine2009一333-14乌克兰Ukraine2009-337-3乌克兰Ukraine2009-337-4乌克兰Ukraine2009—420-1乌克兰Ukraine2009—431-1乌克兰Ukraine2009一434-4乌克兰Ukraine2009一726-2c日本Japan2009—Gs5-5d中国贵州Guizhou，China2008—Gj2-2d中国贵州Guizhou，China2008—Ah9-4d中国安徽Anhui,China2008—Ahl2-2d中国安徽Anhui,China2008—Ahl9-3d中国安徽Anhui,China2008—L.biglobosasubsp.3-2加拿大Canada2009一canadensis3-12加拿大Canada2009-17-1加拿大Canada2009-17-4加拿大Canada2009-15-4加拿大Canada2009-15-16加拿大Canada2009—895-3加拿大Canada2009-895-4加拿大Canada2009—9268-39"加拿大Canada2009—9268-46b加拿大Canada2009一L.biglobosasubsp.17-11加拿大Canada2009—australiensis337-2乌克兰Ukraine2009一341-1乌克兰Ukraine2009-Alternariasp.8129-84澳大利亚Australia2009—3-3加拿大Canada2009-A.alternaria333-3乌克兰Ukraine2009—A.brassicae333-11乌克兰Ukraine2009—333-18乌克兰Ukraine2009-Phomasp.8129-92澳大利亚Australia2009一表1中，+表示positivereaction(阳性反应)；-表示negativereaction(阴性反应)；a江苏出入境检验检疫局吴翠萍提供；b深圳出入境检验检疫局程颖慧提供；c宁波出入境检验检疫局张建成提供；d安徽农科院李强生提供。1.2供试引物根据GenBank中L.maculans及其近缘种ITS序列差异，设计了L.maculans的特胃生弓LLmb3(5，-caccaattggatccccta-3‘)/Lmb4(5‘-aggcgagtcccaagtggaaca-3‘),ψ增产物片段大小分别为276bp。引物委托上海生工生物技术服务有限公司合成。1.3菌丝收集及DNA提取供试菌株转移至PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基，每升培养基含有马铃薯200g，蔗糖20g和琼脂17g)繁殖后收集菌丝，液氮研磨后取0.Ig菌丝粉，用植物基因组提取试剂盒(TIANGENBIOTECH公司，DP305-02)提取DNA。1.4引物特异性测试PCR试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司(Takara)。用引物Lmb3/4扩增供试的菌株DNA，PCR反应体系为30μL(Takara)，包括3μL10XPCRBuffer,3μLdNTP(各250μΜ)、3μMgCl2(25mM)、上下游引物(5μΜ)各0.5yL、lyL模板DNA、1UTaq聚合酶，加无菌水补至30μL。PCR反应程序为94°C预变性3min；然后以94°C30s,56°C30s,72°C40s扩增30个循环；最后72°C延伸5min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶IXTAE缓冲液中电泳，EB染色后用凝胶成像系统分析。1.5引物灵敏度测试将编号为8129-5的L.maculan菌株的DNA测定核酸浓度后分别系列稀释10、102、IO3UO4倍，用引物Lmb3/4进行PCR扩增，测试PCR的检测灵敏度。1.6进境油菜籽样品的检测从乌克兰进境油菜籽样品(样品编号333)中挑取变色、畸形或皱缩种子，分别以50,10,5粒和1粒为一个样品，各准备30份样品。样品液氮研磨后提取DNA，每份样品DNA取IyL进行PCR检测。2结果与分析2.1引物特异性测试供试58个菌株DNA用引物Lmb3/4进行PCR扩增，引物Lmb3/4可以扩增22株供试的L.maculans菌株DNA，得到276bp的预期扩增产物，供试的其他菌株DNA和空白对照没有扩增条带(表1)。试验结果表明，引物Lmb3/4可特异性检测L.maculans.2.2引物灵敏度测试引物Lmb3/4扩增不同系列稀释度编号为8129-5的L.maculan菌株的菌丝DNA，4ng、400pg和40pg的DNA可以扩增得到预期条带，4pg的DNA未出现预期条带(图1)；图1中，M.是MarkersDL2000(Takara)100，250，500，750，1000，2000bp；14表示编号为8129-5的L.maculan菌株的4ng，400pg,40pg,4pgDNA；试验结果表明，引物Lmb3/4的检测灵敏度为4pg菌丝DNA。2.3油菜籽样品的PCR扩增进境油菜籽样品中的疑似染病种子分别以10、5、1粒为一个试验样品，提取DNA后进行PCR检测。如表2所示，检测结果表明，PCR方法对1粒、5粒和10粒油菜籽样品的阳性检出率分别为10%、23.3%和40%。油菜籽样品的PCR检测电泳结果如图2所示，图2中，M表示MarkersDL2000(Takara)100，250，500，750，1000，2000bp；13表示PCR对10粒，5粒，1粒的检测；4表示L.maculans的DNA；5表示L.biglobosa的DNA；6表示无DNA模板。表2油菜籽样品的PCR检测<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3讨论根据病菌的寄主专化性和地理来源的不同，目前认为油菜黑胫病菌L.biglobosa种下包括六个亚种(Mendes-Pereiraetal.2003；Voigtetal.2005；Vincenotetal.2008)，^L.biglobosasubsp.brassicae,寄i为I属Brassicaspp.；L.biglobosasubsp.thlaspii,寄主为薪寞(遏蓝菜)Thlaspiarvense；L.biglobosasubsp.erysimii,寄主为H芥属Erysimumsp.；L.biglobosasubsp.canadensis；L.biglobosasubsp.australiensis禾口L.biglobosasubsp.occiaustralensis。油菜苯基馈荡病菌L.maculans禾中下包括两个亚禾中，包括L.maculanssubsp.brassicae,寄主为栽培芸薹属Brassicaspp.；L.maculanssubsp.Iepidii,寄主为独行菜属Lepidiumspp.(Mendes-Pereiraetal.2003；Voigtetal.2005；Vincenotetal.2008).o试验中从澳大利亚、乌克兰和加拿大等进境油菜籽样品中分离的100余个油菜茎基溃疡病菌分离物经测序和序列分析，所有分离物均与L.maculanssubsp.brassicae的序列高度相似，相似性为99.8%。同时分离的100余个油菜黑胫病菌分离物形包含了L.biglobosasubsp.brassicae>L.biglobosasubsp.canadensis禾口L·biglobosasubsp.australiensis等三个亚种。试验所设计的L.maculans特异性引物是针对性检测亚种L.maculanssubsp.brassicae,该亚种主要分布在欧洲、加拿大、澳大利亚和新西兰等地，寄主植物包括甘蓝型油菜Brassicanapus、甘蓝B.oleracea、芥菜B.juncea，和甜菜Betavulgaris(Mendes-Pereiraetal.2003)。试验中病原菌的分离是从PCR初检阳性的油菜籽样品中挑取变色、畸形或皱缩等异常种子表面消毒后进行培养，分离到病菌的可能性高于随机取样，挑取种子样品和随机样品的PCR检测结果也证实了这种可能性；另一方面，种子样品在表面消毒的过程中，附着在种子表面的病菌菌丝等被有效杀灭失活，因此，挑取样品中分离到病菌的概率并不能真实代表原始样品中种子携带病菌的概率。从分离病菌的结果看，澳大利亚进境油菜籽样品分离成功率为2.0-2.6%；乌克兰进境油菜籽样品分离成功率为0-2.6%；加拿大进境油菜籽样品分离成功率为0-0.3%。总体上，加拿大进境油菜籽样品中种子携带油菜茎基溃疡病菌的概率小于澳大利亚和乌克兰样品。由于试验样品经过初步筛选，样品中油菜籽的实际带菌率应该低于此值。每个试验样品的带菌量不同，且处于比较低的水平，1粒油菜籽种子即使带菌，含量也非常有限，常规PCR不易检测出来，试验中检测了30份1粒种子的样品，仅能检测出6个阳性，且扩增条带弱。权利要求一种油菜茎基溃疡病菌的PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤(1)设计引物，该引物的序列为Lmb35’-caccaattggatccccta-3’(SEQIDNO.1)或其互补链；Lmb45’-aggcgagtcccaagtggaaca-3’(SEQIDNO.2)或其互补链；(2)收集菌丝并提取DNA；(3)采用步骤(1)设计的引物进行PCR检测。2.如权利要求1所述的油菜茎基溃疡病菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述收集菌丝并提取DNA具体为菌株用PDA培养基繁殖后收集菌丝，液氮研磨后取菌丝粉，用植物基因组提取试剂盒提取DNA。3.如权利要求1所述的油菜茎基溃疡病菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述PCR检测的反应体系为30μL，包括3μL10XPCRBuffer、3yLdNTP,3yLMgCl2、步骤(1)上下游引物各0.5μL、1μL模板DNA、IUTaq聚合酶，加无菌水补至30μL。4.如权利要求1或3所述的油菜茎基溃疡病菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述PCR检测的反应程序为94°C预变性3min；然后以94°C30s,56°C30s,72°C40s扩增30个循环；最后72°C延伸5min。5.一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的引物，其特征在于，其序列为Lmb3:5，-caccaattggatccccta-3，(SEQIDNO.1)或其互补链；Lmb4:5，-aggcgagtcccaagtggaaca-3，(SEQIDNO.2)或其互补链。全文摘要本发明公开了一种油菜茎基溃疡病菌的PCR检测方法及检测用引物，根据油菜茎基溃疡病菌L.maculans与其近似种ITS序列的差异，设计了检测L.maculans的特异性引物Lmb3(5’-caccaattggatccccta-3’)/Lmb4(5’-aggcgagtcccaagtggaaca-3’)，建立了L.maculans的PCR检测方法。该方法的检测灵敏度为4pg菌丝DNA，油菜籽样品的检测试验表明这种PCR方法可用于进境油菜籽样品中油菜茎基溃疡病菌L.maculans的快速检测。文档编号C12N15/11GK101805793SQ201010142440公开日2010年8月18日申请日期2010年4月8日优先权日2010年4月8日发明者周国梁,尚琳琳,易建平申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局