专利名称：：菲律宾实蝇的实时荧光pcr检测方法及检测用引物和探针的制作方法
技术领域：
：本发明涉及林业和植物检疫
技术领域：
，具体涉及一种菲律宾实蝇的检测方法；尤其涉及一种菲律宾实蝇的实时荧光PCR检测方法；此外，本发明还涉及检测菲律宾实蝇的引物和探针。
背景技术：
：菲律宾实蠅Bactroceraphilippinensis属双翅目(Diptera)、实蝇科(T印hritidae)、离腹寡毛实蝇属(Bactrocera)。主要分布在菲律宾等东南亚国家，寄主主要有木菠萝，木瓜，蒲桃，芒果，桃榄等水果类经济作物。在其分布区给水果生产造成严重损失，被列入《中国进境植物检疫性有害生物名单》。由于我国与东南亚各国新鲜水果贸易量的日益增加，菲律宾实蝇随贸易水果传入我国、造成危害的风险逐渐增大，成为我国植物检疫部门关注的重点有害生物之一。在口岸入境新鲜水果检疫中截获菲律宾实蝇的虫态多为卵、幼虫或蛹，菲律宾实蝇与其同属的桔小实蝇B.dorsalis、杨桃实蝇B.carambolae和木瓜实蝇B.papayae形态特征非常相近，卵、幼虫和蛹更是无法用形态分类方法加以区分。在实际检疫中，是将截获的幼虫等饲养到成虫才能进行种类鉴定，饲养时间一般需要10-20天，给入境新鲜水果贸易带来严重影响。因此，寻求快速、准确的鉴定方法是现阶段检疫技术亟待解决的问题和发展的方向。余道坚等(2004)报道了用PCR法检疫鉴定番石榴实蝇B.correcta,目前还未见有利用分子生物学方法对菲律宾实蝇进行种类鉴定的报道。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种菲律宾实蝇的实时荧光PCR检测方法；为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物和探针。利用菲律宾实蝇检测引物及探针可以快速、准确地对菲律宾实蝇进行检测鉴定。本发明根据桔小实蝇、木瓜实蝇、杨桃实蝇和菲律宾实蝇(GenBank编号分别为DQ917577,DQ917578,EF014414,DQ995281)这几个近似种的mtDNA中部分cob-nadhl基因的序列设计特异性引物和探针，建立了菲律宾实蝇的实时荧光PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定菲律宾实蝇的目的。在本发明的一方面，提供一种菲律宾实蝇的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤(1)设计引物和探针；该引物的序列为上游引物G-FP:5，-CGGGCTGTGGCACAAACTAT-3，(SEQIDNO.1)或其互补链；下游引物G-RP:5，-AACTCCGATTCACCTTCTGCAA-3，(SEQIDN0.2)或其互补链；该探针的序列为菲律宾实蝇探针G-MGB:FCATTAGTTTTATTATCCTTTGTATTTP(SEQIDΝ0·3)或其互补链；(2)提取菲律宾实蝇DNA；(3)采用步骤⑴设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。步骤(2)具体为取菲律宾实蝇单头虫样放入研钵，加液氮磨成粉末状，用试剂盒提取样品DNA。步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为25μL，包括5XrealtimePCRBuffer5uL,Mg2+solution0.5uL,dNTPmixture0.75uL,TaKaRaEx-TaqHS0.25uL,/^骤(1)设计的上下游引物G-FP/RP各0.5uL，TaqMan-MGB探针0.6uL，DNA模板0.5uL，超纯水补至25uL。步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为50°C2min，预变性95°CIOmin；然后95°C15sec，60°CImin循环40次。在本发明的另一方面，提供一种用于检测菲律宾实蝇的引物，其序列为上游引物G-FP:5，-CGGGCTGTGGCACAAACTAT-3，(SEQIDNO.1)或其互补链；下游引物G-RP:5，-AACTCCGATTCACCTTCTGCAA-3，(SEQIDNO.2)或其互补链。在本发明的另一方面，提供一种用于检测菲律宾实蝇的探针，其序列为G-MGB=FCATTAGTTTTATTATCCTTTGTATTTP(SEQIDNO.3)或其互补链。上述实时荧光PCR检测方法采用MGB(全称为MinorGrooveBinder)探针。MGB探针一是在探针的3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子，以取代常规可发光的TAMRA荧光标记；二是探针的3’端另结合了Minorgroovebinder结合物，使探针的Tm值提高，大大增加了探针的杂交稳定性。该方法具有如下优点1、更容易设计；2、探针更短3、提高配对与司E配对模板间的Tm值差异；4、实验结果更精确、分辩率更高；5、杂交的稳定性提高；6、低背景；7、重复性更强。该方法适合病原体的检测、SNP和突变体检测，既可以进行基因定量分析，又可以进行基因突变分析。与现有技术相比，本发明的有益效果在于1、检测时间大大缩短，可以在八个小时内完成检测，传统的常规方法需10-20天；2、对菲律宾实蝇的鉴定准确率增大，传统的常规方法还需要其他详细产地等信息支持才能鉴定。图1是本发明的引物G-FP/G-RP和探针G-MGB在菲律宾实蝇(DQ995281)上的位置示意图；图2是四种实蝇(菲律宾实蝇DQ995281，桔小实蝇DQ917577，杨桃实蝇EF014414，木瓜实蝇DQ917578)序列在探针位置的比对示意图；图3是不同来源的6个菲律宾实蝇样品实时荧光PCR扩增的结果示意图。具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork=ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述条件，或按制造厂商所建议的条件。实施例11.设计引物和探针根据桔小实蝇、木瓜实蝇、杨桃实蝇和菲律宾实蝇(GenBank编号分别为DQ917577,DQ917578,EF014414,DQ995281)这几个近似种的mtDNA(线粒体DNA)中部分cob-nadhl基因的序列设计如下特异性引物G-FP/RP和探针G-MGB(引物和探针由上海基康公司合成)上游引物G-FP:5，-CGGGCTGTGGCACAAACTAT-3，；下游引物G-RP:5，-AACTCCGATTCACCTTCTGCAA-3，；菲律宾实蝇探针G-MGBFCATTAGTTTTATTATCCTTTGTATTTP上述引物及探针的检测原理如图1所示，四种实蝇(菲律宾实蝇DQ995281，桔小实蝇DQ917577，杨桃实蝇EF014414，木瓜实蝇DQ917578)序列在探针位置的比对见图2。2、提取菲律宾实蝇DNA取菲律宾实蝇单头虫样(样品来源见表1)放入研钵，加液氮磨成粉末状，用DNeasyTissueKit(Qiagen公司)提取样品DNA。表1菲律宾实蝇样品信息<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>SH65由广东出入境检验检疫局梁帆研究员赠送。3、实时荧光PCR检测实时荧光PCR扩增体系25uL(大连宝生物公司TaKaRareal-timePCRcorekit):5XrealtimePCRBuffer(Mg2+free)5uL,Mg2+solution(250mmol/L)0.5uL,dNTPmixture(各lOmmol/L)0.75uL,TaKaRaEx-TaqHS(5U/uL)0.25uL,上下游引物G-FP/RP(10umol/L)各0.5uL，TaciMan-MGB探针(5umol/L)0.6uL，DNA(1020ng/uL)模板0.5uL,超纯水补至25uL，实时荧光PCR扩增在ABIPRISM7700定量PCR扩增仪上进行。打开SequenceDetection1.71，设置PCR反应条件，两步法扩增反应程序:50°C2min，预变性95°CIOmin；然后95°C15sec，60°CImin循环40次。点击运行，进行PCR反应，Ih56min反应结束，保存文件，打开分析软件，仪器自动分析实验结果，给出△Rn(第η个循环时的荧光增加值)与循环数图像。检测结果如图3所示，在图3中，有6条上升的曲线(数字1-6曲线)，数字1_6曲线表示的样品详细信息如表1所示。在图3中，1表示样品编号为SH102的菲律宾实蝇样品，2表示样品编号为SH104的菲律宾实蝇样品，3表示样品编号为SH126的菲律宾实蝇样品，4表示样品编号为SH103的菲律宾实蝇样品，5表示样品编号为SH114的菲律宾实蝇样品，6表示样品编号为SH65的菲律宾实蝇样品，7表示没有模板DNA的阴性对照。由图3表明此次实时荧光PCR检测到的是菲律宾实蝇，表明引物G-FP/RP和探针G-MGB可以特异性检测菲律宾实蝇。权利要求一种菲律宾实蝇的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤(1)设计引物和探针；该引物的序列为上游引物G-FP5’-CGGGCTGTGGCACAAACTAT-3’(SEQIDNO.1)或其互补链；下游引物G-RP5’-AACTCCGATTCACCTTCTGCAA-3’(SEQIDNO.2)或其互补链；该探针的序列为菲律宾实蝇探针G-MGBFCATTAGTTTTATTATCCTTTGTATTTP(SEQIDNO.3)或其互补链；(2)提取菲律宾实蝇DNA；(3)采用步骤(1)设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。2.如权利要求1所述的菲律宾实蝇的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤(2)具体为取菲律宾实蝇单头虫样放入研钵，加液氮磨成粉末状，用试剂盒提取样品DNA。3.如权利要求1所述的菲律宾实蝇的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为25μL，包括5XrealtimePCRBuffer5uL，Mg2+solution0.5uL，dNTPmixtureO.75uL,TaKaRaEx-TaqHSO.25uL，步骤(1)设计的上下游引物G-FP/RP各0.5uL,TaqMan-MGB探针0.6uL,DNA模板0.5uL,超纯水补至25uL。4.如权利要求1或3所述的菲律宾实蝇的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤⑶中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为50°C2min，预变性95°ClOmin;然后95°C15sec，60°CImin循环40次。5.一种用于检测菲律宾实蝇的引物，其特征在于，其序列为上游引物G-FP:5，-CGGGCTGTGGCACAAACTAT-3，(SEQIDNO.1)或其互补链；下游引物G-RP:5，-AACTCCGATTCACCTTCTGCAA-3，(SEQIDNO.2)或其互补链。6.一种用于检测菲律宾实蝇的探针，其特征在于，其序列为G-MGB:FCATTAGTTTTATTATCCTTTGTATTTP(SEQIDNO.3)或其互补链。全文摘要本发明公开了一种菲律宾实蝇的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针，根据桔小实蝇、木瓜实蝇、杨桃实蝇和菲律宾实蝇(GenBank编号分别为DQ917577，DQ917578，EF014414，DQ995281)这几个近似种的mtDNA中部分cob-nadh1基因的序列设计特异性引物G-FP/RP(上游引物SEQIDNO.1所示序列，下游引物SEQIDNO.2所示序列)和探针G-MGB(SEQIDNO.3所示序列)，建立了菲律宾实蝇的实时荧光PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定菲律宾实蝇的目的。文档编号C12N15/11GK101805792SQ20101014242公开日2010年8月18日申请日期2010年4月8日优先权日2010年4月8日发明者叶军,房蕊,易建平申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局