专利名称：：一种人源中和性抗禽流感病毒h5n1基因工程抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及预防和治疗用人源基因工程抗体的制备及应用，尤其是特异性针对高致病性禽流感病毒H5N1，具有中和禽流感病毒感染功能的我国禽流感恢复期病人来源的中和性抗禽流感病毒基因工程抗体。
背景技术：
：高致病性禽流感(Highlypathogenicavianinfluenza,HPAI)是由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的禽类烈性传染病。高致病性禽流感病毒H5N1自1997年发生18人感染6人死亡疫情以来，一直受到国际社会的高度关注，特别是自2003年以来高致病禽流感病毒H5N1动物疫情在亚洲已成地方性流行，并且已经蔓延到欧洲和非洲。人感染病例以及发生人感染病例的国家和地区不断扩大，2003年底以来，截止2007年4月11日，全球新发人禽流感(H5N1)病例数已上升至291例，其中死亡172例。我国自2003年11月第一例禽流感病毒H5N1感染病例确诊以来一共有24例，其中15例死亡。高致病性禽流感病毒H5N1突破了种属屏障不仅对禽类带来巨大威胁，严重影响国家的经济发展，而且对人类健康也带来巨大的威胁，会不会由H5N1禽流感病毒导致一次流感大流行已引起全球的高度关注。流感病毒是一种球形或杆状、有包膜的单股负链RNA病毒，基因组分为8个节段。病毒囊膜表面的跨膜糖蛋白血凝素蛋白(HA)和神经氨酸酶蛋白(NA)是流感病毒的主要免疫原性抗原。HA识别靶细胞表面受体并与受体相结合，具有与宿主细胞膜融合活性，能够诱导机体产生保护性中和抗体。由于HA基因突变而引起的HA抗原变异往往会导致免疫失败和变异毒株流行，流感病毒频繁并且持续的发生抗原性变异，目前还没有有效的人用禽流感疫苗，也没有有效的治疗药物。作为一类新型特异性抗病毒感染的生物工程制剂，中和性抗体在抗感染治疗及紧急被动免疫预防方面一直扮演着重要的角色。因此，研制特异性针对H5N1禽流感病毒的中和性抗体尤其是针对不同H5N1分离株具有广谱中和效应的抗体以用于紧急预防和治疗是十分必要和可行的。通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源及人源抗体，使对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际运用前景。80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术兴起和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，使当今世界人源或基因工程抗体的丌发研究取得很大进展并巳由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。含有特异性抗体的人源或动物血清免疫球蛋白用以预防和治疗传染病已历史悠久。而人源基因工程抗体的发展，给这一领域的生物制品发展带来了新的希望和远大前景。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护肌体抵抗病毒攻击已获得许多实验证明，如鼠抗甲肝病毒、汉坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性单克隆抗体可以在体内100%保护动物免受病毒攻击，我们相信特异性中和抗体对高致病性禽流感病毒H5N1应当具有良好的预防和治疗效应。人源抗病毒基因工程抗体，尤其是人源全抗体的研究成功，给各种病毒性传染病的特异性预防和治疗带来了新的希望，在抗病毒感染生物药领域逐渐形成了一类新的抗病毒药，即所谓的抗体药(AntibodyDrug)。
发明内容本发明的目的是通过基因工程手段和噬菌体表面表达技术结合运用，直接从人抗体基因库中筛选出抗高致病性禽流感病毒H5N1的基因工程单克隆抗体，获得其抗体基因，为将来可能的临床抗病毒预防和治疗提供可行性的特异性抗体药物。本发明运用噬菌体表面呈现技术，从中国安徽某禽流感病人恢复期血中获得淋巴细胞，通过基因工程手段构建了人源抗H5N1禽流感病毒基因工程抗体文库，并筛选获得特异抗禽流感病毒基因工程抗体Fab段及其全抗体。本发明的人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗体包括1、两株Fab抗体，分别命名为AVFluFabl和AVFluFab3。这两株重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定的，并在原核细胞中获得有效表达的特异性结合高致病性禽流感病毒H5N1的功能性抗体。它们特异性识别H5N1高致病性禽流感病毒颗粒抗原，且均针对禽流感病毒血凝素蛋白HA，与禽流感病毒H5N1具有明显的免疫荧光反应(IFA)和酶联免疫(ELISA)反应，具有抗禽流感病毒H5N1感染的中和活性功能。AVFluFabl和AVFluFab3特异性的轻链和重链可变区基因来源于对人源抗高致病性禽流感病毒H5N1抗体基因库的特异性富积筛选，该抗体库的建立来源于中国安徽H5N1禽流感恢复期病人血淋巴细胞基因。其轻链和重链可变区相应的三个CDR区序列组合及其CDR区之间框架区序列组成了每个抗体可变区序列特征，AVFluFabl和AVFluFab3分别隶属于抗体重链家族VH4和VH3，抗体轻链家族VL2和VL1。抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列及其互补所决定，6个相应的CDR区氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，决定本专利申请中每个抗体的抗原结合特征和抗高致病性禽流感病毒H5N1功能特征。决定每株中和抗体功能的抗体轻链和重链可变区氨基酸详细序列及其比较结果如图1所示，图中"-"符号表示与第一行抗体序列相同的氮基酸，阴影部分为CDR区。AVFluFabl轻链可变区的基因序列如SEQIDN0.5所示，重链可变区的基因序列如SEQIDN0.6所示。AVFluFab3轻链可变区的基因序列如SEQIDN0.7所示，重链可变区的基因序列如SEQIDNO.8所示。根据本发明的抗高致病性禽流感病毒H5N1中和抗体AVFluFabl和AVFluFab3可变区中特异性核苷酸或氨基酸序列，可在体外人工合成与此相同的抗体轻重链基因的核苷酸序列或编码相同氨基酸的核苷酸序列，从而获得相同的抗体基因或用于相关基因的改造，而获得抗高致病性禽流感病毒中和抗体或相关蛋白或多肽产物。2、两株全抗体，分别命名为AVFluIgGl和AVFluIgG3。将上述2株Fab抗体(AVFluFabl、AVFluFab3)的轻链和重Fd段基因，分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc并转染昆虫Sffl细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现了全抗体的分泌型表达，得到全抗体AVFluIgGl和AVFluIgG3。用ELISA、IFA、WesternBlot和流式细胞术对所获人源单抗的功能特性进行鉴定。结果表明这是2株特异性针对H5N1禽流感病毒而与甲1型和甲3型人流感病毒无交叉反应的人源单抗。2株抗体均针对H5N1禽流感病毒血凝素蛋白HA，其中AVFluIgGl可分别与变性的灭活病毒及重组HA反应，而AVFluIgG3并不与之反应。这提示AVFluIgGl所针对的HA的抗原决定簇为线性抗原决定簇，而AVFluIgG3所识别的抗原决定簇是构象依赖型的。此外，这2株抗体对亚洲中国地区南方和北方的H5N1禽流感病毒人源分离株均具有较高并且广泛的中和活性，其中AVFluIgG3的中和活性更高也更为广谱，对于中国目前已分离的8株H5N1禽流感病毒人源分离株均具有中和活性，且针对其中某些地方分离株可在纳克级水平中和病毒，对于为疫苗研制提供有效的候选表位具有重大意义。本发明在国际上首次获得两株具有中和活性的抗禽流感病毒H5Nl单克隆抗体Fab段，并在真核系统中表达了其全抗体，这一结果的获得不仅为高致病性禽流感病毒H5N1的预防和治疗带来了希望，同时也为其疫苗研制提供了新的思路。利用上述获得的人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗体可变区基因、Fab抗体基因以及上述每个抗体基因特征下的全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产此抗体或以此为基础的改建后的含有此抗体基因的任何其他基因，获得具有中和高致病性禽流感病毒H5N1感染的抗体产物，制成临床上用于预防和治疗由H5N1禽流感病毒引起的人禽流感的特异性抗体药物，从而可在临床上用于预防和治疗由禽流感病毒H5N1引起的人感染禽流感。基于上述工程抗体基因及其直接或间接的基因产物，可制成喷雾型抗体制剂和注射型抗体制剂用于人感染H5N1高致病性禽流感的预防和治疗。图1是本发明抗禽流感病毒H5N1人源Fab抗体可变区氨基酸序列比较图。图2是3轮富集后ELISA检测得到的45株人源Fab抗体的表达情况图。图3A是用ELISA检测表达的45株人Fab抗体对禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)的特异性结合情况图3B是用ELISA检测表达的45株人Fab抗体对重组HA(A/Vietnam/1203/2004)的特异性结合情况图。图4是抗禽流感病毒H5Nl人源Fab单抗与禽流感病毒及重组HA的免疫荧光反应结果，其中A、B、C、D分别为阳性血清、阴性抗体、AVFluFabl、AVFluFab3与重组HA(A/Anhui/l/2005)反应结果；E、F、G、H分别为阳性血清、阴性抗体、AVFluFabl、AVFluFab3与禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)反应结果。图5是纯化后IgG的SDS-PAGE电泳图。图6A是ELISA检测纯化人源IgG抗体对纯化禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)的特异性结合情况图6B是ELISA检测纯化人源IgG抗体对重组HA(A/Vietnam/1203/2004)的特异性结合情况图。图7是用Westernblot分析抗禽流感病毒H5N1人源IgG单克隆抗体特异性的结果，其中A，与纯化病毒(A/Anhui/l/2005)反应；B，与重组杆状病毒表达HA(A/Anhui/1/2005)反应。图8是用流式细胞间接荧光分类法(FACS)分析人源IgG抗体对禽流感抗原特异性结合情况图，其中A、B、C、D分别为阳性血清、阴性抗体、AVFluIgGl、AVFluIgG3与表达重组HA(A/Anhui/l/2005)的Sf9细胞反应结果。图9A是微量中和试验检测纯化的AVFluIgGl抗体对中国H5Nl禽流感病毒人源分离株6的中和活性结果；图犯是微量中和试验检测纯化的AVFluIgG3抗体对中国H5Nl禽流感病毒人源分离株的中和活性结果。具体实施例方式以下的优先实施例对本发明作详细说明，但不意味着限制本发明的内容。运用噬菌体表面呈现技术，从中国安徽某禽流感病人恢复期血中获得淋巴细胞，通过基因工程手段，构建了人源抗H5N1禽流感病毒基因工程抗体文库。用纯化灭活的人源H5N1安徽分离株(A/Anhui/l/2005)对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选，并在￡.co/z'中进行分泌表达。通过ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定Fab抗体对H5N1禽流感病毒特异性结合的功能活性，并进行序列测定。然后将阳性克隆的轻链和重链Fd段基因，分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc转染昆虫S细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达。用ELISA、IFA、WesternBlot和流式细胞术对所获人源单抗的功能特性进行鉴定。材料与方法1.病毒、细胞、载体和抗原制备人源H5N1分离株A/Anhui/1/2005、A/Guangxi/1/2005、A/Hunan/1/2006、A/Zhejiang/1/2006、A/Sichuan/1/2006、A/Fujian/1/2005、A/Guangdong/1/2006、A/xinjiang/1/2006由中国疾病预防控制中心病毒病预防控中所流感室提供。菌株为XLI-Blu(美国Stratagene);噬菌体表达载体为pComb3(40kb)，由美国Scripps研究所馈赠；所用噬菌体为VCSM13(美国Invitrogene公司)。杆状病毒表达载体为pAC-L-Fc(德国PROGENPR3003)(Liang,M.F.,Stefan,D.,Li，D.X.,Queitsch,L，UW.,andBautz,E.F.BaculovirusexpressioncassettevectorsforrapidproductionofcompletehumanIgGfromphagedisplayselectedantibodyfragments.JournalofImmunologicalMethods.247:119-130.)，昆虫细胞Sf9及MDCK细胞来自美国细胞培养中心(ATCC)。其中筛库抗原为A/Anhui/1/2005(H5N1)感染MDCK细胞，经甲醛灭活和安全检査后密度梯度超速离心纯化病毒颗粒。纯化的杆状病毒系统表达重组血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)购自美国蛋白科学公司(ProteinSciencesCorp.)。真核表达的重组禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)由本研究室构建并表达PCR扩增禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)基因序列，将其克隆入杆状病毒表达载体pAcUW51(美国BDPharmingen),通过将重组质粒转染昆虫细胞制备重组杆状病毒进行蛋白表达。2.噬菌体抗体库的构建用淋巴细胞分离液(美国Sigma)从安徽疫区禽流感病人恢复期抗凝血中分离淋巴细胞，用RNeasyMiniKit(德国QIAGEN)提取总细胞RNA，用Oligo-dT引物将提取的RNA采用Invitrogen公司的第一链合成试剂盒(SuperScriptTMlIIFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR.CatNo.18080-05l)逆转录成cDNA,用一组扩增人源抗体IgGl重链Fd及轻链Kappa和Lambda的引物对人源轻链和重链Fab基因进行PCR扩增。PCR条件为94°Cl分钟，54°Cl分钟，72'C2分钟，35个循环。上述PCR产物分别经琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化试剂盒QIAquickTMkit(德国QIAGEN公司)纯化后，获得650—700bp左右的Kappa、Lambda和Fd链PCR产物。建库方法参见文献Barbas,C.FIII.,Kang,A.S.，andlarner,R.A.Assemblyofcombinatorialantibodylibrariesonphagesurface:thegeneIIIsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991;88(18):7978-7982。将不同引物合成的Kamba和Lamda链PCR产物混合，将不同引物合成的Fd链混合，分别用SacI/Xbal和XhoI/Spel克隆入噬菌体载体pComb3，将克隆入轻、重链基因的pComb3载体DNA连接产物经乙醇沉淀后，用10pl蒸溜水悬起，电转导入事先制备好的200pl电转菌XLI-Blu(电转条件为Bio-Red电转仪，0.2cm电转杯，2.5K伏)，电转后加10mlSOC培养液，37°C1小时，力卩入10ml带有氨节青霉素和四环素的SB培养液37。C培养1小时，加入80-100ml前述SB，37°C2小时后加入辅助噬菌体VCSM131X1012，l小时后加入卡那霉素(70pg/ml)，37。C摇床培养过夜。用4%PEG8000和3XNaCl沉淀噬菌体上清，经9000rpm，20分钟，4。C离心后，用2ml0.02MPBSpH7.4重悬沉淀，建立噬菌体抗体库，分装保存于-20。C冰柜中。3.用于抗体库富集筛选的H5N1禽流感病毒抗原的制备在生物安全三级实验室生物安全柜中操作，使用m级生物安全防护。扩增毒株为A/Anhui/1/2005(H5N1)，将病毒原液作梯度稀释为10"，l(T2，l(T3，104待用。将生长状态良好的MDCK细胞(细胞贴壁达80%)倒出细胞生长液，用Hank氏液清洗细胞2-3遍。分别将不同稀释度的病毒稀释液lml感染MDCK细胞，35'C吸附lh，吸附完成后，用Hank氏液清洗细胞2-3遍，在培养瓶中加入维持液，至35t:培养。待感染细胞有70%-80%出现病变进行收获，收获之前将细胞冻融l-2次，收获上清，进行红细胞凝集试验(HA)测定血凝滴度。经甲醛灭活后，感染MDCK细胞，盲传三代确定已完全灭活，进行蔗糖垫层超速离心纯化。4.噬菌体抗体库的富集筛选筛选抗原为超速离心纯化的灭活H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/2005)和纯化的杆状病毒系统表达重组血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)，使用时用0.1MNaHC03(PH8.6)的溶液稀释，包被96孔酶标板。富集筛选方法基本按文献进行(Barbas，C.Fill.,Kang:A.S.，andlarner,R.A.Assemblyofcombinatorialantibodylibrariesonphagesurface:thegeneIIIsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991;88(18):7978-7982)，具体如下用0.1MNaHCO3(pH8.6)的溶液包被纯化的H5N1禽流感病毒抗原(1:200稀释)，每孔10(V1，4'C过夜；次日用1XPBST洗去未吸附的抗原，用4W的脱脂奶37。C封闭1小时，弃封闭液；每孔加入80pl噬菌体抗体库，37。C孵育2小时，弃去孔中未结合的噬菌体，用1XTBST(50mMTris-HCl，150mMNaCl，0.5%Tween20，pH7.5)洗液冲洗各孔，冲洗时，用带有吸头的移液器反复吹打，共洗10—20遍，以充分洗去未吸附的噬菌体；最后用ddH20洗两遍，吸净孔中的液体；每孔加入50pl0^—11(:1&112.2)的洗脱液，室温孵育IO分钟，期间反复吹打数次。加入适量的2MTris，以中和洗脱下来的噬菌体；将洗脱的噬菌体立即加入2ml新鲜制备的XLI-Blu菌液中(OD6。o=l)，室温孵育15—20分钟；然后转入250ml三角瓶中，加入SB10ml(氨苄青霉素20pg/ml，四环素10pg/ml)，立即取IO|ul涂氨苄青霉素平皿，以滴定噬菌体；三角瓶与37t振荡培养l小时，加入IOOmlSB(氨苄青霉素100ng/ml)，37°Cl小时后，加入辅助噬菌体VCSM13lml，37'C振荡培养2小时，加入卡那霉素(终浓度70jag/inl)，37'C培养过夜。如此反复筛选4次。5.Fab段抗体的诱导表达人源中和性抗禽流感病毒H5Nl基因工程Fab抗体可溶性表达产物的制备基本按文献进行(Barbas,C.Fill,Kang,A.S.，andlarner,R.A.Assemblyofcombinatorialantibodylibrariesonphagesurface:thegeneIIIsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991;88(18):7978-7982),具体为将带有阳性抗体轻重链基因插入的阳性克隆扩增后按常规方法提取质粒DNA,用SpeI和NheI切除载体中的gIII，变FdgIII融合蛋白为独立表达的蛋白，连接后转化XL1-Blu菌，从过夜生长的氨苄平皿中挑取单个菌落，接种SB或TB细菌培养液，当细菌长至OD6oc-0.2一0.3，加入lmMIPTG，在3(TC诱导表达10—12小时。收获细菌，离心后加入原培养液1/10体积的PBS(0.02MpH7.4)重悬，反复冻融三次，4°C12000rpm离心30分钟，上清即为表达的Fab抗体。备用于进一步的检测和鉴定。阴性对照为载体pComb3转化菌按同样方法制备的细菌裂解液。6.人源抗H5Nl禽流感病毒Fab抗体的ELISA检测4.1Fab表达的检测用0.1MNaHCOs(pH9.6)的溶液包被抗人Fab抗体(美国Sigma，1:2000稀释使用)，4。C过夜；4%脱脂奶封闭，37°Clh，加入表达的Fab抗体，37。Clh;加入酶标抗人Fab二抗(美国Sigma,1:2000稀释使用)，37°Clh;显色液显色，2MH2S04终止反应，酶标仪检测吸光度A值。4.2间接酶联免疫法检测Fab与H5Nl禽流感病毒及重组HA结合活性用纯化的灭活H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/2005)和重组血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)作为包被抗原，随后的步骤同上。7.间接免疫荧光(IFA)检测H5N1禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)感染MDCK细胞，35。C培养约48小时，收获细胞，滴加至玻璃底片上，吹干，丙酮固定15min并干燥，制成病毒抗原片。同时利用己构建的表达禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)重组杆状病毒感染Sf9细胞，4-5天后收获感染细胞制成重组HA抗原片。加入表达的Fab，37。C温育30min，冲洗，加入FITC标记的抗Fab抗体(美国Sigma)，37'C温育30min,冲洗，晾干，显微镜下观察。8.Westernblot检测抗原分别为纯化的灭活H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/05)、真核表达的重组禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)。阳性对照为禽流感病人恢复期血清，阴性对照为针对甲肝病毒人源单抗HAVIgG16。抗原进行SDS-PAGE电泳，半干法进行蛋白质的电转移，将聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质转移到NC膜。转膜后对凝胶进行考马斯亮兰染色以检査蛋白质是否转移完全。将分子量标准的泳道剪下，标出分子量标准的参照蛋白位置。对NC膜进行封闭，5%脱脂奶室温封闭2小时。一抗AVFluFabl、AVFluFab3及H34表达产物原液与抗原反应，阳性血清用封闭液1:10稀释与抗原反应，室温反应2小时。lxPBST洗涤3次后与HPR标记的抗人Fab(Sigma公司，l:500使用)室温反应l小时。lxTBST洗涤3次后放入DAB底物显液色中，至棕色阳性条带出现适时终止反应，避光保存。9.流式细胞术分析抗原抗体结合特异性(flowcytometry,FCM)采用间接荧光分类的方法(fluorescenceactivatedcellsorting,FACS)(TaraHeitner，AnneMoor,"a/.Selectionofcellbindingandinternalizingepidermalgrowthfactorreceptorantibodiesfromaphagelibrary.JournalofImmunologicalsMethods.2001;248:17-30.)，禾U用表达禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)重组杆状病毒感染sf9细胞，4-5天后收获感染细胞，细胞计数设定每个反应体系约为2><105个细胞/50^11，加入待测抗体50pl，冰上作用lh，用250^含0.25%BSA的PBS洗2次，加入IOOpl抗FITC标记的抗Fab抗体l:100稀释(美国Sigma)，闭光冰上作用30min，PBS洗2次，将细胞重悬于P/。多聚甲醛-PBS中，待测。10.人源Fab抗体可变区基因的核酸序列分析用QiagenMiniprepKit(德国QIAGEN)制备质粒DNA进行核酸序列分析。轻重链的测序弓I物分别为5'-AAACTAGCTAGTCGCCAAGGA-3，和5，-CCGCGGTGGCGGCCGCAAAT-3，。测序结果和InternetV-Base基因库中IgG基因序列比较。11.全抗体重组表达质粒的构建将获得的Fab抗体的轻链先用Xbal/Sacl酶切，用末端补平酶(K片段)补平，克隆入pAC-L-Fc载体(德国PROGENPR3003)，再将重链Fd段利用XhoI/Spel位点克隆进去，构建成全抗体表达载体。12.转染和扩毒采用美国Pharmogen公司的BaculoGold共转染试剂盒。操作方法略述如下将5iag的重组质粒DNA与0.5iag的BaculoGold线性DNA混合混合后，利用试剂盒中的转染试剂转染生长密度为50X的Sf9细胞，27'C培养4天后，收集上清作为重组病毒的毒种进行滴定禾卩扩增。具体操作见Baculovirusexpressionvectorsystem手册。13.全抗体IgG分泌表达和纯化重组病毒感染生长密度70%左右的Sf9细胞，27。C吸附lh.改用SF-900IISFM无血清培养液，27'C培养35天后收集上清。采用Amersham公司的Protein-A亲和层析柱直接纯化表达上清(HarlowE，LaneD."Antibodies:ALaboratoryManual".ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1988.)。用ELISA、IFA、WesternBlot和流式细胞术对所获对纯化的IgG抗体功能特性进行鉴定。具体操作如上。14.人源抗禽流感病毒H5N1抗体微量中和功能测定将人源抗禽流感病毒IgG纯化抗体及阴阳性对照血清过滤除菌作系列稀释后，与100TCID50的H5N1禽流感病毒50^d以1:1混合，放37。C温箱作用2小时。选择8孔进行病毒回滴，将病毒作系列倍比稀释，使之成为100TCID50，50TCID50，...0.7。设立4个重复孔为阳性细胞对照，即将MDCK细胞与100TCID50病毒进行混合培养；设立4个重复孔为阴性细胞对照，即将细胞与稀释缓冲液混合培养。力tn00pl细胞液(1.5xl04)于含有病毒-抗体(血清对照)混合物以及倍比稀释病毒回滴工作液的微量板中，37'C温箱孵育18-22小时。弃去微量培养板中的细胞液，PBS洗细胞一次，加入IOOpl/孔固定液，于室温固定细胞IO分钟，弃固定液，室温干燥。ELISA检测中和抗体滴度PBS洗去残留丙酮，加入一抗(抗流感病毒和蛋白-NP单克隆抗体)室温作用l小时，PBS洗漆培养板4次，加入稀释好二抗(HRP标记的羊抗鼠IgG)室温作用l小时，洗板6次，每孔加入OPD底物IOOpi(10mgOPD+20ml柠檬酸缓冲液+l(Hill30n/。双氧水，即用即配)。室温10分钟显色，1M硫酸终止，记录490nm每孔OD。结果判定(细胞阳性对照平均OD值一细胞阴性对照平均OD值)/2+细胞阴性对照平均OD值二XX二细胞半数感染域值，每孑LOD值低于X值时，判定中和试验反应阳性，中和反应阳性的抗体最高稀释度即为中和抗体滴度。结果1.人源抗禽流感病毒H5N1抗体库的筛选用超速离心纯化的灭活H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/2005)和纯化的杆状病毒系统表达重组血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)对抗体库进行筛选，经3轮筛选后随机挑取192个克隆。用抗人Fab抗体(sigma公司，l:2000稀释使用)、灭活H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/2005)抗原和重组血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)包被96孔板，加入待测样品上清，用酶标抗人Fab二抗(sigma公司，l:2000稀释使用)检测。结果显示共获得45株人源Fab表达阳性克隆，如图2所示。45株人源Fab表达阳性克隆中，有42个克隆对H5N1禽流感病毒特异性结合，如图3A所示。用禽流感病毒(A/Ahui/1/2005)纯化抗原包被(图3A)和重组血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)抗原包被(图3B)对收获的45个Fab抗体阳性克隆表达上清中抗H5Nl禽流感病毒特异性抗体的ELISA检测，其中18株Fab克隆被确定为抗H5N1禽流感病毒血凝素蛋白HA(A/Vietnam/1203/2004)抗体。122.人源抗禽流感病毒H5N1Fab抗体对禽流感抗原的特异性结合为了证实所获得的重组Fab抗体是特异性的针对禽流感病毒H5Nl，本发明进一步通过间接免疫荧光试验(IFA)、WesternBlot鉴定原核表达Fab抗体的功能活性。H5N1禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)感染MDCK细胞后制成病毒抗原片，同时利用已构建的表达禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)重组杆状病毒感染Sf9细胞，4-5天后收获感染细胞制成重组HA抗原片待检。'结果与上述ELISA结果完全相符，42个克隆与禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)免疫荧光均为反应阳性，其中18株被ELISA确定与重组HA(A/Vietnam/1203/2004)反应的抗体与重组HA(A/Anhui/1/2005)免疫荧光均为阳性反应；其余24株并不针对重组HA(A/Vietnam/1203/2004)的Fab克隆与重组HA(A/Anhui/1/2005)免疫荧光均为阳性反应。免疫荧光结果证明从抗体库筛选获得的阳性克隆均针对禽流感病毒血凝素蛋白HA，如图4所示，其中A、B、C、D分别为阳性血清、阴性抗体、AVFluFabl、AVFluFab3与重组HA(A/Anhui/1/05)反应；E、F、G、H分别为阳性血清、阴性抗体、AVFluFabl、AVFIuFab3与禽流感病毒(A/Anhui/1/05)反应。3.人源抗禽流感病毒H5N1Fab抗体的序列分析用DNASTAR序列分析软件进行分析处理，比较IntemetV-Base基因库中的IgG序列，上述42株人源抗高致病性禽流感病毒H5N1基因工程抗体中，18株与禽流感病毒重组HA(A/Vietnam/1203/2004)及重组HA(A/Anhui/1/2005)均反应的Fab克隆为同一抗体序列；其余24株与重组HA(A/Anhui/1/2005)反应的Fab克隆为同一抗体序列，因此共发现2株带有不同的抗体轻重链可变区序列及其组合的抗体，其重链可变区主要分类在IgGVH4和VH3家族，其轻链可变区主要分类在IgGVL2和VL1家族。图1为2株人源抗高致病性禽流感病毒H5N1基因工程抗体的可变区基因的氨基酸序列及其相互比较，图中以第一行抗体序列为比较的标准序列，"-"符号表示与第一行抗体序列相同的氨基酸，阴影部分为CDR区。具体的，人源抗禽流感病毒H5N1Fab抗体AVFluFabl的重链可变区氨基酸序列见SEQIDNO.l，相应的核苷酸序列见SEQIDN0.6;其轻链可变区氨基序列见SEQIDN0.2，相应的核苷酸序列见SEQIDN0.5。AVFluFab3的重链可变区氨基酸序列见SEQIDN0.3，相应的核苷酸序列见SEQIDN0.8;其轻链可变区氨基序列见SEQIDN0.4,相应的核苷酸序列见SEQIDN0.7。4.全抗体IgG表达和纯化将2株已完成功能鉴定Fab抗体(AVFluFabl、AVFluFab3)的轻链和重Fd段基因，分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc转染昆虫Sf9细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达。采用Amersham公司的Protein-A亲和层析柱直接纯化表达上清，通过SDS-PAGE检验全抗体IgG的表达及纯化情况，结果证实得到较纯蛋白，可清晰观察到解链后的抗体轻、重链，分别位于约28KD、55KD处，如图5所示。5.人源抗禽流感病毒H5N1IgG抗体针对禽流感抗原的特异性结合为了证实所获得的重组IgG抗体(AVFluIgGl、AVFluIgG3)是特异性的针对禽流感病毒H5N1，本发明进一步通过ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)、WesternBlot和流式细胞术鉴定全抗体IgG的功能活性。ELISA结果与验证Fab抗体功能活性相一致，纯化的全抗体AVFluIgGl与禽流感病毒(A/Anhui/l/2005)及重组HA(A/Vietnam/1203/2004)均反应，而AVFluIgG3可识别禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)，但与重组HA(A/Vietnam/1203/2004)不反应，如图6所示。间接免疫荧光试验显示获得的2株重组IgG抗体(AVFluIgGl、AVFluIgG3)均识别禽流感病毒重组HA(A/Anhui/1/2005)。WesternBlotting结果表明AVFluIgGl可分别与变性的灭活病毒及重组HA(A/Anhui/1/2005)反应，而AVFluIgG3并不与之反应。这提示AVFluIgGl所针对的HA的抗原决定簇为线性抗原决定簇，而AVIgG3所识别的抗原决定簇为构象依赖型。如图7所示。本发明釆用流式细胞间接荧光分类法(FACS)分析人源IgG抗体对禽流感抗原特异性结合，分别用阳性血清、阴性抗体、AVFluIgGl、AVFluIgG3与表达重组HA(A/Anhui/l/2005)的Sf9细胞反应，结果表明重组IgG抗体(AVFluIgGl、AVFMgG3)均可特异性识别表达重组HA(A/Anhui/l/2005)的Sf9细胞。如图8所示。6.人源抗禽流感病毒H5N1抗体微量中和功能测定微量中和试验表明这2株重组IgG抗体(AVFluIgGl、AVFluIgG3)对亚洲中国地区南方和北方的H5N1禽流感病毒人源分离株均具有较高并且广泛的中和活性，其中AVFluIgG3的中和活性更高也更为广谱，对于中国目前已分离的8株H5N1禽流感病毒人源分离株均具有中和活性，且针对其中某些地方分离株可在纳克级水平中和病毒，对于为疫苗研制提供有效的候选表位具有重大意义。试验结果如图9及表1所示。表l.纯化IgG抗体的微量中和试验结果统计<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>序列表(SEQUENCELISTING)<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所<120>—种人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗体<130>JSP090056<160>8<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>112<212>PRT<213>Homosapiens<400>1LeuGluSerGlyProGlyLeuValLysProSerGluThrLeuSerLeu151015ThrCysThrValSerGlyGlySerlieAsnGlyTyrTyrTrpSerTrp202530lieArgGinProProGlyLysGlyLeuGluT卬lieGlyTyrLeuPhe354045AspSerGlySerThrAsnTyrAsnProSerLeuThrSerArgValThr505560lieSerValAspThrSerLysAsnGinPheSerLeuLysLeuSerSer65707580ValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgArgPheTrp859095GlyLeuAspGlyPheAsplieTrpGlyGinGlyThrThrValThrVal100105110<210>2<211>107<212>PRT<213>Homosapiens<400>2GluLeuGinProAlaSerValSerGlySerProGlyGinSerlieThr151015lieSerCysThrGlyThrSerSerAspValGlyAspTyrAsnTyrVal202530SerTrpTyrGinGinHisProGlyLysAlaProThrLeuMetlieTyr354045AspValAsnLysArgProSerGlyAspSerAsnArgPheSerGlySer505560LysSerGlyAsnThrAlaSerLeuThrlieSerGlyLeuGinAlaGlu65707580AspGluAlaAspTyrTyrCysSerSerTyrThrSerSerSerThrTrp859095ValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105<210>3<211>122<212>PRT<213>Homosapiens<400>3LeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGlySerLeuArgVal151015SerCysThrAsnSerGlyPheThrPheSerAspTyrAlaMetSerTrp202530ValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValSerAlalieSer354045GlyAsnGlyGlySerSerThrTyrTyrAlaAspSerValLysGlyArg505560PheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrMetTyrLeuGinMet65707580AsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysValArgAsp859095AspSerTyrAspGlyGlyGlyGinTyrGlyLeuHisAsnTrpPheAsp100105110SerTrpGlyGinGlyThrLeuValThrVal115120<210>4<211>107<212>PRT<213>Homosapiens<400>4GluLeuThrGinProProSerValSerGlyAlaProGlyGinArgVal151015ThrHeSerCysThrGlySerSerSerAsnlieGlyAlaGlyTyrAsp202530ValHisTrpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeulie354045TyrGlyAsnSerAsnArgProSerGlyValProAspArgPheSerGly505560SerLysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlalieThrGlyLeuGinAla65707580GluAspGluAlaAspTyrTyrCysGinSerTyrAspSerSerLeuVal859095ValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><400>7gagctcacgcagccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatctcctgc60actgggagcagctccaacatcggggcaggttatgatgtacactggtaccagcagcttcca120ggaacagcccccaaactcctcatctatggtaacagcaatcggccctcaggggtccctgac180cgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcactgggctccaggct240gaggatgaggctgattattactgccagtcctatgacagcagccttgtggtattcggcgga300gggaccaagctgaccgtccta321<210>8<211>366<212>DNA<213>Homosapiens<400>8ctcgagtctgggggaggcttggtacaacctggggggtccctgagagtctcctgtacaaac60tctggattcacctttagcgactatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaagggg120ctggagtgggtctcagctattagtggtaatggtggtagtagcacatactacgcagactcc180gtgaaggggcggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgatgtatctgcaaatg240aacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgtgagagatgactcctatgat300ggcggtggtcagtacggtctgcacaactggttcgactcctggggccagggaaccctagtc360accgtc36权利要求1.一种人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗体，隶属于抗体重链家族VH3和抗体轻链家族VL1，其重链可变区中的三个高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为DYAMS、AISGNGGSSTYYADSVKG和DDSYDGGGQYGLHNWFDS，其轻链可变区中的三个高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为TGSSSNIGAGYDVH、GNSNRPS和QSYDSSLVVF。2.如权利要求1所述的人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗体，其特征在于，该抗体为Fab抗体或全抗体IgG，其重链可变区具有SEQIDN0.3的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQIDN0.4的氨基酸序列。3.—种人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗体的基因，编码权利要求l或2所述的人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗体。4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因的轻链可变区具有SEQIDN0.7的核苷酸序列，重链可变区具有SEQIDN0.8的核苷酸序列。5.权利要求1或2所述的人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗体在制备预防和治疗由禽流感病毒H5N1引起的人感染禽流感的药物中的应用。6.权利要求3所述的人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗体的基因在制备预防和治疗由禽流感病毒H5N1引起的人感染禽流感的药物中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗体的基因的轻链可变区具有SEQIDNO.7的核苷酸序列，重链可变区具有SEQIDN0.8的核苷酸序列。全文摘要本发明公开了一种人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗体，来源于中国高致病性禽流感H5N1恢复期病人抗体基因文库，其主要特征在于此重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定的，并在原核和真核细胞中获得有效表达的特异性结合禽流感病毒血凝素蛋白HA的中和性功能抗体。利用此抗体CDR区或部分或全基因，可在原核、酵母、昆虫和真核细胞及任何表达系统中改造和生产不同形式的基因工程抗体，可在临床上预防或治疗H5N1禽流感病毒相关疾病。文档编号A61P31/00GK101538328SQ20091013580公开日2009年9月23日申请日期2007年6月15日优先权日2007年6月15日发明者刘琴芝,孙丽娜,张全福,川李,李德新,梁米芳,舒跃龙申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所