专利名称：检测多种细菌耐药基因的技术和检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用锁定核酸荧光PCR法检测多种细菌耐药基因的技术和检测试剂盒。
背景技术：
抗生素是医院临床中应用最广泛的抗菌药物，在控制、预防和治疗各种感染性疾病中发挥重要作用。然而，随着抗菌药物的广泛使用，病原菌对常见抗菌药物的耐药性不断增加，耐药菌感染的治疗已成为一个全球性难题。各种耐药菌的不断出现可造成严重后果，导致手术治疗失败、并发症增多、感染复发、住院时间延长、昂贵抗生素及其它药物的使用量增加等。耐药菌还随着国际贸易及旅游业的高速发展而在全球范围蔓延。了解耐药性细菌的出现原因、发生机制，掌握并使用正确的检测方法是及时发现耐药菌株、有效预防和控制耐药性细菌扩散的关键。目前细菌耐药性检测主要是通过基于培养的药物敏感性实验，包括纸片扩散法、 最小抑菌浓度(MIC)法等。其中MIC法属于金标准，可以表明细菌对药物的敏感性，从而指导临床治疗。由于上述药物敏感性实验是基于培养的，因此耗时较长，约2-3天才能获得结果，而且灵敏度较差，因此，临床亟需快速灵敏的实验方法来检测细菌耐药性，指导临床治疗方案，控制耐药细菌的传播和扩散。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测多种细菌耐药基因的技术和检测试剂盒，它具有检测快速准确，灵敏度好，并且试剂盒的保存时期长的特点。为了解决背景技术所存在的问题，本发明采取以下技术方案多细菌耐药基因的技术检测方法为利用特异引物对进行实时荧光PCR，扩增待测细菌耐药基因，扩增的产物与锁定核酸探针进行杂交，检测荧光信号，确定待测细菌耐药基因。所述特异引物对中的两条正反向引物浓度相同。所述的与扩增产物杂交的锁定核酸探针的浓度与正反向引物浓度为1 2。所述的PCR扩增温度循环包括40个温度循环，由变性、退火和延伸三个步骤组成。所述延伸温度为60_80°C。本发明的检测试剂盒包含扩增细菌特异基因及耐药基因的正反向引物对，与细菌特异基因及耐药基因的扩增产物杂交的锁定核酸探针和进行PCR反应和分子杂交的反应液。本发明具有以下有益效果它具有检测快速准确，灵敏度好，并且试剂盒的保存时期长的特点。
图1本发明中检测细菌耐药基因试剂盒包括的引物的结构示意图2本发明中检测细菌耐药基因试剂盒包括的锁定核酸探针的结构示意图；图3为本发明中多重不对称PCR扩增热循环程序的结构示意图；图4为本实施例中金黄色葡萄球菌ATCC 43300耐药基因扩增曲线图。
具体实施例方式参照图1-3，本具体实施方式
采取以下技术方案多细菌耐药基因的技术检测方法为利用特异引物进行实时荧光PCR，扩增待测细菌耐药基因，扩增的产物与锁定核酸探针进行杂交，检测荧光信号，确定待测细菌耐药基因。所述特异弓ι物对中的两条正反向弓丨物浓度相同。所述的与扩增产物杂交的锁定核酸探针的浓度与正反向引物浓度为1 2。所述的PCR扩增温度循环包括40个温度循环，由变性、退火和延伸三个步骤组成。所述延伸温度为60_80°C。本发明的检测试剂盒包含扩增细菌特异基因及耐药基因的正反向引物对，与细菌特异基因及耐药基因的扩增产物杂交的锁定核酸探针和进行PCR反应和分子杂交的反应液。本具体实施方式
具有检测快速准确，灵敏度好，并且试剂盒的保存时期长的特点。实施例利用细菌耐药基因检测试剂盒检测mecA耐药基因，检测目标是shv， ctx-m-l-type，ctx-m-9-type，cmy，dha，kpc，η dm, oxa, vim, imp，me c A 禾口 vanA，使用金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC43300进行试验，在超净工作台内将细菌划线接种于LB培养基平板以分离单菌落，将平板在孵箱中倒置，35°C孵育Mh，从培养细菌的LB平板上沾取一单菌落，加到100 μ 1 IXTE中，然后将离心管95°C水浴5min，置_20°C备用，荧光PCR反应体系的组成如下=IXMasterMix(Roche)；用图1中引物H6和图2中锁定核酸探针27-39分别配制13个反应体系，引物对的浓度分别为0. 4 μ mol/L,探针的浓度为0. 2 μ mol/L ；加入 IyL菌液作为模板。反应总体积为10yL。同时，将菌液10倍梯度稀释后作为模板进行 mecA基因的扩增反应，确定检测灵敏度；PCR在7900HT(ABI)热循环仪上进行，采用图3的 PCR扩增热循环程序。结果表明，锁定核酸探针荧光PCR法检测到ATCC 43300菌株含有mecA耐药基因， Ct值为19，其他耐药基因没有扩增，该结果与ATCC提供的信息相符，这说明所提供的利用锁定核酸探针进行细菌耐药基因检测试剂盒可以特异地检测细菌中所含目标耐药基因。 (见图4)。
权利要求
1.检测多种细菌耐药基因的技术和检测试剂盒，其特征在于多细菌耐药基因的技术检测方法为利用特异引物对进行实时荧光PCR，扩增待测细菌耐药基因，扩增的产物与锁定核酸探针进行杂交，检测荧光信号，确定待测细菌耐药基因。
2.根据权利要求1所述的检测多种细菌耐药基因的技术和检测试剂盒，其特征在于所述的检测试剂盒包含扩增细菌特异基因及耐药基因的正反向引物对，与细菌特异基因及耐药基因的扩增产物杂交的锁定核酸探针和进行PCR反应和分子杂交的反应液。
3.根据权利要求1所述的检测多种细菌耐药基因的技术和检测试剂盒，其特征在于所述特异引物对中的两条正反向引物浓度相同。
4.根据权利要求1所述的检测多种细菌耐药基因的技术和检测试剂盒，其特征在于所述的与扩增产物杂交的锁定核酸探针的浓度与正反向引物浓度为1 2。
5.根据权利要求1所述的检测多种细菌耐药基因的技术和检测试剂盒，其特征在于所述的PCR扩增温度循环包括40个温度循环，由变性、退火和延伸三个步骤组成。
6.根据权利要求5所述的检测多种细菌耐药基因的技术和检测试剂盒，其特征在于所述的延伸温度为60-80°C。
全文摘要
检测多种细菌耐药基因的技术和检测试剂盒，它涉及生物技术领域，它的多细菌耐药基因的技术检测方法为利用特异引物对进行实时荧光PCR，扩增待测细菌耐药基因，扩增的产物与锁定核酸探针进行杂交，检测荧光信号，确定待测细菌耐药基因。它检测快速准确，灵敏度好，并且试剂盒的保存时期长。
文档编号C12Q1/68GK102251047SQ20111022063
公开日2011年11月23日 申请日期2011年8月3日 优先权日2011年8月3日
发明者李全贞, 祝令香 申请人:河北省健海生物芯片技术有限责任公司