一种检测细菌氨基糖苷类耐药基因的引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测细菌氨基糖苷类耐药基因的 引物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 氨基糖苷类抗生素是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素。有来 自链霉菌的链霉素、小单孢菌的庆大霉素等天然氨基糖苷类，还有阿米卡星等半合成氨基 糖苷类。虽然大多数抑制微生物蛋白质合成的抗生素为抑菌药，但氨基糖苷类抗生素却可 起到杀菌作用，属静止期杀菌药。
[0003] 氨基糖苷类抗生素对于细菌的作用主要是抑制细菌蛋白质的合成，作用点在细胞 30S核糖体亚单位的16SrRNA解码区的A部位。研究表明：此类药物可影响细菌蛋白质合 成的全过程，妨碍初始复合物的合成，诱导细菌合成错误蛋白以及阻抑已合成蛋白的释放， 从而导致细菌死亡。
[0004] 氨基糖苷类抗生素在临床上主要用于敏感需氧革兰阴性杆菌及阳性球菌等致病 性细菌所致的全身感染。由于氨基糖苷类抗生素对铜绿假单胞菌、肺炎杆菌、大肠杆菌等常 见革兰阴性杆菌的PAE较长，所以，该类药物被广泛被用于治疗需氧革兰阴性杆菌所致的 严重感染，如脑膜炎、呼吸道、泌尿道、皮肤软组织、胃肠道、烧伤、创伤及骨关节感染等。另 夕卜，对于败血症、肺炎、脑膜炎等细菌引起的严重感染，常常使用氨基糖苷类及其他类别抗 生素的联合用药方案，此外，在畜牧业和中水产业中，该类抗生素不但被广泛用于防治各种 动物性疾病，而且常添加到饲料中，用于促进动物生长发育。在欧洲，每亩鱼池规定可以投 放50公斤的抗生素，而在我国动物用的剂量根本没有明确规范，通常动物刚一出生即使没 病也要先对其使用抗生素"预防"，避免因大规模发病而遭受巨大的损失。
[0005] 近30年来，由于大量治疗用抗生素在临床的不合理应用，临床疾病相关细菌的耐 药性不断增加，引起正常菌群失调和大量耐药菌株出现。耐药菌能够承受住抗生素药物的 攻击，这样一来标准的治疗就失去了效果，感染持续存在并可传染他人。抗生素耐药性是由 使用抗生素药物，特别是对抗生素药物的不当使用造成的，当细菌发生突变或获得耐药基 因时，就产生了耐药性。氨基糖苷类药物在临床中的广泛应用使得越来越多的产生了对该 类抗生素耐药的菌株，导致临床治疗失败。另外，因为在畜牧养殖业中广泛使用氨基糖苷类 抗生素的情况非常普遍，不仅动物、禽类及鱼类体内残留的抗生素会转移到人体，它们体内 产生的耐药菌和耐药基因也会传播给人类。这样就需要一种能方便快捷的检测细菌耐药性 的方法，从而来及早发现耐药细菌，进而改变用药方案，指导临床治疗。
[0006] 耐药性的检测可以分为常规表型检测（即药敏试验）和耐药基因型检测。常规药 敏试验首先需要通过培养的方法从临床标本中分离到菌株，而许多生长较慢和不易培养的 细菌，是无法通过常规药敏试验检测其耐药性的。在过去的20年，为适应临床需要，以DNA 探针和聚合酶链反应（PCR)为基础的分子手段检测耐药基因取得了很大进展，其中部分方 法已被美国食品和药品管理局（FDA)批准用于临床工作。从最初的定性PCR和电泳到后期 的基因芯片等技术都可以检测细菌抗生素相关耐药基因，但定性PCR及电泳法具有容易污 染、操作繁琐等缺陷，基因芯片技术可同时检测多个耐药基因，但成本也非常高，操作复杂， 所需时间长，不适宜临床大规模推广应用。
[0007] 实时突光定量 PCR 技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，在PCR反应体系 中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对 样品中的DNA(或cDNA)进行定量检测的方法。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量， 而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。目 前已有多种运用定量PCR技术的试剂盒应用于临床疾病相关的病原体检测、基因分型、突 变研究等。
【发明内容】
[0008] 本发明需要解决的技术问题是，提供一种种灵敏、准确、操作简便的新型检测 试剂盒，实现对常见细菌氨基糖苷类耐药基因 aac(3)_II、aac(6'）_Ib、aph(3'）-III、 ant (3 " )-la、ant (4'）-Ia的快速检测，以弥补现有检测方法的不足。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0010] 一种检测细菌氨基糖苷类耐药基因的引物，它包括如下引物对：
[0011] ⑴扩增aac (3)-II耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1?2所示；
[0012] ⑵扩增aac (6'）-Ib耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3?4所示；
[0013] ⑶扩增aph (3'）-111耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :5?6所 示；
[0014] ⑷扩增ant (3" )-Ia耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :7?8所 示；
[0015] (5)扩增ant (4'）-Ia耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :9?10所 示；
[0016] 上述5对引物对在一次检测中共同使用。
[0017] 上述检测细菌氨基糖苷类耐药基因的引物在制备检测细菌氨基糖苷类耐药基因 的试剂中的应用。
[0018] 一种检测细菌氨基糖苷类耐药基因的试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：
[0019] (I)PCR反应液：该PCR反应液中含有DNA聚合酶、EvaGreen荧光染料、Mg2+、PCR反 应缓冲液、dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP ;
[0020] ⑵引物混合液：将SEQ ID NO :1?10所示的10种引物混合，用双蒸水溶解，每 条引物的浓度为lymol/L ;
[0021] (3)阳性对照：分别含有 aac(3)_II、aac(6'）_Ib、aph(3'）_11、ant(3" )_la 和 ant (4'）-la耐药基因的五种细菌基因组DNA和大肠杆菌基因组DNA ;
[0022] ⑷阴性对照：大肠杆菌基因组DNA。
[0023] 其中，阳性对照中，每一种含有耐药基因的细菌基因组DNA浓度为IOng/ μ L，大肠 杆菌基因组DNA浓度为50ng/ μ L。
[0024] 其中，阴性对照中，大肠杆菌基因组DNA的浓度为IOOng/ μ L。
[0025] 上述检测细菌氨基糖苷类耐药基因的试剂盒在检测细菌氨基糖苷类耐药基因中 的应用。
[0026] 因为细菌的生长繁殖速度很快，其基因组也经常会发生变异而具有异质性，包 含本发明所述的 5 种耐药基因 aac (3) -II、aac (6'）_Ib、aph (3'）-III、ant (3 " ) -la、 ant (4'）-la的不同种类的临床致病菌和同一种菌的不同临床隔离菌株所含的基因 DNA序 列会有所差异，本发明通过从NCBI的基因序列库中比对多种菌及临床隔离株的基因序列， 在保守位点设计的特异性引物能扩增临床常见致病菌（主要包括革兰氏阴性杆菌和革兰 氏阳性球菌，如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦 芽窄食单胞菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌、奇异变形杆菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎 肠球菌等）的 aac (3) -II、aac (6'）-Ib、aph (3'）-III、ant (3 ") -la、ant (4'）-Ia 耐药基因。
[0027] 有益效果：
[0028] (1)通过在NCBI的基因序列库中比对多种菌及临床隔离株氨基糖苷类耐药基因 序列，在保守位点处设计的特异性引物，能够对临床常见致病菌5种氨基糖苷类耐药基因 aac (3) -II、aac (6,）-Ib、aph (3,）-III、ant (3") -la、ant (4,）-Ia 进行快速检测。
[0029] (2)使用一种稳定性强、双链结合特异性高、对PCR反应抑制小的EvaGreen荧光染 料，提高了荧光定量PCR扩增的特异性及稳定性。
[0030] (3)本发明所述的核酸序列和试剂盒具有操作简便、灵敏度高、特异性强、成本低 廉及高通量等优点，可用于辅助临床快速诊断致病性细菌氨基糖苷类抗生素的耐药情况， 为临床治疗提供参考依据。
【附图说明】
[0031] 图1为阳性对照品检测结果图。
[0032] 图2为阴性对照品检测结果图。
[0033] 图3为1例氨基糖苷类抗生素耐药大肠杆菌耐药基因检测结果图。
[0034] 图4为1例氨基糖苷类抗生素敏感肺炎克雷伯菌检测结果图。
[0035] 图中英文字母对应的中文名称为：
[0036] Cycle 循环数！Fluorescence ;突光值！Amplification Curves ;扩增曲线： Select :选择；Zoom :放大。
【具体实施方式】
[0037] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0038] 实施例1 :检测细菌氨基糖苷类5种耐药基因耐药基因 aac (3)-II、aac (6'）-lb、 aph(3'）-III、ant(3" )-la、ant(4'）_la的核酸序列，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合 成：
[0039] 扩增aac (3)-II耐药基因的引物对：
[0040] F1(SEQ ID NO :1) :5，-ATTGGTCCGGTCGAAGGAGGAG-3，，
[0041] R1(SEQ ID NO :2) :5，-CAACCGAGCGCCATTCAGAGTCT-3，；
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