042] 扩增aac (6'）-Ib耐药基因的引物对：
[0043] F2(SEQ ID NO :3) :5，-TGACCTTGCGATGCTCTATGAGTG-3'，
[0044] R2(SEQ ID NO :4) :5，-GCATACCCAATCGGCTCTCCA-3';
[0045] 扩增aph (3'）-111耐药基因的引物对：
[0046] F3(SEQ ID NO :5) :5，-GATGCTATGGCTGGAAGGAAAG-3，，
[0047] R3(SEQ ID NO ：6) ：5' -CTTTTCAGGGCTTTGTTCATCTTC-3;；
[0048] 扩增ant (3" )_la耐药基因的引物对：
[0049] F4(SEQ ID NO :7) :5，-TCTCCGCGCTGTAGAAGTCACC-3，，
[0050] R4(SEQ ID NO :8) :5，-CCTACCAAGGCAACGCTATGTTC-3，；
[0051] 扩增ant (4'）_la耐药基因的引物对：
[0052] F5(SEQ ID NO ：9) ：5' -CACGATGCGATTTGTGCCCTTAT-3;,
[0053] F5(SEQ ID NO :10) :5，-CAGATGCGATGATGCAGACCAATC-3，。
[0054] 实施例2 :试剂盒的制备方法。
[0055] (I)PCR 反应液：Fast EvaGreen qPCR Master Mix (购于美国 Biotium 公司），为 2*PCR反应酶预混液，其中含有本发明中所述的PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、EvaGreen荧 光染料、Mg 2+及dNTPs，-20°C保存；
[0056] (2)引物混合液：将SEQ ID NO :1?10所示的核苷酸序列交由英潍捷基（上海） 贸易有限公司合成，然后混合于一管中，用双蒸水溶解，每一条引物的终浓度均为1 μ mol/ L，_20°C保存；
[0057] (3)阳性对照：分别含有 aac(3)_II、aac(6'）_Ib、aph(3'）_11、ant(3" )_la 和 ant (4'）-la耐药基因的五种细菌基因组DNA和大肠杆菌基因组DNA，其中，每一种含耐药基 因的细菌基因组DNA浓度为IOng/ μ L，大肠杆菌基因组DNA浓度为50ng/ μ L，-20°C保存；
[0058] ⑷阴性对照：大肠杆菌基因组DNA浓度为IOOng/ μ L，-20°C保存。
[0059] 实施例3 :检测方法。
[0060] 仪器：Roche LightCycleryS 480 荧光定量 PCR 检测仪，BECKMAN MicrofUge'? 22R 台式微量冷冻离心机，Eppendorf 5810R台式冷冻离心机，太仓华利达实验室设备公司 WH-866型涡旋振荡器。
[0061] (1)细菌基因组DNA模板的制备：参考公开的文献，不同种类的细菌标本，采用相 应的商品化基因组DNA抽提试剂盒，按照试剂盒说明书制备细菌基因组DNA，作为PCR反应 模板备用。
[0062] (2)以步骤⑴得到的细菌基因组DNA为模板，利用5对特异性引物和高性能荧光 染料进行细菌氨基糖苷类耐药基因 aac(3)_II、aac(6'）_Ib、aph(3'）-III、ant(3" )_la、 ant (4'）-la的扩增检测，具体包括如下步骤；
[0063] (2a) PCR反应液配制：从-20°C冰箱取出实施例2中的各组分，室温融化，放冰盒上 备用。加样前10分钟之内，按检测样本数配置PCR反应液X μ 1 :
[0064] X = (10 μ I PCR反应液+5 μ 1引物混合液+3 μ 1双蒸水）X (η份样本+1份阳性 对照+1份阴性对照+1份空白对照）。
[0065] 振荡混勻后，2000rpm离心5s，按每孔18 μ 1分装到96孔PCR反应板中，转至样本 制备区备用。
[0066] (2b)加样：向分装好试剂的反应孔中，分别加入待测细菌样本DNA模板2 μ 1 (若 样本裂解产物保存在-20°C，使用前置室温解冻，以13000rpm离心5min)，阳性对照孔加入 2 μ 1阳性对照，阴性对照孔加入2 μ 1阴性对照，空白对照孔加入2 μ 1双蒸水，加样过程要 求冰上操作。贴好封口膜，3000rpm离心30s，然后放入PCR仪中。
[0067] (2c)PCR扩增：Roche LighlCyclery?_ 480荧光定量PCR仪进行细菌氨基糖苷类耐 药基因检测，反应条件如下：95°C预变性3min ;95°C 10s，60°C 40s，40个循环，荧光采集点 在60°C，检测模式设置为染料法，反应体积设置为20。保存文件，运行。
[0068] (2d)结果分析，具体包括如下步骤：
[0069] Roche LightCyclcry_?_ 480荧光PCR检测仪点击分析，选取定量模式，进入分析窗 口，选定噪音线项，阈值设定为刚好超过无规则的噪音线的最高点（可根据实际情况适当 调整），且阳性曲线无拐点，保证噪音线项下的数值和分析项下的域值一致。每次实验空白 对照孔无 Ct值，结果合格。点击计算，自动计算得到每个测试的CT值。
[0070] (2e)阴阳性对照品结果标准及处理，具体按照如下步骤判定：
[0071] 阴性对照品PCR扩增的Ct值应无数值或大于40且增长曲线不规则；阳性对照品 PCR扩增增长曲线呈S型曲线且CT值小于35。
[0072] (3)步骤（2)所得的样本耐药基因检测结果判断，具体按照如下标准：
[0073] (3a)如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为无数值或大于40,则判样本结果为阴 性。
[0074] (3b)如果增长曲线呈S型曲线且Ct值〈40,则按以下方法判断：
[0075] 若样本的CT〈35,则判样本结果为阳性；
[0076] 检测样本Ct > 35,重新配制PCR反应液进行PCR扩增，复查结果如果增长曲线不 呈S型曲线或Ct值为无数值或大于40,则判样本结果为阴性。如果增长曲线呈S型且Ct 值仍旧小于40则判样本结果为阳性。
[0077] 实施例4 :临床患者细菌样品检测。
[0078] 将本发明所述的试剂盒用于40例临床氨基糖苷类耐药微生物感染者的细菌样本 5种氨基糖苷类耐药基因检测，检测方法按照实施例3中的步骤实施，检测结果与基因芯片 法对40例样品的检测结果进行比对，检测结果表1所示：
[0079] 表1样品检测结果对照表
[0080]
【主权项】
1. 一种检测细菌氨基糖苷类耐药基因的引物，其特征在于，它包括如下引物对： (1) 扩增aac (3)-II耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1?2所示； (2) 扩增aac (6'）-Ib耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3?4所示； (3) 扩增aph (3'）-111耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :5?6所示； (4) 扩增ant (3" )-Ia耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :7?8所示； (5) 扩增ant (4'）-Ia耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :9?10所示； 上述5对引物对在一次检测中共同使用。
2. 权利要求1所述的检测细菌氨基糖苷类耐药基因的引物在制备检测细菌氨基糖苷 类耐药基因的试剂中的应用。
3. -种检测细菌氨基糖苷类耐药基因的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下试 剂： (I)PCR反应液：该PCR反应液中含有DNA聚合酶、EvaGreen荧光染料、Mg2+、PCR反应 缓冲液、dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP ; ⑵引物混合液：将SEQ ID NO :1?10所示的10种引物混合，用双蒸水溶解，每条引 物的浓度为lymol/L ; (3) 阳性对照：分别含有 aac (3) -II、aac (6'）-Ib、aph (3'）-II、ant (3 ") -Ia 和 ant (4'）-Ia耐药基因的五种细菌基因组DNA和大肠杆菌基因组DNA的水溶液； (4) 阴性对照：大肠杆菌基因组DNA的水溶液。
4. 根据权利要求3所述的检测细菌氨基糖苷类耐药基因的试剂盒，其特征在于，阳性 对照中，每一种含耐药基因的细菌基因组DNA浓度为IOng/μ L，大肠杆菌基因组DNA浓度为 50ng/μ L0
5. 根据权利要求3所述的检测细菌氨基糖苷类耐药基因的试剂盒，其特征在于，阴性 对照中，大肠杆菌基因组DNA的浓度为IOOng/ μ L。
6. 权利要求3?5任一所述的检测细菌氨基糖苷类耐药基因的试剂盒在检测细菌氨基 糖苷类耐药基因中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种检测细菌氨 基糖苷类耐药基因的引物及试剂盒，属于微生物检测技术领域。本发明提供的引物序列如SEQ?ID?NO：1～10所示，通过在NCBI的基因序列库中比对 多种菌及临床隔离株氨基糖苷类耐药基因序列，在保守位点处设计的特异性引物，能够对多种细菌的aac(3)-II、aac(6')-Ib、 aph(3')-III、ant(3″)-1a、ant(4')-1a5种氨基糖苷类耐药基因进行快速检测。本发明还公开了包含上述引物的检测细菌氨基糖 苷类耐药基因的试剂盒，能快速、准确检测细菌氨基糖苷类抗生素相关耐药基因。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104561340
【申请号】CN201510033921
【发明人】任绪义, 虞闰六
【申请人】杭州迪安医学检验中心有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月23日