一种花椰菜杂交种指纹图谱及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物技术领域，具体的说，涉及一种花椰菜杂交种指纹图谱及其 构建方法。
【背景技术】
[0002] 我国是世界性人口大国，每天需求大量的蔬菜，其中，花椰菜营养丰富，风味鲜美， 是我国主要蔬菜种类之一。花椰菜（俗称花菜）属十字花科芸苔属甘蓝种，原产欧洲地中 海东部沿岸。19世纪中叶花椰菜在我国南部地区逐渐较广泛栽培。目前全国常年栽培面积 达400万亩。但是由于花椰菜上病害严重，尤其是黑腐病、霜霉病，制约了花椰菜的大面积 种植。上海富农种业有限公司多年从事花椰菜育种和销售工作，针对花椰菜的黑腐病、霜霉 病，通过杂交选育了新的花椰菜品种，田间试验证明其抗病能力强。为了保护该新品种的专 有权，我们对其进行了指纹图谱构建，确定其唯一识别码。SSR(Simple SequenceRepeat)， 又称为微卫星DNA，SSR标记随机、均匀、广泛地分布于整个基因组，以SSR为引物的分子标 记具有共显性遗传、多态性高、简单经济快速等优点，适用于指纹图谱构建。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于，针对目前种子繁育、生产、交易领域中存在的混乱现象和坑农 骗农事件时有发生，确定一种花椰材新品种的指纹图谱，用于同其他近缘种或同系列的花 椰菜品种进行区分。
[0004] 为了解决上述问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
[0005] 一种花椰菜杂交种指纹图谱的构建方法，其以花椰菜杂交种作为实验材料，利用 特有的SSR引物进行分子标记实验，制作花椰菜杂交种指纹图谱；其中：所述特有的SSR引 物为BRMS05引物、BRMS36引物和PBCGSSRBo24引物；其序列如表1所示。
[0006] 本发明中，利用特有的SSR引物进行分子标记实验时，其SSR分子标记反应体 系如下：MgCl2,2. 5mmol · Γ1，dNTPs 0· 2mmol · Γ1，IOOng SSR 引物，0· IU Taq 聚合酶， 1 μ 110XPCRBuffer，35ng DNA模板；反应程序为：94°C预变性2min，l个循环；94°C变性 lmin，63°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸lOmin，1个循环。
[0007] 本发明中，所述特有的SSR引物的筛选方法具体如下：
[0008] (1)利用花椰菜杂交种的父母本作为实验材料，优化SSR分子标记反应体系；
[0009] (2)利用花椰菜杂交种的父母本作为实验材料，利用已优化的SSR分子标记反应 体系，筛选具有多态性的SSR标记引物；
[0010] (3)利用花椰菜杂交种及其父母本作为实验材料，验证已筛选的SSR标记引物在 三者之间是否具有多态性，确定该花椰菜杂交种的多态性SSR引物；
[0011] (4)利用该花椰菜杂交种及其他花椰菜品种作为实验材料，验证已筛选花椰菜杂 交种多态性SSR引物是否能区分该花椰菜杂交种与其他花椰菜品种，确定该花椰菜杂交种 特有的SSR引物。
[0012] 本发明进一步提供上述构建方法获得的花椰菜杂交种指纹图谱。本发明中，以I 和0分别代表某个等位基因位点扩增DNA条带的有无，按照从上到下即由大片段向小片段 的读带方向，将分子标记指纹图谱转换为由1和〇组成的字符串，构成数字指纹图谱；其特 有的SSR引物为BRMS05时，数字指纹为111 1 ;其特有的SSR引物为BRMS36时，数字指纹为 〇 11。其特有的SSR引物为PBCGSSRBo24时，数字指纹为000。
[0013] 本发明中，所述花椰菜杂交种是指上海富农种业有限公司经过多年杂交繁育的一 个新花椰菜品种，该新花椰菜品种暂命名为"申雪108天"，其以细胞质雄性系AW-100为母 本，自交系C-3为父本杂交，经过多年选育而得的；其抗黑腐病、霜霉病能力强，适合于长江 中下游的广大区域种植，一般定植后108天左右能够成熟。
[0014] 本发明的有益效果是：本发明中得到的指纹图谱具有唯一性，可以用于花椰菜杂 交新品种的认定；可以用于田间育种时去杂，节约大量的人力物力；可以作为标识贴于种 子包装上利于销售，防止不良商家制假种；可以用于种子购买者进行鉴别，避免购买到假种 子造成巨大损失；从而保护生产者和种子购买者的利益。
【附图说明】
[0015] 图1为实施例1的分子标记指纹图谱和数字指纹图谱图示。
[0016] 图2为实施例2的分子标记指纹图谱和数字指纹图谱图示。
[0017] 图3为实施例3的分子标记指纹图谱和数字指纹图谱图示。
【具体实施方式】
[0018] 下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0019] 实施例1
[0020] 本发明中特有的SSR引物筛选具体步骤如下：
[0021] (1)利用花椰菜杂交种"申雪108天"的父母本作为实验材料，细胞质雄性系 AW-100为母本，自交系C-3为父本，参照Uzunova和Ecke (1999)的SSR分析方法，优化SSR 分子标记反应体系，SSR分子标记反应体系如下：MgCl2, 2. 5mmol · I71，dNTPs 0. 2mmol · I71， IOOng SSR 引物，0· IU Taq 聚合酶，1 μ I 10XPCRBuffer，35ng "申雪 108 天" DNA 模板；
[0022] (2)利用花椰菜杂交种"申雪108天"的父母本作为实验材料，利用已优化的SSR 分子标记反应体系，筛选出26对具有多态性的SSR标记引物，包括BRMS05、BRMS06、BRMS08、 BRMS15、BRMS16、BRMS25、BRMS30、BRMS36、BRMS42-2、BRMS54、BRMS71、BRMS296、BRMS324、 Bn38A、Bn59A、ENA4、ENA7、EJU4、PBCGSSRBol5、PBCGSSRB0I8、PBCGSSRBo24、CN52、CN57、 CB10036、CB10299、CB10373 ;
[0023] (3)利用花椰菜杂交种"申雪108天"及其父母本作为实验材料，验证已筛选的 SSR标记引物在三者之间是否具有多态性，确定该花椰菜杂交种的多态性SSR引物6对包括 BRMS05、BRMS36、BRMS324、PBCGSSRBo24、Bn38A、ENA7 ;
[0024] (4)利用该花椰菜杂交种"申雪108天"及C0MS05 XBI、C0MS05 XW3杂交种、W3 X 23 杂交种等花椰菜品种作为实验材料，验证已筛选花椰菜杂交种多态性SSR引物是否能区分 该花椰菜杂交种与其他花椰菜品种，确定该花椰菜杂交种区分的其他品种的有效SSR引物 BRMS05，BRMS36和PBCGSSRBo24,引物序列见表1。BRMS05引物序列分别如SEQ ID NO: 1和 SEQ ID N0:2所示；BRMS36 引物序列分别如 SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示；PBCGSSRBo24 引物序列分别如SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示。
[0025] 表1引物序列
[0026]
【主权项】
1. 一种花椰菜杂交种指纹图谱的构建方法，其特征在于，其以花椰菜杂交种作为实验 材料，利用特有的SSR引物进行分子标记实验，制作花椰菜杂交种指纹图谱；其中：所述特 有的SSR引物为BRMS05引物、BRMS36引物和PBCGSSRBo24引物。
2. 如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，利用特有的SSR引物进行分子标记实 验时，551?分子标记反应体系如下：]\%(：1 2,2.5臟〇1.171，(1阶138 0.2臟〇1.171，100叩351?弓| 物，0· IU Taq 聚合酶，1 μ I 10XPCRBuffer，35ng DNA模板；反应程序为：94°C预变性 2min， 1个循环；94°C变性lmin，63°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸lOmin，1 个循环。
3. 如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述特有的SSR引物的筛选方法具体如 下： (1) 利用花椰菜杂交种的父母本作为实验材料，优化SSR分子标记反应体系； (2) 利用花椰菜杂交种的父母本作为实验材料，利用已优化的SSR分子标记反应体系， 筛选具有多态性的SSR标记引物； (3) 利用花椰菜杂交种及其父母本作为实验材料，验证已筛选的SSR标记引物在三者 之间是否具有多态性，确定该花椰菜杂交种的多态性SSR引物； (4) 利用该花椰菜杂交种及其他花椰菜品种作为实验材料，验证已筛选花椰菜杂交种 多态性SSR引物是否能区分该花椰菜杂交种与其他花椰菜品种，确定该花椰菜杂交种特有 的SSR引物。
4. 如权利要求1或2或3所述的构建方法获得的花椰菜杂交种指纹图谱。
5. 如权利要求4所述的花椰菜杂交种指纹图谱，其特征在于：以1和0分别代表某个 等位基因位点扩增DNA条带的有无，按照从上到下即由大片段向小片段的读带方向，将分 子标记指纹图谱转换为由1和0组成的字符串，构成数字指纹图谱，其数字指纹为1111。
【专利摘要】本发明属于分子生物技术领域，具体为一种花椰菜杂交种指纹图谱及其构建方法。该花椰菜杂交种暂时被命名为“申雪108天”，是由上海富农种业有限公司经过多年杂交繁育的新花椰菜品种。本发明利用SSR分子标记对“申雪108天”进行定性标记，建立其区分其他近缘种或同系列的花椰菜品种的指纹图谱。适用于花椰菜“申雪108天”品种的认定、销售和农户甄别真假。本发明易于掌握，可保护生产者和种子购买者的利益。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104561338
【申请号】CN201510032436
【发明人】王新华, 刘杨, 高莉洁, 周腾夏, 胡继军
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月22日