一种检测来源于结核分枝杆菌的待测dna分子中snp位点的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测来源于结核分枝杆菌的待测DNA分 子中SNP位点的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 基因多态性广泛存在于各种生物体基因组。已经发现结核分枝杆菌存在成千上万 的各种基因位点多态性和变化。这些基因多态性为研宄结核分枝杆菌的生长、药物刺激反 应或耐药性、菌种鉴定、以及应对宿主的免疫反应等方面起重要作用。
[0003] 生物芯片是一种高通量检测基因型的强有力工具，广泛应用于各种生物体。然而 生物芯片的敏感性和特异性问题仍然存在问题。传统杂交技术不能满足人类疾病样本内低 含量病原体检测的需求。生物体基因组内存在大量的基因多态位点，常见的基因多态性包 括基因转座、插入、缺失、染色体倒位、随机短重复序列（STR)、微卫星以及单核苷酸多态性 (SNPs)，其中，SNP是最为常见的基因多态性形式。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种检测待测结核分枝杆菌基因组DNA分子中SNP位点 的试剂盒。
[0005] 本发明提供的检测待测结核分枝杆菌基因组DNA分子中SNP位点的试剂盒包括生 物芯片；
[0006] 所述生物芯片为在基质上固定多个用于检测SNP位点的探针组得到的芯片；
[0007] 所述用于检测SNP位点的多个探针组由多个探针组成，每个所述探针组对应一个 SNP位点；
[0008] 每个所述探针组由野生型SNP位点探针和突变型SNP位点探针组成；
[0009] 所述野生型SNP位点探针的3'端与野生型SNP位点所在靶序列相同或互补，且其 3'末端碱基与所述野生型SNP位点碱基相同或互补；
[0010] 所述突变型SNP位点探针的3'端与突变型SNP位点所在靶序列相同或互补，且其 3'末端碱基与所述突变型SNP位点碱基相同或互补。
[0011] 上述试剂盒中，所述待测结核分枝杆菌为结核分枝杆菌M. tuberculosis H37Rv、 结核分枝杆菌M. tuberculosis Q3C1551、结核分枝杆菌M. tuberculosis 210、卡介苗 Ebovis BCG或牛结核分枝杆菌Mbovis AF2122;
[0012] 所述 SNP 位点为 katG-1、katG-2、katG-3、inhA-Ι 和 / 或 inhA-2 ;
[0013] 用于检测结核分枝杆菌M. tuberculosis H37Rv、结核分枝杆菌M. tuberculosis Q3C1551、结核分枝杆菌M. tuberculosis 210、结核分枝杆菌卡介苗M. bovis BCG或牛结核 分枝杆菌M. bovis AF2122的katG-1位点的探针组均由野生型SNP位点探针katG-1-C和 突变型SNP位点探针katG-1-A组成；所述katG-1-C探针的序列如序列表中序列1所示；所 述katG-1-A探针的序列如序列表中序列2所示；
[0014] 用于检测结核分枝杆菌M tuberculosis H37Rv、结核分枝杆菌M tuberculosis Q3C1551、结核分枝杆菌M. tuberculosis 210、结核分枝杆菌卡介苗M. bovis BCG或牛结核 分枝杆菌M. bovis AF2122的katG-2位点的探针组均由野生型SNP位点探针katG-2-G和 突变型SNP位点探针katG-2-T组成；所述katG-2-G探针的序列如序列表中序列3所示；所 述katG-2-T探针的序列如序列表中序列4所示；
[0015] 用于检测结核分枝杆菌M. tuberculosis H37Rv、结核分枝杆菌M. tuberculosis Q3C1551、结核分枝杆菌M. tuberculosis 210、结核分枝杆菌卡介苗M. bovis BCG或牛结核 分枝杆菌M. bovis AF2122的katG-3位点的探针组均由野生型SNP位点探针katG-3-T和 突变型SNP位点探针katG-3-A组成；所述katG-3-T探针的序列如序列表中序列5所示；所 述katG-3-A探针的序列如序列表中序列6所示；
[0016] 用于检测结核分枝杆菌M tuberculosis H37Rv、结核分枝杆菌M tuberculosis Q3C1551、结核分枝杆菌M. tuberculosis 210、结核分枝杆菌卡介苗M. bovis BCG或牛结核 分枝杆菌M. bovis AF2122的inhA-Ι位点的探针组均由野生型SNP位点探针inhA-1-A和 突变型SNP位点探针inhA-1-T组成；所述inhA-1-A探针的序列如序列表中序列7所示；所 述inhA-1-T探针的序列如序列表中序列8所示；
[0017] 用于检测结核分枝杆菌M. tuberculosis H37Rv、结核分枝杆菌M. tuberculosis Q3C1551、结核分枝杆菌M. tuberculosis 210、结核分枝杆菌卡介苗M. bovis BCG或牛结核 分枝杆菌M. bovis AF2122的inhA-2位点的探针组均由野生型SNP位点探针inhA-2-C和 突变型SNP位点探针inhA-2-G组成；所述inhA-2-C探针的序列如序列表中序列9所示；所 述inhA-2-G探针的序列如序列表中序列10所示。
[0018] 上述所述试剂盒中，还包括用于扩增所述SNP位点的DNA片段的引物对；
[0019] 用于扩增katG-l、katG-2和/或katG-3的引物对1由SEQ ID No. 13所示的单链 DNA和SEQ ID No. 14所示的单链DNA组成；
[0020] 用于扩增inhA-Ι和/或inhA-2的引物对2由SEQ ID No. 15所示的单链DNA和 SEQ ID No. 16所示的单链DNA组成。
[0021] 上述试剂盒中，所述katG-Ι位点的核苷酸为序列11的第44位核苷酸；所述 katG-2位点的核苷酸为序列11的第62位核苷酸；所述katG-3位点的核苷酸为序列11的 第53位核苷酸；所述inhA-Ι位点的核苷酸为序列12的第51位核苷酸；所述inhA-2位点 的核苷酸为序列12的第71位核苷酸。
[0022] 本发明的另一个目的是提供一种探针组。
[0023] 本发明提供的探针组由如下（I)-(IO)所述的探针组成：
[0024] (1)如序列表中序列1所示的探针katG-1-C ;
[0025] (2)如序列表中序列2所示的探针katG-1-A ;
[0026] (3)如序列表中序列3所示的探针katG-2-G ;
[0027] (4)如序列表中序列4所示的探针katG-2-T ;
[0028] (5)如序列表中序列5所示的探针katG-3-T ;
[0029] (6)如序列表中序列6所示的探针katG-3-A ;
[0030] (7)如序列表中序列7所示的探针inhA-1-A ;
[0031] (8)如序列表中序列8所示的探针inhA-l-T ;
[0032] (9)如序列表中序列9所不的探针inhAK ;
[0033] (10)如序列表中序列10所示的探针inhA-2-G。
[0034] 本发明还有一个目的是提供一种试剂组。
[0035] 本发明提供的试剂组由上述探针组和引物对组成；
[0036] 所述引物对由引物对1和引物对2组成；
[0037] 所述引物对1为由SEQ ID No. 13所示的单链DNA和SEQ ID No. 14所示的单链 DNA组成；
[0038] 所述引物对2为由SEQ ID No. 15所示的单链DNA和SEQ ID No. 16所示的单链 DNA组成。
[0039] 上述试剂盒或上述探针组或上述试剂组在检测待测结核分枝杆菌基因组DNA分 子中SNP位点中的应用也属于本发明的保护范围。
[0040] 上述应用中，所述待测DNA分子为结核分枝杆菌的基因组DNA全长或部分片段；
[0041] 所述部分片段是由上述引物对1或引物对2扩增得到的；
[0042] 所述 SNP 位点为 katG-1、katG-2、katG-3、inhA-Ι 和 / 或 inhA-2。
[0043] 本发明的最后一个目的是提供一种检测待测结核分枝杆菌基因组DNA分子中SNP 位点为突变型还是野生型的方法。
[0044] 本发明提供的检测待测结核分枝杆菌基因组DNA分子中SNP位点为突变型还是野 生型的方法包括如下步骤：
[0045] (1)在上述生物芯片上用所述探针组对待测DNA分子进行微型测序扩增反应，得 到微型测序扩增产物；
[0046] 所述微型测序扩增反应包括如下步骤：将待测DNA分子、微型测序扩增缓冲试 剂混匀得到的混合液加入所述生物芯片上，进行微型测序扩增反应，得到微型测序扩增产 物；
[0047] 所述微型测序扩增缓冲试剂由荧光标记的dNTP、测序酶、扩增缓冲液和水组成；
[0048] (2)检测所述微型测序扩增产物的荧光信号；
[0049] 根据所述微型测序扩增产物的荧光信号，按照包括如下步骤的方法确定待测DNA 分子的SNP位点是野生型还是突变型：若所述微型测序扩增产物在野生型探针所在的芯片 位置上有荧光信号，则待测DNA分子中SNP位点为或候选为野生型位点；若所述微型测序扩 增产物在突变型探针所在的芯片位置上有荧光信号，则待测DNA分子中SNP位点为或候选 为突变型位点。
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