一种快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，具体为一种基于荧光PCR技术对绿潮爆发主要石莼属 藻种：浒苔、扁浒苔、曲浒苔、缘管浒苔的鉴定方法。
【背景技术】
[0002] "绿潮"(Green tide)是由于水体的富营养化，适宜的环境因子等因素引发的由石 莼属、硬毛藻属和刚毛藻属等大型海洋绿藻过度增殖、暴发性飘浮生长导致海水表面呈现 一片绿带的有害生态异常现象。近年来，绿潮暴发的频率和发生的地理范围呈增长趋势，已 逐渐成为世界性的海洋环境与生态问题。亚洲的中国、日本，美洲的美国、加拿大，欧洲的法 国等国家，均持续暴发了"绿潮"。世界范围内的大型藻华，包括绿潮，多发生在封闭或半封 闭的海湾。但在我国，黄海绿潮不同，它是发生在一个开阔的海域。自2007年起至2014年， 连年暴发。特别是2008年青岛海域暴发了世界上最大规模的绿潮，也危及到奥帆赛的顺利 举行，巨大的生物量和大面积的影响范围，给沿岸生态以及旅游经济造成了严重的负面影 响。从而引起了有关政府机构和相关学者的高度重视和媒体的广泛关注。为了更好的对绿 潮的发生进行溯源，并进一步达到预防、治理进而合理利用绿潮的目的，那么对引发绿潮 的物种一一浒苔类藻类，进行鉴定技术的探宄则是十分必要的。
[0003] 需要进行鉴定的引发绿潮的浒苔藻种主要有：曲浒苔、浒苔、缘管浒苔和扁浒苔。 目前用于浒苔鉴定技术主要基于以下几种：传统鉴定法、杂交测试法、分子生物学鉴定法。
[0004] 传统分类学研宄是从形态学和解剖学入手的，主要包括：个体水平研宄藻体的形 态特征和生活史特点，细胞水平研宄藻体细胞大小和排列方式、细胞分裂特点和生殖发育 方式等，亚细胞水平研宄细胞器的形态结构和定位特征等。技术方法上主要涉及野外采集、 纯系培养、组织培养、切片染色、光镜电镜技术等。（Tayloretal. 1999 ;Stanleyetal. 1999 ; Callowetal. 2000 ;Rusig&Cosson2001 ;Hiraoka&Oka 2008)通常依据上述研宄结果，制订 相关分类标准并作为种水平鉴定的依据。然而，石莼属绿藻在藻体形态、分枝程度、细胞和 亚细胞水平的形态特征都会因为环境因子的诱导而发生不同程度的变化。这些种内形态的 较大变化和种间形态的相近给传统分类学研宄以巨大的挑战，造成了石莼属绿藻物种水平 鉴定的难度，不利于通过形态学进行石莼属绿藻的资源调查研宄。
[0005] 杂交测试法（Crossingtest)也是用来鉴定石蘇属绿藻并分析绿潮构成种的有 效方法，它通过已知绿藻与未知绿藻释放的配子能否杂交，来检测石莼属绿藻之间的亲缘 关系。Hiraoka et al. (2003)报道了来自日本南部和西部海岸的一种新的绿潮形成种 Ulvaohnoi，形态和分子生物学研宄都表明，U. ohnoi不同于其它的石蘇属绿藻，杂交测试法 表明U. ohnoi与亲缘最近的U. fasciata和U. reticulata有杂交障碍，U. ohnoi不能够和 U. reticulata杂交，U. ohnoi与U. fasciata仅能发生很少的杂交，但无法分离获得杂交后 代（Hiraoka M, 2004)〇
[0006] 然而，分子生物学鉴定方法的引入克服了形态学研宄方面的很多不足，为我们提 供了石蘇属绿藻更多的进化和遗传信息。通过对ITS、rbcL、coxl、5S、18S等DNA序列的比 对分析，使用最大似然法（ML)，邻接法（NJ)，最大简约法（MP)、最小进化法（ME)等聚类分析 方法构建进化树，可以从分子系统学角度认识石莼属绿藻种间和同一物种不同地理隔离种 群间的亲缘关系（尹顺吉，等2009;K 〇stam〇 et al.2008)。但是总的来说，目前现有技术 的检测方法耗时长，费用较高。
【发明内容】
[0007] 本发明旨在提供一种快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法，能够快速准确地鉴别浒苔 (U. Prolifera)、扁消1 苔（U. Compressa)、曲消1 苔（U. flexuosa)和缘管消1 苔（U. Linza)。
[0008] 技术方案为，一种快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法，步骤包括：
[0009] 用待测绿潮浒苔类藻类的总DNA为模板，进行以下荧光PCR检测：测体系A为 TaqMan体系，检测体系B为SYBR Green体系；
[0010] 检测体系A中，加入相应的特异性引物和TaqMan探针，用TaqMan体系进行qPCR 扩增和荧光检测；
[0011] 扁浒苔的特异性引物上游序列C-its-arms-F包括SEQ ID No. 1的核 苷酸：GGCGTCCGCCGTTTT，下游序列 C-its-arms-R 包括 SEQ ID No. 2 的核苷酸： GCAGAAGGTTTCATGGGTTAGG，TanMan 探针 C-its-arms-p 包括 SEQ ID No. 3 的核苷酸： CCGGTGAGGTGCGCTCCCC ；
[0012] 曲浒苔的特异性引物上游序列F-5s-F包括SEQ ID No. 4的核苷酸： TCGTCCGGGTTCTCGACG，下游序列 F-5s-R 包括 SEQ ID No. 5 的核苷酸：CTGGCGCGAAACATGGC， TanMan 探针 F-5s-P 包括 SEQ ID No. 6 的核苷酸：CCTCATTCCTTCCCCATGTCGCCAA ;
[0013] 缘管浒苔和浒苔的特异性引物上游序列P-hsp-F包括SEQ ID No. 7的 核苷酸：CAACAACCTGCTGGGCAAGT，下游序列 P-hsp-R 包括 SEQ ID No. 8 的核苷 酸：TCGAACACGACCTCGATTTG，TanMan 探针 P-hsp-P 包括 SEQ ID No. 9 的核苷酸： CGACCTCACCGGGATTCCTCCC ；
[0014] 所述的三种TaqMan探针的5'端连接上分别连接不同的报告染料，3'端连接淬灭 基团；
[0015] 根据相应荧光信号和特异性扩增曲线，确定样品是否为扁浒苔或曲浒苔，或者是 缘管浒苔和浒苔中的一种；
[0016] 检测体系B中，加入缘管浒苔的特异性引物，用SYBR Green体系进行qPCR扩增， 并进行荧光检测；
[0017] 缘管浒苔的特异性引物上游序列L-5s-arms-F包括SEQ ID No. 10的核苷 酸 TCCCCTGTGCTGTATCGCTAT，下游序列 L-5s-arms-R 包括 SEQ ID No. 11 的核苷酸： CGGCCGCTGTAGACAGATG ；
[0018] 在检测体系A中鉴定为缘管浒苔或浒苔，并且在检测体系B中出现特异性扩增曲 线的，为缘管浒苔；在检测体系A中鉴定为缘管浒苔或浒苔，并在检测体系B中未出现特异 性扩增曲线的，为浒苔。
[0019] 优选的，检测体系A中，扁浒苔的特异性引物上游和下游序列分别如SEQ ID No. 1 和2所示，TanMan探针C-its-arms-p的序列如SEQ ID No. 3所示；曲消1苔的特异性引物上 游和下游序列分别如SEQ ID No. 4和5所示，TanMan探针F-5s-P的序列如SEQ ID No. 6 所示；缘管浒苔和浒苔的特异性引物上游和下游引物序列分别如SEQ ID No. 7和8所示， TanMan探针P-hsp-P的序列如SEQ ID No. 9所示。
[0020] 优选的，检测体系A中，TaqMan探针的报告染料选自VIC、ROX、FAM(6-羧基荧光 素）、CY5、CY3或HEX为TAMRA，淬灭基团为BHQ-2或MGB。
[0021] 优选的，检测体系B中，缘管浒苔的特异性引物上游和下游序列分别如SEQ ID No. 10和11所示。
[0022] 优选的，检测体系A的扩增条件为：49°C?50. 5°C预变性IOOs?135s ;94. 5? 96°C预变性 4. 5 ?6min ;94· 5 ?96°C变性 9 ?12s、54. 5 ?56. 5°C退火 9 ?10s、70 ?74°C 延伸28?32s、5?8个循环；并在94. 5?96°C变性9?12s、58?61°C下退火28?34s 并采集信号，28?30个循环。更优选的扩增条件为：95°C预变性5min ;95°C变性10s、58°C 下退火10s、72°C下延伸38?45s并采集信号，30个循环。
[0023] 优选的，检测体系B的扩增条件为：94. 5?96°C预变性4. 5?6min ;94. 5?96°C 变性9?12s、58?61°C下退火9?10s、70?75°C下延伸38?45s并采集信号，32?40 个循环。更优选的扩增条件为：95°C预变性5min ;95°C变性10s、58°C下退火10s、72°C下延 伸38?45s并采集信号，35个循环。
[0024] 本发明基于TaqMan探针荧光PCR技术，通过ITS基因序列、5S rDNA间隔区序列、 热休克蛋白70基因等，在Gene Bank里筛选出浒苔、缘管浒苔、曲浒苔、扁浒苔已知的基因 进行同源性比对。利用Primer Express 3.0设计特异性引物和探针，鉴定以上几种浒苔。
[0025] 由于浒苔和缘管浒苔的ITS序列完全一致，而5S相似性极高。难以设计通用引物， 因此，进一步采用SYBR Green荧光PCR将TaqMan探针不能进行分辨的浒苔和缘管浒苔，利 用缘管浒苔的ARMS引物进行区分。
[0026] 本发明的技术关键在于：
[0027] 一、首次采用了分子检测前沿技术之一突变扩增阻滞系统（amplif ication refractory mutation system，ARMS)技术，通过序列比对后得到的缘管消1苔的5SrDNA间隔 区序列的SNP位点、扁浒苔的ITS基因的SNP位点设计了引物。ARMS技术利用特异引物对 突变靶序列进行高精准PCR扩增放大。与此同时，利用探针对扩增产物进行检测，在TaqMan 荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测，以达到对基因突变检测的高特异 性和高灵敏度。
[0028] 二、首次使用了 TaqMan结合SYBR Green荧光PCR技术进行鉴定大型藻类。
[0029] 1、利用HSP70热休克蛋白基因设计的TaqMan探针P-5s-p和引物P-hsp70-F/_R， 用于鉴定浒苔和缘管浒苔的组成的簇。
[0030] 2、针对5SrDNA间隔区序列并采用ARMS技术设计的引物L-5s-arms-F/-R通过 SYBR Green技术进行荧光PCR，用于从浒苔和缘管浒苔的簇中筛选出缘管浒苔。
[0031] 3、针对5S rDNA间隔区序列设计的TaqMan探针F-5s-p以及引物F-5S-F/-R，用于 鉴定曲浒苔。
[0032] 4、针对ITS序列设计结合ARMS技术设计的TaqMan探针C-its-arms-p和引物 C-its-arms-F/R通过TaqMan进行焚光PCR，用于鉴定扁消1苔。
[0033] 与常规鉴定相比，本发明的优势在于：传统的绿潮浒苔类藻类的分子鉴定需要先 提取DNA，然后PCR扩增、电泳、测序并根据测序结果进行序列比对和构建系统发育树进而 得出结果。耗时至少一星期才可以出结果，如果中途有任何环节上失败，如DNA提取失败， 测序失败等。少则耗时半月，多则一个月，而且测序费用成本高，还要额外加上PCR试剂