专利名称：一种基于pcr-dgge水体蓝藻检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及到生物技术、分类学、生态学及水环境监测领域，特别是涉及一种利用蓝藻鉴定标准Marker快速检测自然水体蓝藻种类的PCR-DGGE方法，同时还涉及快速检测水体蓝藻种类的PCR-DGGE试剂盒。
背景技术：
蓝藻水华已经成为一个严重的环境问题，了解自然水体存在的蓝藻种类有利于开展预防和治理工作。传统的显微镜观察方法需要丰富的藻类分类学知识，并且对属内种与种之间的区分非常困难，而通过分子生物学PCR-DGGE技术能将藻类鉴定到种，目前已有的蓝藻分子检测技术需要借助对PCR产物的测序和数据库比对分析，检测周期长且花费大，因此，需要建立一种基于PCR-DGGE技术的快速检测方法。本发明通过制备蓝藻种类鉴定标准Marker,在不对PCR-DGGE产物测序的情况下，可以直接利用蓝藻鉴定标准Marker进行电泳条带分析，确定水体中的主要蓝藻种类和群落结构组成。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种基于PCR-DGGE水体蓝藻检测方法，在使用标准Marker的基础上，该方法鉴定速度快，不需对DGGE产物测序，蓝藻鉴别能力强，结果可靠。
本发明的另一个的目的是在于提供了一种基于PCR-DGGE水体蓝藻检测试剂盒，该试剂盒成分简单，成本较低，能同时检测多个水样，且易操作。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施
—种基于PCR-DGGE水体蓝藻检测方法其步骤是 A、制备变性梯度胶按照DGGE装置说明书(如Bio-Red公司)，制备丙稀酰氨浓度为8%、变性梯度范围为25% _45%的变性梯度胶。 B、采集水体样品，用浮游生物网浓縮后，反复(2-3次)冻融释放出蓝藻DNA，倒入分液漏斗静置30sec后，取中间部分的水样(约lOmL)，进一步离心，将其转入1. 5mLEP管中，离心后，用去离子水反复洗涤3次后，加入50yL去离子水，反复冻融2次后[-80。C (5min)/80。C (5min)]，再次-80。C冷冻5min后，直接在旋涡仪上vortex lmin后，在8(TC水浴中静置2min， 5000rpm/min离心lmin，用移液枪取1 y L上清溶液作为模板DNA加入PCR管； C、取1 ii L上清溶液作为模板DNA加入PCR管，进行PCR扩增反应，反应条件为94°C预变性5min， 94°C 40sec， 55_58°C (每个循环后退火温度降低1°C ) ， 72°C 30sec，循环4次，接着94°C 40sec，55。C 30sec，72。C 30sec，循环27次，接着72。C延伸10min，最后温度降至12。C恒温30min ; D、将标准DNA marker和PCR产物分别加入不同泳道，以50V-30min， 120V_7h的条件进行DGGE电泳；E、染色，拍照，并对结果进行分析，鉴定出水体中蓝藻的种类。 一种基于PCR-DGGE水体蓝藻快速检测试剂盒，该试剂盒包括以下几部分 A、PCR相关试剂①蓝藻鉴定特异性引物，其序列如下上游引物5' -CGCCCG CCGCGC CCC GCG CCC GGCCCG CCG CCC CCG CCC C-GTC ACGCCC GAAGTC GTTAC-3';下游引物5' -CTAACCACC TGAGCTAAT-3'。②热聚合酶(Taq酶)；③dNTPs包括ATP、 GTP、 CTP、 TTP)。
B、自行制备的蓝藻鉴定标准marker。其制备方法包括两种途径
(1)利用PCR-DGGE反应制备①选定已知的蓝藻种类，利用本发明所述的方法，首先进行一次PCR反应。在紫外灯下，利用一次性20iiL白色小枪头，从变性梯度胶上的目的条带的中间位置取少许含有DNA片断的胶，将粘有胶末的枪头小心放入1. 5mL的EP管中，加入50ii L去离子水，在8000rpm/min的条件下离心lmin，确保胶末浸入水中，置于4t:中过夜。②取上述的浸泡液IP L，稀释IOO倍后，再取稀释液liiL作为模板DNA加入50iiLPCR反应体系中进行二次PCR扩增(每个循环的Ta = 58t:，其余条件同第一次PCR)，将PCR产物测序，接着把测序结果登陆网站NCBI，利用Blast进行搜寻，从而确定序列所对应的物种。③将多个(1-50)测序后的目的条带的二次PCR产物混合，进一步纯化浓縮得到含有多个(1-50)已知物种特异条带的标准Marker混合溶液，通过PCR-DGGE电泳，将含有多个(1-50)条带的标准Marker溶液与混合前的各种单一条带的PCR产物进行比较，从而确定标准Marker泳道从上至下各个条带(即对应的物种)的排列顺序。 (2)利用人工合成的方法制备根据上述已知蓝藻物种PCR-DGGE产物测序结果，通过人工合成蓝藻种类鉴定标准Marker，将含有多个(1_50)物种标准Marker混合，并与制备的单一物种条带特异性Marker进行DGGE比较分析，从而确定标准Marker泳道从上至下各个条带(即对应的物种)的排列顺序。C、 DGGE电泳相关试剂7L 1XTAE缓冲液，16mL25X和45%的变性梯度胶配置液
(含8X聚丙稀酰氨胶浓度)，30iiL 10% APS，15iiLTEMED。 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果 1.能快速鉴定水样的蓝藻种类及群落结构； 2.能同时对多个不同时空的样品进行直观的比较分析； 3.灵敏度高； 4.成本低，检测速度快，容易操作。
图1为一种水体蓝藻快速检测试剂盒的应用示意图。 利用本发明方法及快速检测试剂盒检测两个自然水体蓝藻群落的结果。从图中可以看出，可以看出水体l含有Phormidium autumale ArthrospiraplatensisSynechocystis sp Synechocystis sp等藻类，水体2含有Anabaena spPhormidiumautumale Synechocystis sp Synechocystis sp等藻类。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明做进一步说明
实施例1 : —种基于PCR-DGGE水体蓝藻检测方法，其步骤是
A、变性梯度胶制备在DGGE电泳槽中加入约7L 1 XTAE缓冲液，并开启预热装置，将缓冲液预热至6(TC。分别取16mL 25%和45%的聚丙烯酰胺变性梯度胶配置液，加入30iiL 10XAPS和15iiL TEMED后，迅速灌胶，制得丙稀酰氨胶浓度为8% 、变性梯度胶范围为25% _45%的变性梯度胶。 B、从深圳石岩水库采集的样品1和从深圳铁岗水库采集的样品2(均取1000mL水样)，用浮游生物网浓縮，倒入分液漏斗静置30sec后，取中间部分的水样(约10mL)，进一步离心，将其转入1. 5mL EP管中，用去离子水反复洗涤3次后，加入50 ii L去离子水，反复冻融2次后[-8(TC (5min)/8(TC (5min)]，再次-8(TC冷冻5min后，直接在旋涡仪上vortexlmin后，在8(TC水浴中静置2min， 5000rpm/min离心lmin，用移液枪取1 y L上清溶液作为模板DNA，以备进行PCR-DGGE分析。 C、以50iiL的反应体系进行PCR反应。反应条件为94"C预变性5min， 94°C 40sec，58 °C -55 °C (每个循环后退火温度降低1°C )，72°C 30sec，循环4次，接着94°C 40sec，55°C 30sec，72。C 30sec，循环27次，接着72。C延伸10min，最后温度降至12。C恒温30min得到PCR产物。 D、DGGE电泳①取标准Marker样品20 ii L，在胶的最中间泳道上样，待检测样品上样量为20-50 ii L。②设置电泳条件50V-30min， 120V-7h。 E、染色及拍照将变性梯度胶小心置于装有100mL的染色液玻璃器皿，在慢速摇床上放置lh后，凝胶成像系统中观察、拍照。 F、结果鉴定分析见图1 ，对照制备蓝藻鉴定标准Marker (包含15条具有代表性的特异性条带)，可以看出样品l(石岩水库水样)含有Phormidiumaut咖ale Arthrospiraplatensis Synechocystis sp Synechocystis sp等藻类，样品2 (深圳铁岗水库水样)含有Anabaena sp Phormidium autumale Synechocystis spSynechocystis sp等藻类。
实施例2 : —种基于PCR-DGGE水体蓝藻快速检测试剂盒，该试剂盒包括 A、 PCR反应试剂PCR 10Xbuffer (含MgCl2)，正向引物和反向引物，dNTPs， Taq
DNA聚合酶，无菌双蒸水； B、自行制备的标准marker,从上至下的DGGE电泳条带依次为1 :Anabaenasp， 2 :Phormidium autumale， 3-Microcystis sp， 4 :Phormidium sp， 5 :Arthrospir即latensis，6 -Microcystis sp，7 :Cylindrospermopsis raciborskii，8 :Raphidiopsis sp，9:L印tolyngbya badia，10 :Cylindrospermopsis raciborskii，11 -Synechocystis sp，12 :Phormidium sp，13 :Synechocystis sp，14 :Synechocystis sp，15 :Synechocystis sp
C、 DGGE电泳相关试剂7L IXTAE缓冲液，25%和45%的丙稀酰氨变性梯度胶配置液(含8%丙稀酰氨胶浓度)，10% APS和TEMED。
权利要求
一种基于PCR-DGGE水体蓝藻检测方法其步骤是A、水样采集与处理从自然水体采集含蓝藻的水样，通过浮游生物网浓缩，倒入分液漏斗静置30sec后，取中间部分的水样进一步离心，将其转入1.5mLEP管中，用去离子水反复洗涤3次后，加入50μL去离子水，反复冻融2次后，再次在-80℃冷冻5min，直接在旋涡仪上Vortex 1min后，在80℃水浴中静置2min，5000rpm/min离心1min，用移液枪取1μL上清溶液作为模板DNA加入PCR反应管；B、变性梯度胶制备按照DGGE装置说明书，制备丙稀酰氨浓度为8％、变性梯度范围为25％-45％的变性梯度胶；C、PCR反应取1μL上清溶液作为模板DNA加入PCR管，进行PCR扩增反应，反应条件为94℃预变性5min，94℃40sec，55-58℃、72℃各30sec，循环4次，接着94℃40sec，55℃30sec，72℃30sec，循环27次，接着72℃延伸10min，最后温度降至12℃恒温30min；D、DGGE电泳将标准蓝藻鉴定DNA marker和PCR产物分别加入不同泳道，以50V-30min，120V-7h的条件进行DGGE电泳；E、分析鉴定对电泳纬果进行染色、扫描分析，鉴定出水体中蓝藻种类。
2. —种适用权利要求1所述的基于PCR-DGGE水体蓝藻快速检测试剂盒，该试剂盒包括A、 PCR相关试剂①蓝藻鉴定特异性引物，其序列如下上游引物5'-CGCCCG CCG CGCCCC GCG CCC GGCCCG CCG CCC CCG CCC C-GTC ACGCCC GAA GTC GTT AC-3';下游引物5' -CTAACC ACC TGA GCT AAT-3';②热聚合酶；③dNTPs包括dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP ;B、 自行制备的蓝藻鉴定标准marker,其制备方法包括两种途径(1) 利用PCR-DGGE反应制备①选定已知的蓝藻种类，利用本发明所述的方法，首先进行一次PCR反应，在紫外灯下，利用一次性20 L白色小枪头，从变性梯度胶上的目的条带的中间位置取少许含有DNA片断的胶，将粘有胶末的枪头小心放入1. 5mL的EP管中，加入50 ii L去离子水，在8000rpm/min的条件下离心lmin，胶末浸入水中，置于4°C中过夜；②取上述的浸泡液1 y L，稀释100倍后，再取稀释液1 y L作为模板DNA加入50 ii L PCR反应体系中进行二次PCR扩增，每个循环的Ta二58t:，其余条件同第一次PCR，将PCR产物测序，接着把测序结果登陆网站NCBI，利用Blast进行搜寻，确定序列所对应的物种；③将测序后的目的条带的二次PCR产物混合，进一步纯化浓縮得到含有已知物种特异条带的标准Marker混合溶液，通过PCR-DGGE电泳，将含有条带的标准Marker溶液与混合前的各种单一条带的PCR产物进行比较，确定标准Marker泳道从上至下各个条带的排列顺序；(2) 利用人工合成的方法制备根据上述已知蓝藻物种PCR-DGGE产物测序结果，通过人工合成蓝藻种类鉴定标准Marker,将含有物种标准Marker混合，并与制备的单一物种条带特异性Marker进行DGGE比较分析，确定标准Marker泳道从上至下各个条带的排列顺序；C、 DGGE电泳相关试剂7L 1XTAE缓冲液，16mL 25%和45%的变性梯度胶配置液，含8%丙稀酰氨胶浓度，3011 L腦APS，15iiL TEMED。
全文摘要
本发明公开了一种基于PCR-DGGE水体蓝藻检测方法及其快速检测试剂盒。检测步骤是A、水样采集浓缩后，通过反复冻融释放出蓝藻DNA，在水浴中静置2min，离心后取1μL上清溶液作为模板DNA加入PCR管；B、按照DGGE装置说明书，制备丙稀酰氨变性梯度胶；C、将模板DNA加入PCR管进行PCR扩增反应；D、将标准DNA marker和PCR产物分别加入不同泳道进行DGGE电泳；E、对电泳结果进行分析鉴定。该方法鉴定速度快，不需对DGGE产物测序，蓝藻鉴别结果准确可靠。水体蓝藻检测试剂盒包括a、PCR相关试剂蓝藻特异性引物和Taq酶；b、自行制备的蓝藻鉴定标准marker。c、DGGE电泳相关试剂。该试剂盒成分简单，检测成本低，能同时检测多个水样。
文档编号C12Q1/68GK101701264SQ20091027287
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月20日 优先权日2009年11月20日
发明者罗文怀, 胡章立 申请人:深圳大学