专利名称：环介导恒温扩增技术快速检测微小原甲藻的方法
技术领域：
本发明属微小原甲藻的DNA分子检测领域，特别是涉及一种环介导恒温扩增技术 快速检测微小原甲藻的方法。
背景技术：
微小原甲藻(prorocentrum minimum)是中国海域多发赤潮藻，近年来引发多起赤 潮。赤潮已成为一种世界性的公害，它对海洋生态平衡、海洋渔业、水产资源、以及人类健康 的产生很大危害。对赤潮进行预测成为学者们关注的问题，而对赤潮藻类进行检测是首要 一环，传统的藻类鉴定是通过形态学的观察来划分的，从色素，色素体，贮藏物质等的差别 来辨别不同种的藻类细胞，这是一件费时费力的事，而且不同的种属差别很细微，非长期从 事该工作的专业人员难以胜任这项工作，并且环境对藻类形态有很大影响，鉴定到种存在 的困难较多。目前，利用分子生物学手段检测微藻的方法日渐成熟，这些方法从分子水平解 决了某些从形态上难以区分的藻类分类和鉴定问题。自从聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction, PCR)技术发明以来，这种技术就被应用到诸多领域。许多学者通过微藻 某些基因片段扩增来对藻类进行鉴定，例如通过对核糖体rDNA序列分析，核糖体间隔区 (ITS)的PCR扩增和测序，从而完成对微藻类的种类鉴定。荧光原位杂交也是近年来微藻鉴 定的检测手段，有些学者利用核糖体大亚基(LSU)和ITS区分子探针对某些赤潮微藻进行 了鉴定，但是这种技术对探针要求高。实时荧光定量PCR检测也是近年来微藻检测一个方 向，这种方法非常灵敏，检测时间需1 2小时，但是所需实验仪器(荧光定量PCR仪)和 试剂价格昂贵。上述方法因为实验条件等因素限制不能应用于现场检测。2000年，日本学者Notomi等开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环介导恒温 扩增反应(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，其特点是针对靶基因的6个 区域设计4种特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65°C 左右)下保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。此反应不需要模板的热变性、长时间温度 循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，而且结果判定简单，既可以利用仪器检测或肉眼观察 核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀判定，也可以采用肉眼观察反应液的颜色变化来迅速 判定。这种技术已经广泛应用到病原菌检测方面，取得理想的检测效果。但迄今为止，尚 未见将该技术应用于微小原甲藻检测鉴别的相关文献报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种环介导恒温扩增技术快速检测微小原甲 藻的方法，该方法具有操作简单快速、对仪器要求不高、特异性强、扩增效率高、结果判定简 单等优点，适合对微小原甲藻快速鉴定和现场检测。本发明的一种环介导恒温扩增技术快速检微小原甲藻的方法，包括
(1)赤潮藻类的基因组DNA提取(2) LAMP 扩增引物
权利要求
一种环介导恒温扩增技术快速检微小原甲藻的方法，包括(1)赤潮藻类的基因组DNA提取(2)LAMP扩增引物两个外引物Pm F35’ CGCGCTTGATCGTCTCTT 3’Pm B35’ CCAGTGGCAAGCCAAGAC 3’；两个内引物Pm FIP5’ ACCCGCAGACGAGCTACCATTGTGTCAACGCCTGTTCG 3’Pm BIP5’ TGGCAGAACTCATTTGCGGACTCTTCCAGAATGCCAAGGACA 3’；(3)LAMP扩增反应体系(4)LAMP扩增产物的检测。
2.根据权利要求1所述的一种环介导恒温扩增技术快速检微小原甲藻的方法，其特征 在于所述步骤(3)中的LAMP扩增反应体系所用试剂为2. 5uL lOXbuffer，两个内引物 Pm-FIP和Pm-BIP的终浓度均为1. 6 μ M，两个外引物Pm_F3和Pm_B3的终浓度均为0. 2 μ M， 另外包括6mM MgS04,0. 6mM dNTP，0. 6M Betaine (Sigma-Aldrich), 8U Bst DNA聚合酶，IuL DNA模板。
3.根据权利要求1所述的一种环介导恒温扩增技术快速检微小原甲藻的方法，其特征 在于所述步骤(3)中的LAMP扩增反应体系的条件为反应温度65°C，反应时间60min，最 后于85°C保持3min终止反应。
4.根据权利要求1所述的一种环介导恒温扩增技术快速检微小原甲藻的方法，其特征 在于所述步骤(4)中的LAMP扩增产物检测，电泳检测可见阳性反应出现梯状条带，阴性反 应没有条带的出现，肉眼观察可见阳性反应管内有大量白色沉淀产生，或加2μ L100XSYBR Green I于反应管中，反应管呈现绿色为阳性，反应管内颜色不变的为阴性。
全文摘要
本发明涉及一种环介导恒温扩增技术快速检测微小原甲藻的方法，包括(1)赤潮藻类的基因组DNA提取；(2)4条LAMP扩增引物Pm-F3CGCGCTTGATCGTCTCTT；Pm-B3CCAGTGGCAAGCCAAGAC；Pm-FIPACCCGCAGACGAGCTACCATTGTGTCAACGCCTGTTCG；Pm-BIPTGGCAGAACTCATTTGCGGACTCTTCCAGAATGCCAAGGACA；(3)LAMP扩增反应体系；(4)LAMP扩增产物的检测。本发明的LAMP检测方法具有操作简单快速、对仪器要求不高、特异性强、扩增效率高、结果判定简单等优点，适合对微小原甲藻进行快速鉴定和检测。
文档编号C12Q1/04GK101942506SQ20101017330
公开日2011年1月12日 申请日期2010年5月12日 优先权日2010年5月12日
发明者张凤英, 徐兆礼, 马凌波 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所