一种基于定位探针介导剪切和扩增的核酸检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于定位探针介导剪切和扩增的 核酸检测方法。
【背景技术】
[0002] 病原体和遗传标志物相关基因的定性和定量检测已成为临床化学中发展最迅速 的领域之一。由于即时检测的需要，核酸检测正逐步走出实验室环境。但目前，核酸检测仍 主要使用PCR技术和其衍生技术如逆转录PCR(RT-PCR)、实时PCR(Real-time PCR)、多重 PCR (Multiplex PCR)、巢式PCR (Nested PCR)等。这些技术严重依赖于循环变温过程来实 现核酸链的变性、退火和延伸三步骤，属于变温核酸扩增技术，需要专门的实验室仪器，因 而不利于即时检测的实现。
[0003] 近年来，等温核酸扩增技术逐渐兴起，并得以迅猛发展，不仅丰富了核酸扩增 技术的内容，还代表着核酸扩增技术发展的新趋势。目前已报到的等温扩增技术有 转录介导扩增技术（Transcription-mediated amplification，TM)、链置换扩增技 术（Strand displacement amplification，SDA)、基于核酸序列扩增技术（Nucleic acid sequence-based amplification， NASBA)、环介导扩增技术（Loop-mediated amplification，LAMP)、解链酶依赖型扩增技术（Helicase dependent amplification， HDA)、滚环扩增技术（Rolling circle amplification，RCA)、单引物等温扩增技术 (Single primer isothermal amplification，SPIA)和基因指数等温扩增反应（Genome exponential amplification reaction，GEAR)等。这些等温核酸扩增技术避免了 PCR 技 术的循环升、降温过程，能在较短的时间内实现目标核酸序列的指数扩增，使核酸检测设备 更加便携，有利于即时检测的实现。然而，这些技术均是从人工合成引物沿目标核酸序列 延伸开始启动，其主要缺点在于引物设计上的困难。为了实现目标核酸序列以及新生成的 反义序列的循环利用，常常需要复杂的引物设计，例如LAMP需要针对目标核酸序列的6个 区域设计至少4条引物，这不仅要依赖于专业的设计软件，还要求设计者具有丰富的经验。 SDA等虽然具有相对简单的反应机理，但由于内切酶对于目标核酸中特定识别序列的依赖， 其通用性受到了很大挑战。为了在目标核酸中引入内切酶的识别序列，也不得不诉诸于复 杂的引物设计，这不仅大大增加了非特异性扩增的严重程度，同时加大了扩增失败的风险。 另一方面，从引物延伸开始启动的扩增反应还缺乏有效的手段来抑制非特异性扩增反应， 这是目前绝大多数等温指数扩增方法尚未解决的难题。相比较而言，从目标核酸序列的延 伸开始启动的等温指数扩增反应不仅可以灵活设计引物/模板的序列结构，而且可以采用 各种化学修饰的引物/模板以降低非特异性扩增。但绝大多数情况下，待测目标核酸序列 的3'段断点位置是不可知的，这就使得目标核酸序列沿特定引物/模板的延伸面临着巨大 的挑战。使用 "Fingerprinting" 技术（Niemz，A. (2009)，Clin. Chem. 53 :2017-2020)虽然 可以从基因组靶核酸序列中直接得到扩增"引物"，即利用内切酶对目标核酸序列实施剪切 以精确"自定义"其3'段断点位置，从而引发指数扩增反应，但是这种方法需要目标核酸序 列中含有内切酶识别序列，且剪切位点只能位于该识别序列内或附近的某一固定位置，无 法按实际需要实现精细调节，针对不同的目标核酸序列来还需选择不同的内切酶才能实现 剪切，因而其通用性较差，对于有些序列片段甚至会由于没有适合的内切酶而无法实现特 异性剪切。为了克服上述不足，有必要探宄一种新的核酸检测方法，应用于微生物检测、月中 瘤标志物鉴定和转基因成分筛查等方面。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种基于定位探针介导剪切和扩增的核酸检测方法，该方法是一种 可对目标核酸序列任意位点进行剪切，生成相应的核酸序列作为引物以触发后续等温指数 扩增反应的简单、通用的核酸检测方法。
[0005] 一种核酸检测方法，包括酶切目标核酸序列、指数扩增反应，酶切目标核酸序列所 采用的试剂包括定位探针和内切酶，所述定位探针包括一段双链以及至少一段与双链相连 接的单链，所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区，所述双链具有邻近识别 区的供内切酶结合的结合区。
[0006] 上述方法中内切酶与所述定位探针的双链结合区进行结合，并通过单链的识别区 与目标核酸序列进行杂交被定位到目标核酸序列的指定区域内，从而完成对目标核酸序列 的精确剪切。
[0007] 上述核酸检测方法是在现有依赖链置换扩增技术的核酸检测方法的基础上做的 进一步改进，以荧光分析方法进行核酸检测为例，主要包括以下几个过程：目标核酸序列的 剪切、链置换扩增和荧光检测。
[0008] 该方法的整个反应体系中，主要包括以下组分：待检测的目标核酸序列，具有链置 换活性的核苷酸聚合酶（简称聚合酶），扩增模板，定位探针，内切酶，反应缓冲液，dNTPs、 镁离子和荧光探针。
[0009] 该方法的具体反应原理，如下：
[0010] a)定位探针会与目标核酸序列进行特异性杂交，而内切酶与定位探针的双链结合 区结合，并对目标核酸序列进行剪切；
[0011] b)剪切后，目标核酸序列与定位探针分离，转而与扩增模板上3'端的目标核酸结 合序列特异性结合，并在聚合酶的作用下，以扩增模板为模板延伸，延伸的核酸序列与扩增 模板形成双链的内切酶识别序列以及扩增模板5'端的扩增序列的反义序列；
[0012] c)内切酶与b)中形成的双链的内切酶识别序列结合，并对目标核酸序列的延伸 序列进行剪切，形成切口，然后聚合酶从该切口位置开始催化延伸，并置换掉原有核酸序 列，该剪切-延伸过程不断重复，以生成更多的扩增序列的反义序列；
[0013] d)该反义序列与游离的扩增模板特异性结合，并在聚合酶的作用下以扩增模板为 模板延伸，延伸的核酸序列与扩增模板形成双链的内切酶识别序列以及扩增模板5'端的扩 增序列的反义序列；
[0014] e)不断重复步骤c)和d)以实现指数扩增，由于可产生大量的双链扩增模板，因而 将使双链特异性荧光染料SYBR Green I的荧光信号逐渐增强，从而实现对目标核酸序列的 检测。
[0015] 核酸定位探针的结合区只是核酸定位探针双链中的一部分区域，结合区的两端还 可以有非内切酶识别序列；同样，上述识别区也只是核酸定位探针单链的一部分区域，识别 区的两端还可以有非目标核酸识别序列；但是，结合区与识别区必须相互靠近，以确保内切 酶能够剪切到目标核酸序列，结合区与识别区之间可允许间隔的碱基对数（单链区按核苷 酸数计）根据内切酶的类型来确定。
[0016] 本发明所述的"靠近"是指结合区与识别区不宜间隔过大，以避免内切酶无法剪切 目标核酸序列，结合区与识别区相互间隔的核苷酸数应根据具体内切酶识别序列与剪切位 点间的核苷酸数量来确定。
[0017] 作为优选，所述核酸定位探针包含两段含识别区的单链，两段单链连接于双链的 同一端，或者所述核酸定位探针包括单链环，所述单链环和单链分别连接于双链的两端。
[0018] 更优选的是，所述核酸定位探针不仅包含两段含识别区的单链，两段单链连接于 双链的同一端，而且还包括单链环，所述单链环和单链分别连接于双链的两端。
[0019] 进一步地，所述单链环的核苷酸数量大于等于0,小于等于50。
[0020] 理论上，本发明所述的核酸定位探针只需具有结合区和识别区即可实现核酸剪 切，针对上述结构区域，本发明提供了多种可行的核酸定位探针结构，具体如下：
[0021] 所述核酸定位探针由单条核苷酸链分子内互补杂交形成或由两条核苷酸链部分 互补杂交形成。
[0022] 若以两条核苷酸链形式存在，该核酸定位探针的两条核苷酸链中存在一部分互补 序列，互补区域中需包含结合区以供内切酶结合，未互补