的费用、琼脂糖、缓冲液（TAE)的费用等。本发明只需要快速提取DNA，经荧光PCR(包括 TaqMan体系和SYBR Green体系）、根据电脑屏幕显示的曲线扩增情况即可直观读取分子鉴 定结果，即浒苔的种类。本实验全部流程在一天之内即可实现从提取总DNA到种类鉴定的 结果，并且无需后期的测序费用。通过前期实验发现，将较浓的样本DNA稀释到五千倍仍然 可以检测到信号。也就是说，对样本的基因组要求也较之常规PCR大大降低。
[0034] 该发明的引物和探针适用于常见绿潮浒苔类藻类的分子鉴定。该技术已经在实验 室内部的几种绿潮藻体的检测中初步验证成功，经过后期的大规模反复验证，可设计为绿 潮藻快速提取及鉴定试剂盒。总之，本发明能够做到对样本低要求，高效率，精确检测，省时 省力省费用，效果显著。
【附图说明】
[0035] 图1为检测体系A扁浒苔的荧光检测结果
[0036] 图2为检测体系A曲浒苔的荧光检测结果
[0037] 图3为检测体系A浒苔和缘管浒苔的荧光检测结果
[0038] 图4为检测体系A浒苔或缘管浒苔的荧光检测结果
[0039] 图5为检测体系B缘管浒苔的荧光检测结果
【具体实施方式】
[0040] 实施例1
[0041] 结合Gene bank里面ITS、5S、Hsp70基因对于四种消1苔的同源序列进行比对，利用 Primer Express 3.0设计特异性引物和探针序列。选取其中最佳引物序列，合成最佳引物 所对应的探针。
[0042] 检测体系A即TaqMan体系中，扁浒苔特异性引物（C)的特异性引物和探针序列 为，上游 C-its-arms-F :GGCGTCCGCCGTTTT，下游 C-its-arms-R :GCAGAAGGTTTCATGGGTTAGG〇
[0043] TaqMan 探针 C-its-arms-p: CCGGTGAGGTGCGCTCCCC，5' 端连接 TAMRA 荧光基团，3' 端连接淬灭基团BHQ-2。
[0044] 曲浒苔（F)的特异性引物和探针序列为，上游F-5s-F:TCGTCCGGGTTCTCGACG，下游 F-5s-R:CTGGCGCGAAACATGGCo
[0045] TaqMan 探针 F-5s-P: CCTCATTCCTTCCCCATGTCGCCAA，5' 端连接 CY5 荧光基团，3' 端 连接淬灭基团BHQ-2。
[0046] 浒苔和缘管浒苔⑵的特异性引物和探针序列为，上游 P-hsp-F:CAACAACCTGCTGGGCAAGT，下游 P-hsp-R:TCGAACACGACCTCGATTTG。
[0047] TaqMan 探针 P-hsp_P:CGACCTCACCGGGATTCCTCCC，5'端连接 ROX 荧光基团，3' 端连 接淬灭基团BHQ-2。
[0048] 检测体系B即SYBR Green体系中，缘管浒苔（L)的特异性引物序列为，上游L_5s -arms-F: TCCCCTGTGCTGTATCGCTAT，下游 L-5s-arms-R: CGGCCGCTGTAGACAGATG
[0049] 上述引物和探针分别配制成浓度为10ng/ml的溶液。
[0050] 实施例2
[0051 ] 使用CTAB法提取浒苔总基因组DNA ;
[0052] (1)将100mg-200mg植物组织样品移至预冷无菌研钵中，研磨成粉末状，立即装入 提前预冷的离心管中，并放入液氮瓶中。
[0053] (2)加入Iml 65°C预热的CTAB提取液，震荡混勾，65°C烘箱温浴30min。温浴期间 摇匀2?3次，保证裂解充分。
[0054] (3)加入800ul氯仿-异戊醇（24:1)，上下颠倒100次（上下为1次），12000rpm 离心20min。
[0055] (4)吸取上清液至新的I. 5ml无菌离心管中，加入上清液体积的2/3体积的异丙 醇，充分混匀，-20 °C放置lh〇
[0056] (5) 12000rpm离心lOmin，弃上清，加入75%的乙醇500ul清洗沉淀。瞬时离心，吸 弃多余液体，离心管开盖，37°C烘箱晾干IOmin至DNA沉淀呈半透明状。
[0057] (6)加入 60ul 含 10mg/ml Rnase 的无菌 ddH20,溶解 DNA 沉淀。
[0058] CTAB提取液的组分包括：CTAB (十六烷基三甲基溴化铵）20g，0. 5mol/L EDTA(pH = 8.0) 40ml，5mol/L NaCl 280ml，Imol/L Tris-HCl (pH = 8.0) 100ml，β-疏基乙醇 20ml， 用蒸馏水定容至1L。
[0059] 实施例3
[0060] TaqMan试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）用于检测体系A，SYBR Green试剂盒（ΚΑΡΑ Biosystems)用于检测体系B。
[0061] 在检测体系A即TaqMan体系中加入实施例1合成的扁浒苔（C)、曲浒苔（F)、浒苔 和缘管浒苔（P)的特异性引物及TaqMan探针，以及实施例2的样品总DNA (稀释10倍），用 TaqMan反应体系进行PCR扩增。
[0062] 检测体系B中加入缘管浒苔（L)的特异性引物序列，以及实施例2的样品总 DNA (稀释10倍），用SYBR Green反应体系进行PCR扩增。
[0063] 检测体系A和B配比组成如表1 :
[0064] 表 1
[0065]
【主权项】
1. 一种快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法，其特征在于，步骤包括： 用待测绿潮浒苔类藻类的总DNA为模板，进行以下荧光PCR检测： 检测体系A中，加入相应的特异性引物和TaqMan探针，用TaqMan体系进行PCR扩增和 荧光检测； 扁浒苔的特异性引物上游序列C-its-arms-F包括SEQ ID No. 1的核苷 酸：GGCGTCCGCCGTTTT，下游序列 C-its-arms-R 包括 SEQ ID No. 2 的核苷酸： GCAGAAGGTTTCATGGGTTAGG，TanMan 探针 C-its-arms-p 包括 SEQ ID No. 3 的核苷酸： CCGGTGAGGTGCGCTCCCC ； 曲浒苔的特异性引物上游序列F-5s-F包括SEQ ID No. 4的核苷酸： TCGTCCGGGTTCTCGACG，下游序列 F-5s-R 包括 SEQ ID No. 5 的核苷酸：CTGGCGCGAAACATGGC， TanMan 探针 F-5s-P 包括 SEQ ID No. 6 的核苷酸：CCTCATTCCTTCCCCATGTCGCCAA ; 缘管浒苔和浒苔的特异性引物上游序列P-hsp-F包括SEQ ID No. 7的核 苷酸：CAACAACCTGCTGGGCAAGT，下游序列 P-hsp-R 包括 SEQ ID No. 8 的核苷 酸：TCGAACACGACCTCGATTTG，TanMan 探针 P-hsp-P 包括 SEQ ID No. 9 的核苷酸： CGACCTCACCGGGATTCCTCCC ； 所述的三种TaqMan探针的5'端连接上分别连接不同的报告染料，3'端连接淬灭基团； 检测体系B中，加入缘管浒苔的特异性引物，用SYBR Green体系进行扩增，并进行荧光 检测； 缘管浒苔的特异性引物上游序列L-5s-arms-F包括SEQ ID No. 10的核苷酸： TCCCCTGTGCTGTATCGCTAT，下游序列 L-5s-arms-R 包括 SEQ ID No. 11 的核苷酸： CGGCCGCTGTAGACAGATG ； 在检测体系A中鉴定为缘管浒苔或浒苔的，同时在检测体系B中出现特异性扩增曲线 的，为缘管浒苔；在检测体系A中鉴定为缘管浒苔或浒苔的，并在检测体系B中未出现特异 性扩增曲线，并为浒苔。
2. 权利要求1所述快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法，其特征在于，检测体系A中，扁浒 苔的特异性引物上游和下游序列分别如SEQ ID No. 1和2所示，TanMan探针C-its-arms-p 的序列如SEQ ID No. 3所示；曲浒苔的特异性引物上游和下游序列分别如SEQ ID No. 4和 5所示，TanMan探针F-5s-P的序列如SEQ ID No. 6所示； 缘管浒苔和浒苔的特异性引物上游和下游引物序列分别如SEQ ID No. 7和8所示， TanMan探针P-hsp-P的序列如SEQ ID No. 9所示。
3. 权利要求1所述快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法，其特征在于，检测体系B中，缘管 浒苔的特异性引物上游和下游序列分别如SEQ ID No. 10和11所示。
4. 权利要求1所述快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法，其特征在于，检测体系A的扩增 条件为：49°C?50. 5°C预变性 IOOs ?135s ;94· 5 ?96°C预变性 4. 5 ?6min ;94· 5 ?96°C 变性9?12s、54. 5?56. 5°C退火9?10s、70?74°C延伸28?32s、5?8个循环；并在 94. 5?96°C变性9?12s、58?61°C下退火并采集信号28?34s，29?30个循环。
5. 权利要求1所述快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法，其特征在于，检测体系B的扩增条 件为：94· 5?96°C预变性4. 5?6min ;94· 5?96°C变性19?22s、58?61°C下退火9? 10s、70?75°C下延伸并采集信号38?45s，32?40个循环。
6. 权利要求1所述鉴别绿潮浒苔类藻类的方法，其特征在于，检测体系A的扩增条件 为：95°C预变性5min ;95°C变性10s、58°C下退火10s、72°C下延伸38?45s并采集信号，30 个循环。
7. 权利要求1所述快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法，其特征在于，检测体系B的扩增条 件为：95°C预变性5min ;95°C变性10s、58°C下退火10s、72°C下延伸38?45s并采集信号， 35个循环。
8. 权利要求1所述快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法，其特征在于，检测体系A中， TaqMan探针的报告染料选自VIC、ROX、FAM、CY5、CY3、HEX或TAMRA，淬灭基团为BHQ-2或 MGB0
【专利摘要】本发明涉及生物检测领域，公开了对绿潮爆发主要浒苔类藻类：浒苔、扁浒苔、曲浒苔、缘管浒苔的进行鉴定的方法。用待测绿潮浒苔类藻类的总DNA为模板，进行以下荧光PCR检测：检测体系A中加入相应的特异性引物及TaqMan探针进行qPCR扩增和荧光检测；根据相应荧光信号和特异性扩增曲线，确定样品是否为扁浒苔或曲浒苔，或者是缘管浒苔和浒苔中的一种；检测体系B中加入缘管浒苔的特异性引物，用SYBR？Green体系进行扩增并荧光检测；在检测体系A中鉴定为缘管浒苔或浒苔，并在检测体系B中出现特异性扩增曲线的为缘管浒苔，未出现特异性扩增曲线的为浒苔。本方法对样本低要求，高效率，精确检测，省时省力省费用，效果显著。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104561333
【申请号】CN201510028240
【发明人】徐文婷, 何培民, 黄希文, 张建恒, 霍元子, 兰兆辉, 黄艳, 孙溢华, 杨亚云, 韩红宾
【申请人】上海海洋大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月20日