一种检测食品中狗源性成分的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品检测技术领域，具体地说涉及检测食品中狗源性成分的试剂盒及 其应用。
【背景技术】
[0002] 动物源性食品在人们日常膳食中的比例逐步增大，各种冷鲜肉、精深加工的半成 品肉、熟肉制品等消费比例逐年上升。但不同物种的肉品质和价格存在很大差异，给掺杂掺 假创造了极大的利润空间为了谋取经济利益，有些不法企业和商贩在肉制品中使用低成本 肉代替高价位肉的现象时有发生。这不仅严重侵害了消费者的健康和权益，还会涉及宗教 信仰，导致民族问题，同时直接影响到国家的形象，社会的和谐发展以及政府的公信力。
[0003] 狗肉作为中华饮食中一种传统肉食来源在近年来收到了很大的关注，一些宠物狗 被宰杀混入肉制品中，引起了社会的广泛关注。因此，研宄出一种准确、快速、可靠地鉴别一 种快速准确的检测狗源性成分的方法就非常有必要。
[0004] 随着分子生物学方法在食品检验中的应用不断深入，食品中动物源性成分的鉴别 技术也在不断发展，鉴别精度和检测灵敏度的不断提高，目前已初步形成了以基因检测为 基础的方法体系。以聚合酶链式反应（PCR)为基础的技术已成为食品中动物源性成分鉴定 的核心方法。物种特异性PCR根据不同物种基因序列的差异位点设计特异性引物，利用PCR 反应实现动物源性成分特征基因片段的指数级扩增，继而通过电泳检测鉴别可能的物种成 分。多重PCR能够实现混合物中多个物种同时检测。近年来，实时荧光PCR技术是动物源 性成分检测中研宄最多的方法，与普通PCR相比，具有特异性强、灵敏度高、重现性好、有效 降低污染等优点。
[0005] 哺乳动物线粒体DNA(mtDNA)在遗传上相对独立，具有基因组小、没有重复序列、 生物个体内无组织特异性、每个细胞中含有大量线粒体基因组等特点。因此，用mtDNA分子 标记鉴别动物源性成分与核DNA分子标记相比，具有灵敏度高、精确度好、DNA降解小等优 势。基于动物线粒体DNA的荧光PCR检测技术在动物源性成分鉴别中具有广阔的应用前景。
[0006] 目前，根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物，建立PCR与实时荧光 PCR方法已见大量报道，然而，针对狗源性成分检测的荧光PCR方法尚未见报导。因此，建立 动物源性产品中狗源性成分实时荧光PCR检测方法，对提高突发事件应急处理能力，提升 食品安全风险监测水平和监管能力具有重要意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种检测食品中狗源性成分的试剂盒及其应用。
[0008] 本发明首先提供用于检测食品中狗源性成分的引物对以及荧光探针，其核苷酸序 列分别如SEQ ID NO. 1-3所示。
[0009] 本发明提供了上述引物对和荧光探针在检测食品中狗源性成分中的应用。
[0010] 本发明提供了上述引物对和荧光探针在制备检测食品中狗源性成分试剂盒中的 应用。
[0011] 含有本发明引物对和荧光探针的试剂盒也属于本发明的保护范围。本发明的试剂 盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或 者多个可以装有本发明的引物以及荧光探针，根据需要该引物和荧光探针可以是冻干形式 或溶于缓冲液中的状态。另外，本发明的试剂盒中还可以包括用于荧光定量PCR反应的一 种或多种酶/试剂，以及实施本发明所需要的其它成分及用具，例如DNA裂解液、荧光定量 反应液、阴性模板、阳性模板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为狗基因组DNA。
[0012] 进一步地，本发明的试剂盒其20 UL工作体系为：
[0013] 试剂 体积JiL浓度 GoTaqR qPC'R Master Mix 10.0 2 χ 上游引物 0.5 10 μΜ 下游引物 05 10 μΜ 探针 1.0 10 μΜ DNA 模板 1.0 0.1 pg'μ? ~ 0.5 叫/uL. 去离子水 7.0
[0014] 本发明试剂盒的工作程序为：预变性95°C IOmin ;再经95°C变性15s，60°C退火 lmin，40个循环。
[0015] 本发明每次检测标本时须设立阴性对照和阳性对照，在检测中两种对照为有效扩 增时，样本结果判断标准如下：
[0016] Ct值〈35. 0时样品结果为阳性；
[0017] Ct值彡35. 0的样品结果为阴性。
[0018] 本发明提供了一种检测食品中狗源性成分的方法，该方法以蛋白酶K消化法提取 的食品中DNA，以其为模板，利用本发明提供的引物对和荧光探针进行荧光定量PCR扩增， 根据Ct值判定结果。
[0019] 含有本发明引物对和探针的诊断试剂也属于本发明的保护范围。
[0020] 本发明试剂盒特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为食品中狗源 性成分的检测提供了新的方法。本发明所述的荧光RCR技术可以准确快速的实现对食品中 狗源性成分的鉴别检测，可在Ih?2h内完成，具有快速、特异、敏感、高通量等优点，最低检 测限约为l〇〇fg，具有良好的检测食品中源性成分的能力，能有效抵御肉制品掺假，加大对 消费者利益的保护力度。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明检测食品中狗源性成分的荧光定量PCR方法的特异性验证结果，应 用本发明的方法仅对狗DNA有阳性扩增，其他24个物种的DNA检测均为阴性。
【具体实施方式】
[0022] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0023] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0024] 实施例1引物的设计
[0025] 经大量比对GenBank中狗的ND 2基因，选取ND 2基因高度保守且具有物种特异 性基因序列为模板，设计狗ND 2特异性上下游引物和Taqman探针，上下游引物长度分别为 19bp和25bp的核苷酸，探针长度为28bp的核苷酸，并在5'端标记上FAM荧光基团，3'端 标记上TAMRA淬灭基团，序列如下：
[0026] 上游引物：5'-CTCCGGCCAATGGGTAATC-3' (SEQ ID NO. 1)
[0027] 下游引物：5'-GAAGTGGAATGGAGATAGGCCTAGT-3' (SEQ ID NO. 2)
[0028] 荧光探针：5'-FAM-TCAAACCCCATCGCATCCATCATGATAA-TAMRA-3' (SEQ ID NO. 3)
[0029] 实施例2荧光定量PCR检测方法的建立
[0030] 1、提取样品DNA
[0031] (1)取狗肉样本0. 2g，尽量剪碎。置于I. 5ml离心管中加入Iml的细胞裂解缓冲 液，20 μ 1蛋白酶Κ(500 μ g/ml)，混匀。在65°C恒温水浴锅中水浴30min，间歇振荡离心管 数次。于台式离心机以12, OOOrpm离心5min，取上清液入另一离心管中。
[0032] (2)加入等体积的苯酷：氯仿混合液（I: 1)，振荡混勾，12, OOOrpm离心lOmin。
[0033] (3)取上清液至另一管，加入等体积的氯仿，振荡混勾，12, OOOrpm离心lOmin。
[0034] (4)取上清液至另一管，加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积的无水乙醇， 混勾后室温沉淀l〇min，12, OOOrpm离心10min。
[0035] (5)弃上清，用Iml 75%乙醇洗绦沉淀，12, OOOrpm离心5min。
[0036] (6)重复步骤5。
[0037] (7)弃上清，将沉淀至室温干燥5min。
[0038] (8)加50 μ I TE或dd H2O溶解沉淀，然后置于4°C或-20 °C保存备用。
[0039] 2、采用实施例1的引物和探针，上述提取得到的狗DNA为模板，以狗基因组DNA为 阳性对照，以无核酸双蒸水为阴性对照，建立荧光定量PCR检测体系。
[0040] 其20 μ L总工作体系为：
[0041] 试剂 体积μ?浓度 GoTaqu qPCR Master Mix 10.0 2 x 上游引物 0.5 10 μΜ 下游引物 0.5 10 μΜ 探针 1.0 10 μΜ DNA 模板 1,0 0.1 pg /pL ~ 0.5 pg /叫 去离子水 7.0
[0042] 其工作程序为：95°C预变性10min，l个循环；95°C变性15sec，60°C退火lmin，40 个循环。
[0043] 扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定各样本的Ct值。
[0044] 每次检测标本时须设立阴性对照和阳性对照，在检测中两种对照为有效扩增时， 样本结果判断标准如下：
[0045] Ct值〈35. 0时样品结果为阳性；
[0046] Ct值彡35. 0的样品结果为阴性。
[0047] 实施例3特异性试验
[0048] 为验证本试剂盒的特异性，以家犬基因组DNA为阳性对照，以猪，牛，绵羊，山羊， 鸡，鸭，鹤子，火鸡，鹤鹤，能鸟，灰雁，猫，小鼠，狍子，马，驴，狐狸，骆蛇，三文鱼J卢鱼，鲫鱼， 梅花鹿，虹鳟鱼，草鱼。共24个物种为阴性对照，以dd H2O为空白对照，采用实施例2建立 荧光定量PCR检测体系对上述25个物种进行检测。扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同 一阈值分析数据，确定各样本的Ct值。实验结果见图1，表1，狗的Ct值为11. 19,显示为阳 性结果，其余24个物种的CT值均大于35,显示为阴性结果。说明该实验证明本试剂盒具有 良好的物种特异性。
[0049] 表1本发明方法对25种动物DNA的检测结果
[0050]
【主权项】
1. 检测食品中狗源性成分的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQID NO. 1-2 所示。
2. 与权利要求1所述的引物对配合使用的荧光探针，其特征在于，荧光探针的核苷酸 序列如SEQIDNO. 3所示。
3. 权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的荧光探针在检测食品中狗源性成分中 的应用。
4. 权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的荧光探针在制备检测食品中狗源性成 分试剂盒中的应用。
5. -种检测食品中狗源性成分试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对和 权利要求2所述的荧光探针。
6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括：DNA裂解液、荧光定量反应液、阴 性模板、阳性模板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为狗基因组DNA。
7. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，其20yLPCR反应体系为：
8. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序为：95°C预变性lOmin;95°C 变性15s，60°C退火lmin，40个循环。
9. 一种检测食品中狗源性成分的方法，其特征在于，该方法以蛋白酶K消化法提取的 食品中DNA，以其为模板，利用权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的荧光探针进行 荧光定量PCR扩增，根据Ct值判定结果。
10. 含有权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的荧光探针的诊断试剂。
【专利摘要】本发明提供了一种检测食品中狗源性成分的试剂盒及其应用，属于食品检测技术领域。本发明的试剂盒采用SEQ？ID？NO.1-2所示的引物和SEQ？ID？NO.3所示的荧光探针对待测食品进行荧光定量PCR检测，根据Ct值判断食品中是否含有狗源性成分。本发明试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，最低检测限为100fg，具有良好的检测食品中狗源性成分的能力，能有效抵御肉制品掺假，加大对消费者利益的保护力度。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104561328
【申请号】CN201510024486
【发明人】杨昕霆, 薛晨玉, 赵琳娜, 王丹, 黄华, 暴瑞玲, 胡智恺, 宋丽萍, 毛婷, 杜建平
【申请人】北京市食品安全监控和风险评估中心
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月16日