专利名称：低温发酵的乳酸乳球菌及用其制备酸奶的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及低温条件下发酵性能良好的乳酸乳球菌及用其制备酸奶的方法。
背景技术：
酸奶源于保加利亚，最早是一种营养丰富、易于消化的民间饮料。20世纪初，诺贝尔奖获得者俄国科学家梅契尼柯夫在研究人类长寿问题时，到保加利亚去作调查，发现每千名死者中有4名是百岁以上去世的，这些长寿者生前都爱喝酸奶，他断定喝酸奶是使人长寿的一个重要原因。经他对酸奶的研究结果证明酸奶中含有一种生长活性因子，能增强机体免疫机能，有利于身体健康，抗病、抗衰老。世界上有很多长寿的地方，居民都有长期饮酸奶的习惯。梅契尼柯夫对酸奶的研究成果使西班牙商人伊萨克·卡拉索受到启发，于是开始了酸奶生产。最初他们把酸奶当作药品在药房销售，第二次世界大战爆发后，伊萨克 卡拉索在美国建立了一家酸奶厂，并大做广告，不久酸奶风靡美国，并在世界各地流行开来。后续的研究结果证明，酸奶不仅可增强人体免疫功能，还能降低血清胆固醇的水平。有实验证明，甚至在不用任何药物的情况下，每餐饮用约240克酸奶，一周后血清胆固醇水平可以降低。另外常饮用酸奶能促进肠道运动，软化酵解结肠内容物，增加粪便排泄量，预防便秘发生，有益于预防结肠癌。因此，酸奶在国外被誉为“长寿食品”。目前各种酸奶制品品种繁多，有凝固型的、搅拌型的，不管是何种酸奶，其共同的特点都是含有乳酸菌。酸乳中的乳酸菌来源于生产时所加的发酵剂，目前生产酸奶的发酵剂中含有的乳酸菌大多为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，它样的最适宜的生长温度为40°C 左右ο生产酸奶最重要的要素就是发酵酸奶的发酵剂菌种，只有好的发酵剂菌种才能生产出优质的酸奶。酸奶发酵剂的菌种不仅影响酸奶的品质，也决定了酸奶发酵工艺参数，例如发酵温度、发酵周期等。目前，酸乳生产的工艺中发酵温度通常为42° C左右，此温度发酵的酸奶在贮藏过程中会出现后酸化、乳清析出及风味改变等质量问题。另外，由于酸奶发酵温度较高，会增加工厂的热能成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种低温发酵的乳酸乳球菌。本发明的另一个目的是提供一种用乳酸乳球菌乳酸亚种1-3-5制备酸奶的方法。青藏高原牧区具有非常特殊的地理生态环境，海拔高、昼夜温差大，以牦牛乳为原料的自然酸奶长期以来是生活在该区域藏民族的主食之一。牧民采用千百年来沿袭古老而传统的方法制作酸奶，将新鲜的牦牛乳加热煮沸，冷却后接种上次制作预留的酸奶(接种量一般是3% 5%)，为防止酸奶过酸或异味，常维持较低的发酵温度，在室内放置(10 25°C)至凝乳，属于典型的低温发酵。在长期的自然进化过程中，传代性好、抗逆性强、凝乳状态好、风味独特、低温发酵的的优良乳酸菌得到富集。本发明乳酸乳球菌的筛选方法是采集甘南藏族自治州牧民家自制发酵牦牛乳样品，取1 mL于9 mL无菌生理盐水中稀释到 10_3-10_7，吸取0. 2 mL涂布于改良M17平板培养基上，25°C好氧培养对_4811。选择革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌落进一步分离纯化，直到得到纯菌株为止。将初筛菌株进行发酵性能实验，经过复筛得到菌株。改良M17培养基组成鱼蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母浸粉2.5g，牛肉膏5g，乳糖 3g，抗坏血酸钠 0. 5g，MgS04 0. 25g，K2HPO4 3H20 5g，琼脂 17g，蒸馏水 1000ml，调节 pH 6. 9 士 0· 2。本发明中的乳酸乳球菌乳酸亚种1-3-5是从甘肃省甘南藏族自治州传统发酵牦牛乳中筛选得到的，分类命名为乳酸乳球菌乳酸亚种Hac tococcus lac tis subsp. hciiWl-3-5，于2011年4月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)保藏，保藏号 CGMCC NO. 4776。本发明乳酸乳球菌乳酸亚种1-3-5 CGMCC NO. 4776，具有在低温下发酵的能力。用本发明菌株制备酸奶的方法，步骤如下
往4. 60 4. 80kg鲜乳或还原乳中加入0. 20 0. 40kg蔗糖，溶解后过滤除去杂质，再预热至60 65 °C,然后在15-25MPa下均质10 20min，得到的均勻液体再于95°C 下杀菌5min，然后冷却至30°C备用。向0. 04kg改良M17培养基中接入乳酸乳球菌3接种环，培养24h使细胞数在IO8 IO9CfuAiL之间，取乳酸乳球菌0. 03kg接种于备用的杀菌乳中，在25°C下进行培养至凝乳，然后冷却到4°C，在0 5°C冷库中贮存，后熟M h即可。本发明乳酸乳球菌具有发酵温度低、发酵周期短和凝乳性能良好等优点。用该菌株制作的酸奶具有粘度高、贮藏时后酸化弱的特点。本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种{Lactococcus lactis subsp. Iactis) 1-3-5 ψ 2011年4月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC NO. 4776。本发明乳酸乳球菌乳酸亚种具有以下生物学特性 1.培养特征
乳酸乳球菌乳酸亚种1-3-5菌体为球状，过氧化氢试验阴性，革兰氏染色结果为阳性， 菌株1-3-5革兰氏染色见图1。菌株1-3-5在MRS液体培养基37°C恒温培养18 h时，培养液混浊均勻，菌体下沉。2.遗传学特征(菌株16SrRNA序列)
本发明测了菌株1-3-5的16S rRNA序列，如下，序列全长为14Mbp。GGAAGCGCCCTCCTTGCGGTTAGGCAACCTACTTCGGGTACTCCCAACTCCCGTGGTGTGACGGGCGGT GTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGA GTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGTTTTAAGAGATTAGCTAAACATCACTGTCTCGCGACTCGTTGTACCA TCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTAT CACCGGCAGTCTCGTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAACAATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAAC CCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCCGTGTCCCGAAGGAACTTCCTATCTCTA GGAATAGCACGAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGT GCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTATTGCGTTAGCTGCGATACAGAGAACTTATAGCTCCCTACATCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT TGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGTGTCAGTTACAGGCCAGAGAGCCGCTTTCGCCACCGGTGTTCCTCCATATAT CTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCTCTCCTGCACTCAAGTCTACCAGTTTCCAATGCATACAA TGGTTGAGCCACTGCCTTTTACACCAGACTTAATAAACCACCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACG CTCGGGACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGGTAGTTACCGTCACTTGATGA GCTTTCCACTCTCACCAACGTTCTTCTCTACCAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTT GCTCGGTCAGACTTTCGTCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCC CAATGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGTATCATCGCCTTGGTGAGCCTTTACCTCACCAACTAGCTAATA CAACGCGGGATCATCTTTGAGTGATGCAATTGCATCTTTCAAACTTAAAACTTGTGTTTAAAGTTTTTATGCGGTAT TAGCATTCGTTTCCAAATGTTGTCCCCCGCTCAAAGGCAGATTCCCCACGCGTTACTCACCCGTTCGCTGCTCATCC AGTCGGTACAAGTACCAACCTTCAGCGCTCAACTTGCATGTATTAG 3.发酵性能及生长性能
(1)在25 ° C条件下能在小于M小时中使乳酸化至pH4. 60以下，滴定酸度达到 70° T以上。( 在4 ° C条件下储存14天和/或21天后在标准试验(测定后酸化特性的试验)中测量的PH在4. 00-4. 10的范围内，储存14天后测量的pH降低小于0. 30pH单位；并且储存14天后测量的滴定酸度值上升小于10° T。(3)在4 ° C条件下储存14天和/或21天后测量的活菌数始终高于108cfu/mL。图2示出了本发明乳酸乳球菌在MRS培养基中生长曲线图。图3示出了是本发明乳酸乳球菌发酵过程中滴定酸度图，图4示出了本发明乳酸乳球菌发酵过程中PH随时间变化图，图5示出了本发明乳酸乳球菌冷藏期间活菌数的变化图。
图1是本发明乳酸乳球菌的革兰氏染色菌体形态图。图2是本发明乳酸乳球菌在MRS培养基中生长曲线图。图3是本发明乳酸乳球菌发酵过程中滴定酸度图。图4是本发明乳酸乳球菌发酵过程中pH随时间变化图。图5是本发明乳酸乳球菌冷藏期间活菌数的变化图。图6是不同菌株发酵的酸奶冷藏期间粘度变化图。图7是不同菌株发酵的酸奶冷藏期间双乙酰含量变化图。
具体实施例方式下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例均采用乳酸乳球菌乳酸亚种1-3-5 CGMCC NO. 4776作为发酵菌种。实施例1
杀菌乳制备往4. 6kg鲜乳或还原乳中加入0. 3kg蔗糖，溶解后过滤除去杂质，再预热至60°C，然后在15MPa下均质lOmin，得到的均勻液体再于95°C下杀菌5min，然后冷却至 30°C备用。
酸奶制备向0. 04kg杀菌乳中接入本发明的乳酸乳球菌3环，培养24h使细胞数在IO8 IO9CfuAiL之间，取0. 03kg接种于备用的杀菌乳中，在25°C下进行培养至凝乳，然后冷却到4°C，在0 5°C冷库中贮存，后熟M h即可。对照例1参比菌株嗜热链球菌TA40，为Danisco商业菌株。向0.04kg实施例1制备的杀菌乳中接入参比菌株嗜热链球菌TA40 3环，培养Mh 使细胞数在IO8 IO9CfuAiL之间，取0. 03kg接种于备用的杀菌乳中，在25°C下进行培养至凝乳，然后冷却到4°C，在0 5°C冷库中贮存，后熟M h即可。酸奶粘度比较 1、粘度测定
发酵的酸奶在4 ° C环境冷藏24h后作为冷藏第1天，随后分别在冷藏1，2，5，7，14天后，取适量酸奶放入烧杯中，用SNB-I型数字式粘度计3号转子在12 rpm条件下对样品进行测定，记录表观粘度(pa_ s)，重复这种测量三次并得到平均值。2、结果与结论
在冷藏过程中，使用对照例1嗜热链球菌TA40 (参比菌株)发酵的酸奶与使用本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种1-3-5 CGMCC NO. 4776发酵的酸奶相比，参比菌株粘度较低(参见图6)。实施例2
杀菌乳制备往4. 60kg鲜乳或还原乳中加入0. 40kg蔗糖，溶解后过滤除去杂质，再预热至65 °C，然后在25MPa下均质20min，得到的均勻液体再于95°C下杀菌5min，然后冷却至30°C备用。酸奶制备向0. 04kg杀菌乳中分别接入本发明的乳酸乳球菌3环，培养24h使细胞数在IO8 IO9CfuAiL之间，各取0. 03kg接种于备用的杀菌乳中，在25°C下进行培养至凝乳，然后冷却到4°C，在0 5°C冷库中贮存，后熟M h即可。对照例2参比菌株嗜热链球菌TA40，为Danisco商业菌株。酸奶制备向0. 04kg实施例2制备的杀菌乳中接入嗜热链球菌TA40 3环，培养 24h使细胞数在IO8 IO9CfuAiL之间，各取0. 03kg接种于备用的杀菌乳中，在25°C下进行培养至凝乳，然后冷却到4°C，在0 5°C冷库中贮存，后熟M h即可。酸奶双乙酰含量比较双乙酰标准曲线的绘制
(1)准确量取15 μ L双乙酰标准品，定容至500 mL。(2)取12支编号的试管分成2 排放置，并加0. 0mL、2. 0 mL、4. 0 mL、6. 0 mL、8. 0 mL、10. 0 mL的标准溶液各2支，分别用蒸馏水补足10 mL，取5.0 mL上述双乙酰标准溶液加入8 %的三氯乙酸溶液，这样的双乙酰标准溶液的浓度分别为 0. 0 μ g/ mL、3. 0 μ g/ mL、6. 0 μ g/ mL、9. 0 μ g/ mL、12. 0 μ g/ mL、15.0 yg/ mL。(3)第一排试管中加入0. 5 mL 1 %的邻苯二胺溶液，第二排试管不加为空白。摇勻后置于黑暗处放置30 min。(4)反应完全后加入4. 0 mol/L盐酸终止反应， 第一排试管中加2.0 mL，第二排试管中加2. 5 mL，混勻后以第二排试管空白作为参比液，在 335 nm波长下用石英比色皿测定吸光度值。(5)以双乙酰浓度作为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。酸奶中双乙酰含量测定(1)发酵的酸奶在4 ° C环境冷藏24h后作为冷藏第1天，随后分别在冷藏1，2，5，7， 14，21天后，测定其双乙酰含量。重复这种测量三次并得到平均值。(2)样品处理酸奶样30 mL，加30 mL 16 %的三氯乙酸，混勻，静置10 min， 4 ° C下4500 rpm离心10 min，将上清再用滤纸过滤一遍，保证澄清。同时以无菌全脂乳作对照。(3)取待测样品，用8 %的三氯乙酸溶液稀释至适当的倍数，重复上述过程的3、 4、5步，然后查双乙酰标准曲线可获得待测样品中双乙酰浓度(yg/ mL)。结果与结论
使用对照例2嗜热链球菌发酵的酸奶与使用本发明的乳酸乳球菌发酵的酸奶相比差异不大(参见图7)。实施例3
杀菌乳制备往4. 80kg鲜乳或还原乳中加入0. 20kg蔗糖，溶解后过滤除去杂质，再预热至62 °C，然后在20MPa下均质15min，得到的均勻液体再于95°C下杀菌5min，然后冷却至30°C备用。酸奶制备向0. 04kg杀菌乳中接入本发明的乳酸乳球菌3环，培养24h使细胞数在IO8 IO9CfuAiL之间，取0. 03kg接种于备用的杀菌乳中，在25°C下进行培养至凝乳，然后冷却到4°C，在0 5°C冷库中贮存，后熟M h即可。对照例3参比菌株嗜热链球菌TA40，为Danisco商业菌株。酸奶制备向0. 04kg实施例3制备的杀菌乳中接入嗜热链球菌TA40 3环，培养 24h使细胞数在IO8 109Cfu/mL之间，取0. 03kg接种于备用的杀菌乳中，在25°C下进行培养至凝乳，然后冷却到4°C，在0 5°C冷库中贮存，后熟M h即可。菌株后酸化性能比较 1、菌株后酸化特性的测定
发酵的酸奶在4 ° C环境冷藏24h后作为冷藏第1天，随后分别在冷藏2，5，7，14，21 天后，用PH电极测量冷却的酸奶的PH，重复这种测量三次并得到平均值。发酵的酸奶在4 ° C环境冷藏24h后作为冷藏第1天，随后分别在冷藏2，5，7， 14，21天后，测定其滴定酸度。根据GB 5413. 34-2010，取IOmL酸奶样，加入20mL蒸馏水， 加2-3滴酚酞，用0. lmol/L的NaOH滴定至微红色，30s不褪色为终点，记录消耗的NaOH的体积，用°T表示，重复这种测量三次并得到平均值。2、结果与结论
使用对照例3嗜热链球菌发酵的酸奶与使用本发明乳酸乳球菌乳酸亚种发酵的酸奶相比，对照例3嗜热链球菌发酵的酸奶酸度增加值高且ρΗ值下降多，其效果不好。(参见表 1，2)。表1不同菌株发酵的酸奶冷藏期间滴定酸度的变化
权利要求
1.一种乳酸乳球菌乳酸亚种1-3-5 CGMCC NO. 4776，具有在低温下发酵的能力。
2.如权利要求1所述的菌株制备酸奶的方法，其特征在于步骤如下往4. 60 4. 80kg鲜乳或还原乳中加入0. 20 0. 40kg蔗糖，溶解后过滤除去杂质，再预热至60 65°C，然后在15-25MPa下均质10 20min，得到的均勻液体再于95°C下杀菌 5min，然后冷却至30°C备用；向0. 04kg杀菌乳中接入乳酸乳球菌3接种环，培养24h使细胞数在IO8 IO9CfVmL之间，取乳酸乳球菌0. 03kg接种于备用的杀菌乳中，在25°C下进行培养至凝乳，然后冷却到4°C，在0 5°C冷库中贮存，后熟M h即可。
全文摘要
本发明公开了一种低温发酵的乳酸乳球菌及用其制备酸奶的方法，乳酸乳球菌是采用改良M17培养基从甘肃省甘南自治州的发酵牦牛乳中分离得到，该菌株在25℃下发酵12h即可凝乳，用该菌株生产的酸奶具有粘度高、贮藏时后酸化弱的特点。
文档编号C12R1/01GK102321550SQ20111022098
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月3日 优先权日2011年8月3日
发明者乔海军, 张卫兵, 张炎, 梁琪, 甘伯中, 米兰 申请人:甘肃农业大学