专利名称：一种棉花抗旱相关基因GbMYB5的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种棉花抗旱相关基因GbMYB5，同时涉及GbMYB5基因在提高烟草抗旱能力中的应用。
背景技术：
MYB类转录因子属于带色氨酸簇的转录因子家族，含有一段保守的DNA结合区(DBD) MYB结构域的一类转录因子，DBD区一般包含1_3个不完全重复序列(R)，每个重复片段含有51-53个氨基酸，包含一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列。这些高度保守的氨基酸残基使得MYB区以成螺旋-转角-螺旋(HTH)的形式与DNA大沟结合，这3个残基间隔18-19个氨基酸，起疏水核心作用，对维持MYB的HTH构型有重要意义。根据重复片段R的个数，可以将MYB类转录因子分为单一 MYB结构域蛋白(R1/R2)、2R蛋白(R2R3)以及3R蛋白(R1R2R3)。Stracke等发现拟南芥中还存在4RMYB基因。近年来对MYB类转录因子的研究表明，MYB类转录因子广泛参与植物发育和代谢的各个方面。组合调控是真核基因表达调控的重要方式，主要通过多种转录因子之间的相互作用来实现对靶基因的精密调控。MYB类转录因子与其它转录因子家族成员通过组合调控的方式来调节植物的形态建成、次生代谢，并对外界环境刺激、激素诱导及病虫害等做出应答反应。在植物应答生物胁迫及非生物胁迫时，MYB基因的表达起重要作用。MYB基因被证实参与植物抗干旱胁迫、高盐胁迫、高温胁迫、低温胁迫、UV辐射等，如厚叶旋蒴苣苔的BcMYBl能对PEG(干旱)、高盐、低温等胁迫产生一定程度的应答，拟南芥的AtMYB2及AtMYB60参与植物抗旱，水稻0smyb4高量表达能提高植物对干旱、高盐、UV辐射的耐受性。拟南芥中，MYB5基因是R2R3MYB基因家族的成员。植物中R2R3MYB蛋白是一个庞大的家族，其功能也非常多样。仅在拟南芥基因组中就至少有135个基因是编码R2R3MYB转录因子的，而且其功能大部分是与调控细胞死亡、苯丙烷类代谢途径、色氨酸合成途径和抗旱等相关的。因此，这类基因具有比较广泛的研究和应用前景。植物受病原菌侵染后，引发细胞程序化死亡，即过敏性反应(Hypersensitiveresponse, HR)，水杨酸(SA)在其中扮演重要角色，拟南芥中分离出的AtMyb30是R2R3MYB基因家族的成员，它能在HR早期瞬时表达的一个MYB转录因子，该基因的过量表达及抑制实验证明，AtMYB30能够参与SA的合成，从而调控细胞死亡。据统计表明，世界范围内适于耕种的土地面积占陆地总面积的10%左右，而大部分陆地面积则处于干旱、盐碱、沼泽等逆境下。随着人口老龄化的加剧以及环境的不断恶化，培育出适合在逆境环境下生长的作物势在必行。一个转录因子可调控多个与同类性状有关的基因，可通过调节关键因子来达到植物抗逆性的综合性改变，因此应用转录因子提高植物的抗逆性已成为近年的研究热点。棉花作为世界上最重要的农作物和经济作物之一，从棉花中分离克隆出MYB转录因子有利于人们进一步认识和解析转录因子对于非生物胁迫等的调控机制，也有利于棉花品质改良和耐受性研究工作的进一步开展。
发明内容
本发明的目的是提供一个来源于棉花的与抗旱相关的MYB型转录因子。本发明利用陆地棉MaxxaBAC文库中所获得的一个BAC克隆进行测序分析过程中，发现了一个新的MYB类转录因子，并设计特异引物从海岛棉品种H7124中克隆出GbMYB5，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，该基因共编码277个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示，属于MYB转录因子。本领域技术人员可以根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明蛋白还包括SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，具有同等活性的由所述蛋白衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。此外，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可 以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
本发明的基因和蛋白质可以从海岛棉中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成的方法得到。将发明基因与表达载体连接，得到能够表达本发明蛋白的重组载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、花粉管通道法等转基因方法，将所表述表达载体导入宿主细胞，得到转GbMYB5基因的转化体。本发明通过将外源GbMYB5基因整合到烟草基因组，转基因植株的抗旱能力增强，其生长未受到干旱胁迫的显著影响。表明GbMYB5可用于提高烟草对干旱胁迫的抗性。本发明的提供了所述棉花基因GbMYB5在烟草品种选育中的应用。提供了所述棉花基因GbMYB5在提高烟草抗旱能力中的应用。
图I :GbMYB5基因在棉花不同部位表达的RT-PCR分析。图2 GbMYB5基因在非生物胁迫下表达分析。图3:烟草的遗传转化A.愈伤组织培养；B.筛选培养；C.生根培养；D.再生植株。图4 :再生烟草的PCR检测I =Marker DS 2000 2-21 :再生烟草PCR结果。图5 :转基因烟草的RT-PCR检测I :Marker DS 2000 2_15 :转基因烟草RT-PCR结果。图6 :卡那霉素筛选转基因烟草。图7 :25 % PEG6000模拟干旱下叶片生长状况。图8 :2 % PEG6000培养基模拟干旱下植株生长状况。图9 :2% PEG6000培养基模拟干旱前，植株的生长状况。图10 2% PEG6000培养基模拟干旱2周后，植株的生长状况。图11 :2% PEG6000培养基模拟干旱3周后，植株的生长状况。图12 :2% PEG6000培养基模拟干旱3周后，植株的生长情况(去除培养基)。图13 :2% PEG6000培养基模拟干旱4周后，植株的生长情况。图14 :2% PEG6000培养基模拟干旱4周后，植株的生长情况(去除培养基)。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特殊说明均为常规方法。I.本发明所用的生物材料海岛棉(Gossypiumbarbadense) 7124、烟草(Nicotiana tabacum) K326 (CharlesS. Johnson, Jeremy A. Pattison, Elizabeth M. Clevinger et al. Clarifying the sourceof black shank resistance in flue-cured Tobacco. Plant Health Progress.Doi 10. 1094/PHP-2008-0618-02-RS)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚型(ZHANGJian, XU Jin-Xiang, KONG Ying-Zhen et al. Generation of chemical-inducibleactivation tagging insertion lines of Arabidopsis thaliana. Acta GeneticaSinica. 2005,32(10) : 1082-1088)、植物表达载体pCAMBIA2301 (Peter Hajdukiewicz，ZoraSvab,Pal Maliga. The small,versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectorsfor plant transformation. Plant Molecular Biology. 1994,25:989-994)以及根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404购自宝生物工程(大连)有限公司。BAC克隆购自 Clemson University Genomics Institute。2. GbMYB5基因的克隆根据获得的BAC克隆中含有MYB结构域的序列设计特异引物BamMYB19 :5; ACTGGATCCACATGGGTCGAGCTCCTTGCTGT3' (SEQ ID NO. 3),KpnMYBl122 5/ TCCAGGTACCTTGTCTCTTGCTACATAGGGTAACC3' (SEQ ID NO. 4)。引物分别添加 BamH I 和 Kpn I 酶切位点。CTAB 法提取海岛棉 RNA,用 TransScript First-Strand cDNA SynthesisSuperMix (北京全式金生物技术有限公司产品)制备cDNA第一链。以cDNA第一链为模板，引物BamMYB19和KpnMYBl 122，PCR扩增GbMYB5基因，PCR扩增程序为94°C预变性3分钟，94 °C变性30秒，59 °C退火50秒，72°C延伸I分20秒，共36个循环，最后72°C延伸10分钟。电泳检测得到I. IKb大小的PCR产物片段，将此PCR产物纯化后克隆到pEASY-T3载体(北京全式金生物技术有限公司)，构建中间载体T-GbMYB5，测序工作由上海英骏生物有限公司完成。测序结果表明，该外源片段全长为1105bp，有一个长为832bp的开放式阅读框，编码277个氨基酸，命名为GbMYB5，在GenBank的登录号为JF820389。经与NCBI上注册登录的基因进行BLAST分析，GbMYB5基因与模式植物拟南芥(登录号AAC83600)和橹豆MYB71(登录号ABH02912)的同源基因相似性在51 %左右，是新基因。3.GbMYB5基因在不同组织中的表达根据海岛棉GbMYB5基因全长序列，利用Primer5软件设计一对特异引物 MYBFrt :5 ' AGGCTTCTAATGGAAACCCTAACC3 ' (SEQ ID NO.5), MYBRrt 5' TCCATTGGTTGAAGAACAGAAGT3' (SEQ ID NO. 6)。分别提取海岛棉 7124 的茎、叶、蕾、絮和未成熟种子的总RNA，以反转录获得的cDNA作为PCR模板进行扩增，预实验确定RT-PCR条件。以海岛棉cDNA为模板，MYBFrt, MYBRrt为引物进行RT-PCR扩增，结果表明，GbMYB5基因在这些器官均有表达，但在营养器官的表达量明显高于生殖器官的表达量，尤以在叶子中的表达最高，其次在茎中也有较高的表达量，而在絮和蕾中仅有轻微的表达(见图1，其中Histone为对照)。
4. GbMYB5基因在不同胁迫处理下的表达分析海岛棉脱绒种子直接播种于营养土，待幼苗长至2 3片真叶时，分别对幼苗进行重金属、干旱、脱落酸和赤霉酸诱导处理。重金属处理用5ml的IOuM的CuSO4溶液直接喷洒棉株；干旱处理用5ml浓度为20%的PEG6000浇灌棉株；脱落酸(ABA)处理用5ml的15mg/L的ABA溶液直接喷洒植株；赤霉酸(GA)处理用5ml的IOppm的赤霉酸溶液直接喷洒棉株。以上所有处理时间一致，分别取处理后24h、48h和未诱导的植物叶片(CK)，迅速置于液氮中，_70°C存放备提取总RNA用。在重金属(CuSO4)处理后，GbMYB5基因表达量与对照相比明显下降，但在处理48h后，表达量比对照略有上升。PEG模拟干旱处理下，GbMYB5基因表达在24h时稍有提高，在48h时急速增加。ABA和GA激素诱导处理在24h内可显著提高GbMYB5基因的表达，但随时间推移，GbMYB5对两者的响应不同，ABA处理48h后，GbMYB5基因表达量还维持在24h时的高水平，而GA处理48h后，GbMYB5基因表达量迅速下降。这表明GbMYB5基因对重金属、干旱、ABA和GA诱导均有响应，可能与植物抗逆有关(见图2，其中Histone为对照)。5.重组载体的构建以及烟草转化用BamH I和Kpn I酶切中间载体T_GbMYB5，得到I. I. Kb大小的目的片段，与经同 样双酶切处理后的PCAMBIA2301质粒连接，获得重组表达载体pCAMBIA2301_GbMYB5，采用冻融法将pCAMBIA2301-GbMYB5转化农杆菌LBA4404，转化子经PCR验证后保存备用。本实验采用叶盘共培养法转化烟草。侵染将消毒好的外植体烟草叶片剪成Icm2大小，置于含有重组质粒的农杆菌LBA4404/pCAMBIA2301-Gb (OD6tltl = O. 3-0. 4)浸染液中浸泡5_6min,然后用灭菌后的滤纸吸干。共培养于MS共培养培养基上暗处理48h。筛选培养48h后将浸染的叶片转移至含有卡那霉素和利福平的筛选培养基上。继代培养每隔IOd左右换一次培养基。生根培养筛选出生根苗，将筛选出的生根幼苗转移到生根培养基上。移栽生根苗长2-3周时，炼苗后移栽至土壤中。所用培养基见下表。表烟草转化所用培养基
权利要求
1.SEQ ID NO. I所示的棉花基因GbMYB5在烟草品种选育中的应用。
2.SEQ ID NO. I所示的棉花基因GbMYB5在提高烟草抗旱能力中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种与植物抗旱相关的棉花GbMYB5基因，同时涉及GbMYB5基因在提高烟草抗旱能力中的应用。本发明棉花抗旱基因GbMYB5具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。该转录因子是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQIDNO.2；2)将序列表中SEQIDNO.2的氨基酸残基序列经过一或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加且具有调控植物抗旱性功能的蛋白质。本发明的蛋白及其编码基因对于植物抗旱性机制的研究，以及提高植物的抗旱性状的改良具有重要的理论和实际意义，将在植物的抗旱基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号A01H5/00GK102643830SQ201210077310
公开日2012年8月22日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者周璐, 张保龙, 杨郁文, 胡雪虹, 郭佳茹, 陈天子, 马飞 申请人:南京师范大学