专利名称：一种大豆Dof17类转录因子GmDof17-1蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种大豆Dofl7类转录因子GmDofl7-l蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
大豆[Glycine max(L. )Merr.]是世界上主要的粮食和油料作物，含有30-55% 的蛋白质，是谷类食物的4-5倍，是人类与动物摄取植物蛋白质的主要来源。大豆蛋白质的氨基酸组成与牛奶蛋白质相近，是植物性的完全蛋白质，在营养价值上，可与动物蛋白等同。但是其限制性含硫氨基酸-半胱氨酸和甲硫氨酸含量略低，影响了大豆蛋白质营养的价值。大豆蛋白质改良的最主要目标是提高蛋白质含量的同时，增加含硫氨基酸的含量，以提高大豆营养价值和经济效益。现在全球面临蛋白质资源短缺的严重问题，因此尽快提高大豆品种蛋白质含量的同时，积极改善蛋白质的品质，提高其营养价值，对改善人类生活质量和畜牧产业具有积极而深远的现实意义。
发明内容
本发明为解决大豆中含硫氨基酸的含量相对较低的技术问题，提供一种大豆 Dofl7类转录因子GmDof 17-1蛋白。本发明的另一目的是提供该大豆Dof 17类转录因子GmDof 17-1蛋白的编码基因 GmDof17-1 ο本发明的又一目的是提供该蛋白和基因的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种大豆Dof 17类转录因子GmDof 17-1蛋白，具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。编码权利要求1所述的大豆Dof 17类转录因子GmDof 17-1蛋白的基因GmDof 17_1。所述的大豆Dofl7类转录因子GmDofl7-l的基因GmDofl7-l优选具有SEQ ID NO. 1 所示序列。含有所述的大豆Dof 17类转录因子GmDof 17-1的基因GmDof 17_1的表达载体。所述的表达载体是将SEQ ID NO. 1所示的大豆Dof类转录因子基因GmDof 17_1开放阅读框利用gateway技术插入植物表达载体pMDC32得到的pMDC83-GmDof 17-1植物过量表达载体。含有所述的大豆Dof 17类转录因子基因GmDof 17-1的工程菌。所述的工程菌优选将所述的大豆Dof类转录因子基因GmDof 17-1转入根癌农杆菌 EHA105 所得。所述的大豆Dofl7类转录因子GmDofl7-l蛋白在培育高含硫氨基酸含量的植物中的应用，所述的植物优选大豆。所述的含硫氨基酸优选半胱氨酸与甲硫氨酸。所述的大豆Dof 17类转录因子GmDof 17-1的基因GmDof 17_1在培育高含硫氨基酸含量的植物中的应用，所述的植物优选大豆，所述的含硫氨基酸优选半胱氨酸与甲硫氨酸。利用植物表达载体，将本发明的GmDof 17-1基因导入植物细胞，可获得高含硫氨基酸含量的转基因细胞系及转基因植株。使用GmD0fl7-l构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)的抗性基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。携带有本发明GmD0fl7-l的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织， 并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是大豆、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。有益效果导入过量表达本发明GmDofl7-l基因的烟草与非转基因烟草相比，其含硫氨基酸含量显著提高，说明GmDof 17-1基因及其编码的大豆Dof 17类转录因子GmDof 17-1蛋白对提高植物的含硫氨基酸含量方面起着重要作用。本发明的GmDofl7-l对培育高含硫氨基酸含量的植物品种特别是高含硫氨基酸含量的大豆，提高农作物特别是大豆的品质具有重要意义。
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。图1为GmDof 17-1基因在大豆染色体位置结构示意图。图2为GmDof 17-1在大豆中的表达特性图=GmDof 17_1在大豆不同器官中的表达分析。其中的种子1-4依次代表开花后20天、30天、40天、50天的种子。图3为含有GmDof 17-1的植物表达载体的部分结构示意图。图4为转基因植株和野生型植株含硫氨基酸含量的统计分析。(*，P ^ 0. 05 ；**，P^O. 01)图5为转基因植株中氨基酸含量提高比例的分析。图6为pMDC83质粒图谱。
具体实施例方式下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。实施例1、大豆GmDofl7-l及其编码基因的cDNA克隆与鉴定
大豆(Glycinemax (L. )Merr.)材料南农 94-16 (简写NN94-16)(韩锁义等，大豆" 南农94-16"突变体库的构建及部分性状分析。核农学报，2008)，由南京农业大学国家大豆改良中心种质资源研究室提供，材料种植于网室，常规田间管理。根据已报道的大豆Dof 17 (ABI16018)基因，搜索大豆基因组数据库(http://WWW. phytozome. net/soybean)，发现大豆中Dof 17转录因子有两个拷贝，分别位于7号和16号染色体，本发明研究的是位于7号染色体的Dof 17转录因子，命名为GmDof 17-1，其具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，编码SEQ ID NO. 2所示的氨基酸残基序列。氨基酸序列分析表明，该大豆Dof 17类转录因子GmDof 17-1蛋白由281个氨基酸残基组成，N末端有1个52 个氨基酸组成的高度保守的Dof结构域。用Peimerf程序根据GmDof 17-1基因序列设计引物正向引物序列‘5-ATGGAGGGGATGGCTCCCAATTCA-3，(SEQID NO. 3)；反向引物序列‘5-CCACGTTCCTTCACCAATCATTCC-3，(SEQID N0. 4)。应用RT-PCR方法，从大豆总RNA中扩增GmDof 17_1基因，具体方法为取大豆94-16叶片，置于液氮中研碎，RNA提取依据TIANGEN总RNA提取试剂盒RNA Plant Extraction kit DP417进行。cDNA第一链合成依据TaKaRa试剂公司cDNA第一链合成试剂盒 TaKaRa PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit D6110A，具体操作详见说明书。以得到的cDNA第一链为模板进行PCR扩增反应。25μ 1μ 1 PCR反应体系为1 μ IcDNA 第一链(0. 05μ g)、1 μ 1 引物(SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID Ν0· 4，10 μ Μ)、2· 5 μ 1 IOXPCR 缓冲液、2. 5 μ 1 Mg2\4y 1 dNTP (IOmM)和 1. 25U LA Taq DNA 聚合酶，用超纯水补足 25 μ 1。 反应在BIO-RAD PTC-200型PCR仪上进行，其程序为95°C变性5min;再94°C 30sec,56°C 50sec，72°C lmin30sec，共30个循环；然后72°C延伸IOmin ;4°C保存。PCR产物回收后经连接pGEM-T Easy载体、转化大肠杆菌DH5 α、蓝白斑筛选、摇菌、测序、序列分析，结果表明该PCR产物具有序列表中SEQ ID NO. 1的核苷酸序列，命名为GmDofl7-l基因，然后将SEQ ID NO. 1序列放入大豆基因组数据库中Blast，确定SEQ ID NO. 1在大豆染色体中的位置见图1。实施例2、GmDofl7-l在大豆不同器官和不同发育时期的花中的表达特征利用实时荧光定量PCR技术，对GmD0fl7-l在大豆各个器官和不同发育时期的花中的表达情况进行了研究。大豆实验材料于六月初播种于南京农业大学网室，田间管理同常规。第三片复叶展开时取根、茎、叶；盛花期取花；分别取开花后20天、30天、40天、50天的种子。各个组织取下后迅速液氮速冻，之后-80°C保存备用。总RNA的提取同实施例1。使用到的大豆组成型表达基因Actin (GenBank accession No. V00450)，扩增片段大小为583bp，其扩增引物序列为正向引物序歹Ij:5，-GTTCTCTCCTTGTATGCAAGTG-3，(SEQ ID N0. 5)；反向引物序列5，-CCAGACTCATCATATTCACCTTTAG-3，(SEQID N0. 6)。以来自大豆不同组织或器官的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR分析。 GmDof 17-1的扩增引物为正向引物序列5‘-GGGTTTCCCATGCAAGAAGTT-3，(SEQ IDN0. 7)；反向引物序列5‘-ACCACCCCTCTCTTGAATCTGA-3，(SEQ ID N0. 8)。
结果(图2)分析表明，GmDofl7-l在各个组织中都有表达，且在根中与种子中表
达量较高。实施例3、GmDof 17-1基因编码蛋白的功能鉴定利用Invitrogen 公司的 Gateway Technology with Clonase II 试剂盒， 将 GmDofl7-l 基因正向插入到表达载体 pMDC83 (Sokolov et al，2005，PNAS, 103 ； 9732-9737，质粒图谱见图6)中，得到PMDC83-GmDofl7-l植物过量表达载体(图3)，用冻融法将 pMDC83-GmDofl7-l 转入根癌农杆菌菌株 EHA105 (Avsian-Kretchmer et al, The Salt-Stress Signal Transduction Pathway That Activates the gpxl Promoter Is Mediated by Intracellular H202, Different from the Pathway Induced by Extracellular H202，2004，Plant Physiology，135 :1685-1696)中，在含有 50mg/L 潮霉素的MS培养基上，28°C进行培养，初步筛选得到具有潮霉素抗性的转基因植株。提取初步筛选得到具有潮霉素抗性的转基因烟草的基因组DNA，使用基因特异性引物PCR检测结果表明获得阳性转GmDofl7-l基因植株。采用A200amino acid Nova analyzer氨基酸分析仪测定转GmDof 17-1基因植株和野生型植株Tl代种子的自由氨基酸含量，检测和判定依据标准为JY/Y 019-1996氨基酸分析方法通则，其中含硫氨基酸含量结果如图4所示。转GmDofl7-l基因植株与野生型烟草相比含硫氨基酸总含量均极显著增加，提高了 28%，其中半胱氨酸提高了 9.4%，甲硫氨酸提高了 30% (见图5)。说明过量表达GmDof 17-1基因能提高转基因烟草的含硫氨基酸含量。
权利要求
1.一种大豆Dof 17类转录因子GmDof 17-1蛋白，其特征在于具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的大豆Dof17类转录因子GmDof 17-1蛋白的基因GmDof 17_1。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述的大豆Dofl7类转录因子 GmDof 17-1 的基因 GmDof 17-1，具有 SEQ ID NO. 1 所示序列。
4.含有权利要求3所述基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体是将SEQID NO. 1所示的大豆Dof类转录因子基因GmDof 17-1开放阅读框利用gateway技术插入植物表达载体 PMDC32得到的pMDC83-GmDofl7-l植物过量表达载体。
6.含有权利要求2或3所述大豆Dof类转录因子基因GmDof17-1的工程菌。
7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于所述的工程菌是将所述的大豆Dof类转录因子基因GmDof 17-1转入根癌农杆菌EHA105所得。
8.权利要求1所述的大豆Dofl7类转录因子GmDofl7-l蛋白在培育高含硫氨基酸含量的植物中的应用，所述的植物优选大豆。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的含硫氨基酸为半胱氨酸与甲硫氨酸。
10.权利要求2或3所述的大豆Dof17类转录因子GmDof 17-1的基因GmDof 17_1在培育高含硫氨基酸含量的植物中的应用，所述的植物优选大豆，所述的含硫氨基酸优选半胱氨酸与甲硫氨酸。
全文摘要
本发明属于植物基因工程领域，公开了一种大豆Dof17类转录因子GmDof17-1蛋白及其编码基因与应用。一种大豆Dof17类转录因子GmDof17-1蛋白，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其编码基因GmDof17-1具有SEQ ID NO.1所示序列。利用植物表达载体，将本发明的GmDof17-1基因导入植物细胞，可获得高含硫氨基酸(甲硫氨酸与半胱氨酸)含量的转基因细胞系及转基因植株。本发明的GmDof17-1对培育高含硫氨基酸含量的植物品种特别是高含硫氨基酸含量的大豆，提高农作物特别是大豆的品质具有重要意义。
文档编号C12N15/63GK102219843SQ20111015957
公开日2011年10月19日 申请日期2011年6月14日 优先权日2011年6月14日
发明者于静静, 喻德跃 申请人:南京农业大学