专利名称：一种应用于喜温硫杆菌的带有氯霉素抗性基因的小型化穿梭质粒pSDU1的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和生物工程技术领域，具体涉及一种带有氯霉素抗性基因和多克隆酶切位点的可在喜温硫杆菌中稳定存在的小型化质粒PSDU1。
背景技术：
喜温硫杆菌(AcidithicAacillus caldus，简称A. caldus)是一类革兰氏阴性的化能无机营养细菌，从还原性或部分还原性的硫化物的氧化中获得生长所必须的能量和还原力，以卡尔文循环固定空气中的CO2为碳源。该菌为极端嗜酸性的专性自养菌，最适PH为 2-3，在细菌冶金、煤的脱硫和含硫废水的处理等方面有着重要的用途。A. caldus以其独特的生活方式和在自然界中的特殊地位，长期以来受到人们的广泛重视，在菌种的分离培养、生理代谢、工业应用等方面做了大量的工作。近年来，随着分子生物学的发展，对硫杆菌中硫代谢及重金属抗性基因在体外进行了大量的表达研究，为利用基因工程的手段对硫杆菌进行改造，使其更好地用于产生奠定了基础。发明人的实验室率先在国际上使用接合转移的方法将外源基因通过大肠杆菌转移到氧化硫硫杆菌、氧化亚铁硫杆菌和喜温硫杆菌体内(Jin S, et al. , Appl. Environ. Microbiol. 1992, Vol. 58, No. 1,429-430 ；Peng J, et al. ， J. Bacteriol. 1994, Vol.176，No. 10,2892-2897 ；Liu X，et al.，J. Microbiol. Biotechnol.，2007，Vol. 17， No. 1，162-167)，并成功地建立喜温硫杆菌的电转化方法(Chen L，et al.，J. Microbiol. Biotechnol.，2010，Vol. 20, No. 1，39-44)。在喜温硫杆菌基因转移系统的研究中发现，其特殊的酸性生长环境，很容易使抗生素失效，液体培养时，质粒上的抗生素抗性基因无法起到有效的筛选作用，导致接合效率及电转效率均较低，且有较多的假阳性转化子菌落出现。因此，寻找理想的抗生素筛选标记，将有助于提高基因转移系统的转化效率，方便实验操作。 目前在喜温硫杆菌中广泛应用的穿梭质粒PJRD215多克隆位点较少且大多为不常用酶切位点，操作繁琐，限制了该质粒的使用，此外，质粒PJRD215较大(10，316bp)，使得质粒的承载能力较小。因此，构建一个具有理想筛选标记及多克隆位点的小型化穿梭质粒，对喜温硫杆菌的分子生物学研究及基因工程改造具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有质粒的不足，本发明要解决的问题是提供一种可在喜温硫杆菌中应用的带有氯霉素抗性基因的小型化穿梭质粒。本发明所述应用于喜温硫杆菌的带有氯霉素抗性基因的小型化穿梭质粒，其特征在于，所述质粒命名为PSDU1，由复制子oriV、自主复制蛋白基因r印、接合转移基因mob、氯霉素抗性筛选基因cat、多克隆酶切位点MCS构成。进一步的，上述质粒pSDUl的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。上述质粒pSDUl的构建方法
第一，构建可在A.caldus中转录表达的氯霉素抗性基因，第一轮PCR以质粒 PACYC184为模板，使用引物Prl和Pr2扩增出氯霉素抗性基因的开放阅读框，以第一轮PCR 产物为模板，以引物Pr3和Pr2，进行第二轮PCR，引物Pr3中含有质粒pBR322四环素抗性基因P2启动子，通过两轮PCR获得了含有P2启动子的氯霉素抗性基因第二，使用引物Pr4和Pr5扩增质粒pJRD215的oriV、r印、mob部分；第三，将PCR扩增获得的氯霉素抗性基因和oriV、r印、mob部分，分别用Alw 44 I、 EocT 22 I双酶切，纯化后，用T4 DNA连接酶连接环化，转化E. coli DH 5α，利用氯霉素筛选转化子，提取质粒并进行验证，该质粒为构建过程中的中间质粒，命名为PSDU ；第四，引入多克隆酶切位点，使用引物Pr6和Pr7，以中间质粒pSDU为模板，进行 PCR，将其线性化，引物Pr6、Pr7中分别含有来自质粒pUC19的一部分多克隆位点，PCR产物纯化后用Xba I单酶切，连接转化E. coli DH5 α，获得转化子，提取质粒酶切并测序验证，获得了含有多克隆位点的新型质粒，所述质粒命名为PSDU1，由复制子oriV、自主复制蛋白基因r印、接合转移基因mob、氯霉素抗性筛选基因cat、多克隆酶切位点MCS构成。上述引物序列是Prl GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGGAGAAAAAAATCACTGGPr2 CTTCGTGCACATTCATCCGCTTATTATCACTTPr3 CTGAGAATTCATGCATTCATGTTTGACAGCTTATCATCCATAAGGTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGPr4 CTTCGTGCACTCCTTGCAATACTGTGTTPr5 CTTCATGCATCCCAAGCTTAGAGCATACATCTGGAAGCAPr6 CTAGTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCATGCATTCATGTTTGACAGCTPr7 CTAGTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGAGCATACATCTGGAAGCA申请人:研究发现氯霉素在酸性环境下具有很高的稳定性，且对A. caldus的生长有明显的抑制作用，是一种理想的抗生素筛选标记。以质粒pACYC184(可购自Biovector Co.，LTD)上的氯霉素抗性基因开放阅读框为基础，使用可以在A. caldus中发挥功能的质粒pBR322(可购自Biovector Co.，LTD)的四环素抗性基因P2启动子，构建了可以在 A. caldus中发挥作用的氯霉素抗性基因，首次实现了氯霉素抗性基因在A. caldus中的表达，并以此为基础构建了质粒pSDUl。本发明所述的质粒pSDUl在喜温硫杆菌的分子生物学研究和基因工程改造具有巨大的应用潜力。该质粒使用氯霉素抗性为筛选标记，具有更高的转化效率，电转化喜温硫杆菌的转化效率比质粒PJRD215提高了 30倍；该质粒引入了质粒pUC19的多克隆位点，方便了使用；该质粒使用了质粒PJRD215的oriV、rep, mob部分，具有广宿主性，且在喜温硫杆菌中具有较高的稳定性；该质粒大小仅为6. 41Λρ，具有更大的承载能力。
图1为质粒pSDUl的构建流程图。图2为质粒pSDUl的物理图谱。
具体实施例方式实施例11、质粒 pACYC184(购自 Biovector Co.，LTD)的提取使用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. O 质粒小提试剂盒(购自TaKaRa公司，货号DV801A)，具体操作如下(1) 20ml LB培养基中加入相应的抗生素，接种1 %活化的菌种，37°C，200rpm,振荡培养 12-14h。(2)取5ml培养好的菌液倒入离心管中，12，OOOrpm离心3min，吸净上清。(3)向收集的菌体中加入250 μ 1的Solution I (含RNaseAl)，Vortex,充分悬浮细胞沉淀后的菌液转移到1. 5ml的EP管中。(4)加入250 μ 1的Solution II，轻轻地上下翻转5_6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。注菌体裂解一定要充分，形成透明溶液，且操作要迅速，此步不宜超过5min。(5)加入400 μ 1的4°C Solution III，轻轻地上下翻转混合5_6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置anin。(6) 12，OOOrpm 离心 lOmin。(7)将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。(8)取上清轻柔地转移至Spin Column中，然后12，OOOrpm离心lmin，弃滤液。(9)将 500 μ 1 的 RinseA 加入 Spin Column 中，12，OOOrpm 离心 30sec，弃滤液。(10)将 700 μ 1 的 RinseB 加入 Spin Column 中，12，OOOrpm 离心 30sec，弃滤液。(11)重复(9)，倾倒残液后，再l，2000rpm离心lmin。(12)将Spin Column安装于新的1. 5ml的离心管上，在Spin Column膜中央处加入30 μ L的65°C预热的灭菌ddH20，室温静置^iin。(13) 12，OOOrpm 离心 Imin 洗脱 DNA。2、第一轮PCR，扩增氯霉素抗性基因的开放阅读框利用引物Prl和1^2，以质粒pACYC184为模板，PCR扩增出氯霉素抗性基因开放阅读框。(1)上述引物序列如下Prl GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGGAGAAAAAAATCACTGG
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Pr2 CTTCGTGCACATTCATCCGCTTATTATCACTT(2)反应体系的配制ddH20 21 μ 1 ；Premiχ PrimerSTAR HS :25 μ 1 ；弓| 物 Prl :1· 5 μ 1 (0. 3 μ M final cone.)；引物 Pr2 :1· 5μ 1(0. 3μΜ final conc.)；模板 DNA (质粒 pACYC184) 1 μ L· (Premix PrimerSTAR HS 购自 TaKaRa 公司，货号DR040A)(3)聚合酶链式反应(PCR)循环具体步骤为94°C2min ；之后 98°C 10s, 55°C 15s，72°C lmin,共 29 个循环；最后72°C IOmin。(4) DNA凝胶电泳检测，扩增出了氯霉素抗性基因的开放阅读框。3、第二轮PCR，通过PCR在氯霉素抗性基因的开放阅读框上加入P2启动子以第一轮扩增的PCR产物为模板，以引物Pr3和Pr2，进行第二轮PCR，引物Pr3中含有P2启动子，通过PCR扩增获得了含有P2启动子的氯霉素抗性基因，引物Pr2含有Alw 44 I酶切位点，Pr3含有EcoT 22 I酶切位点。(1)上述引物序列如下Pr2 CTTCGTGCACATTCATCCGCTTATTATCACTTPr3 CTGAGAATTCATGCATTCATGTTTGACAGCTTATCATCCATAAGGTTTAATGCGGTAGTTTATCACAG(2)反应体系的配制ddH20 21 μ 1 ；Premix PrimerSTAR HS :25 μ 1 ；弓| 物 Pr2 :1· 5 μ 1 (0. 3 μ M final conc.)；引物 Pr3 1. 5μ 1(0. 3μΜ final conc.)；模板 DNA (第一轮 PCR 产物)1μ 1。(3)聚合酶链式反应(PCR)循环具体步骤为94°C2min ；之后 98°C 10s，55°C 15s，72°C lmin，共 29 个循环；最后 72°C IOmin。(4) DNA凝胶电泳检测，扩增出了含有P2启动子的氯霉素抗性基因。实施例21、质粒pJRD215(购自Biovector Co.，LTD)的提取参照实施例1中的1。2、从质粒pJRD215中扩增oriV、mob、r印等基因质粒利用引物Pr4和Pr5，从质粒pJRD215中扩增oriV、mob、r印等基因，引物Pr4 中含有Alw 44 I酶切位点，Pr5含有EcoT 221酶切位点(1)上述引物序列如下Pr4 CTTCGTGCACTCCTTGCAATACTGTGTTPr5 :CTTCATGCATCCCAAGCTTAGAGCATACATCTGGAAGCA(2)反应体系的配制 ddH20 21 μ 1 ；Premix PrimerSTAR HS :25 μ 1 ；弓| 物 Pr4 :1· 5 μ 1 (0. 3 μ M final conc.)；引物 Pr5 :1· 5μ 1(0. 3μΜ final conc.)；模板 DNA(质粒 pJRD215) 1 μ L·(3)聚合酶链式反应(PCR)循环
具体步骤为94°C2min ；之后 98°C 10s，55°C 15s，72°C 6min，*^ 个循环；最后 72°C IOmin。G) DNA凝胶电泳检测，扩增出了质粒pJRD215的ori V, mob, rep等基因。实施例31、构建中间质粒pSDU 将实施例1获得的含有P2启动子的氯霉素抗性基因和实施例2中PCR扩增获得的质粒PJRD215的ori V、mob、r印等基因，使用Alw 44 I,EcoT 22 I分别进行双酶切，纯化后利用 T4DNA 连接酶连接(10XT4DNALigase Buffer 1 μ 1，T4DNALigase Ιμ ，质粒片段1.5μ 1，基因bphC片段6. 5μ 1，16°C，过夜连接)。将连接反应液加入到50μ 1 E.coli DH5a感受态细胞中，轻混，冰浴30min， 42°C 90s，立即冰浴5min，加入0. 5ml LB液体培养基，37°C培养lh，将上述转化液涂布于含有氯霉素的LB培养基固体平板，37°C培养过夜。挑取氯霉素筛选平板上的转化子菌落，接种到含有氯霉素的LB液体培养基中， 370C，振荡过夜培养，提取质粒并进行酶切验证，验证正确的质粒即为中间质粒，将其命名为 pSDU。实施例41、质粒pSDU线性化利用引物Pr6和ft7，以质粒pSDU为模板，进行PCR，将其线性化，引物Pr6、Pr7中分别含有来自PUC19的一部分多克隆位点，且在5’端都含有)(ba I酶切位点。(1)上述引物序列如下Pr6 CTAGTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCATGCATTCATGTTTGACAGCTPr7 CTAGTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGAGCATACATCTGGAAGCA(2)反应体系的配制ddH20 21 μ 1 ；Premiχ PrimerSTAR HS :25 μ 1 ；弓| 物 Pr6 :1· 5 μ 1 (0. 3 μ M final cone.)；引物 Pr7 :1. 5μ 1(0. 3μΜ final conc.)；模板 DNA (中间质粒 pSDU) :1μ1。(3)聚合酶链式反应(PCR)循环具体步骤为94°Canin ；之后 98°C 10s，55°C 15s，72°C 6. 5min，共四个循环；最后 72°C IOmin。(4)DNA凝胶电泳检测，扩增出了线性化的质粒pSDU。2、构建质粒 pSDUl:PCR产物纯化后利用)(ba I单酶切，连接转化Ε. coli DH5 α，获得转化子，提取质粒进行酶切和测序验证，从而获得了含有多克隆位点的新型质粒，将其命名为PSDU1。
权利要求
1.一种应用于喜温硫杆菌的带有氯霉素抗性基因的小型化穿梭质粒，其特征在于，所述质粒命名为pSDUl，由复制子oriV、自主复制蛋白基因r印、接合转移基因mob、氯霉素抗性筛选基因cat、多克隆酶切位点MCS构成。
2.如权利要求1所述应用于喜温硫杆菌的带有氯霉素抗性基因的小型化穿梭质粒，其特征在于，所述质粒PSDUl的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
全文摘要
本发明公开了一种应用于喜温硫杆菌的带有氯霉素抗性基因的小型化穿梭质粒pSDU1，由复制子oriV、自主复制蛋白基因rep、接合转移基因mob、氯霉素抗性筛选基因cat、多克隆酶切位点MCS构成。所述质粒pSDU1使用氯霉素抗性为筛选标记，具有更高的转化效率；引入了质粒pUC19的多克隆位点，方便了使用；使用了质粒pJRD215的oriV、rep、mob部分，具有较高的稳定性；大小仅为6.4kbp，具有更大的承载能力，预示该质粒在喜温硫杆菌的分子生物学研究和基因工程改造中具有巨大的应用潜力。
文档编号C12N15/74GK102250939SQ20111015907
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月14日 优先权日2011年6月14日
发明者林建强, 林建群, 陈林旭 申请人:山东大学