专利名称：一种菌落pcr方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种菌落PCR方法及试剂盒。
背景技术：
在细菌的研究过程中，菌株的分离及鉴定是非常重要的一个环节。随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定已经从以形态和生理生化为主的传统表型分类进入到各种基因型水平的分类。其中，由于16S rRNA基因由保守区和可变区组成，其大小在1.51Λ左右，所以16S rRNA基因序列分析已经成为细菌种属鉴定和分类的标准方法。在这种方法中， PCR技术和测序技术发挥着重要的作用。PCR技术具有简便、快速、实用等特点，已广泛应用于生命科学研究的各个领域，在细菌的分类鉴定中更是发挥着极其重要的作用。目前在细菌的分离鉴定中，利用PCR技术扩增16S rRNA序列时，通常采用基因组 DNA的提取、菌体热裂解及冻融等方法进行PCR扩增。提取基因组DNA首先需要将分离的菌株进行液体培养，再通过酸酚法、碱酚法、SDS裂解法等提取其基因组DNA，最后采用PCR对 16S rRNA基因进行扩增，对序列进行分析来鉴定菌株。该方法需要提取基因组DNA，因此周期长、且所用化学试剂对操作人员有害，不能满足菌株的快速鉴定的需要。菌落PCR是一种不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，直接以菌体热解后暴露的 DNA为模板进行PCR扩增，通过16S rRNA基因序列的分析达到鉴定细菌的目的。其操作简单，快捷，省时少力。目前普通菌落PCR方法虽然简单、快速，但是其扩增效率经常比较低， 而且稳定性也差。
发明内容
本发明要解决的技术问题为针对普通菌落PCR的扩增效率低且稳定性差的缺陷， 提供了一种菌落PCR的方法，本发明所述方法扩增效率高，稳定性好。本发明提供的菌落PCR方法，包括以下步骤1)取菌落在含溶菌酶或蜗牛酶的缓冲液中37°C水浴处理30 60min ；2)在沸水中煮lOmin，离心后取上清进行PCR反应。溶菌酶(lysozyme)能够通过催化肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖残基间的β_1，4-糖苷键的水解，而破坏细菌的细胞壁。已广泛应用于医学、食品等领域。蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶。蜗牛酶是很有价值的一种酶，它可以用于酵母以及细菌细胞壁的破碎，因此广泛用于细胞生物学和基因工程学的研究。每克细胞经30 40mg酶在37°C保温1小时即可溶解细胞壁，破壁率达90%以上。利用过量的蜗牛酶或溶菌酶对菌落进行处理，能够有效地将细菌的细胞壁破碎，从而使其快速的释放出基因组DNA，达到高效稳定地进行菌落PCR的目的。作为优选，所述溶菌酶浓度为0. 4 0. 5mg/mL。作为优选，所述蜗牛酶浓度为3 ％ig/mL。
发明人发现，用本发明所述方法单独利用蜗牛酶对约氏乳杆菌菌落处理进行PCR 扩增，不能扩增出阳性条带的菌落，再单独使用溶菌酶处理后能够得到阳性条带，分析原因可能是蜗牛酶与溶菌酶的催化功能的差异造成的。提示本发明所述方法在应用过程中，用一种酶处理后进行PCR反应，如得不到阳性结果，可再用另一种酶处理后进行PCR反应，以达到互补且快速鉴定的目的。更优选地，本发明的一种实施方式为，取菌落在含溶菌酶(蜗牛酶)缓冲液中37°C 水浴处理30 60min ；在沸水中煮lOmin，离心后取上清进行PCR反应，如为阴性结果，取菌落在含另一种酶-蜗牛酶(溶菌酶)的缓冲液中37°C水浴处理30 60min;在沸水中煮 IOmin,离心后取上清再进行PCR反应。作为优选，所述PCR的反应体系为ddH20 37. 5 μ L，IOXPCR缓冲液5 μ L，dNTP混合物4 μ L，Taq 0. 5 μ L，细菌通用引物27F 1 μ L，细菌通用引物1492R 1“1^，上清1口1^。作为优选，所述PCR 反应条件为 95°C IOmin -MV 30s, 55 °C 30s, 72 °C Imin 30s，共30个循环；72°C延伸IOmin0本发明在传统菌落PCR的基础上，增加了对菌落的酶处理过程，使细菌的细胞壁得到更好的破碎，从而达到有效扩增的目的，本发明所述菌落PCR方法可适用于所有菌落， 优选为乳酸菌、芽孢杆菌或酵母菌的菌落。利用过量的酶对菌落进行处理，能够有效地将细菌的细胞壁破碎，从而使其快速的释放出基因组DNA，达到高效稳定地进行菌落PCR的目的。但是发明人发现，在常规PCR 体系中加入溶菌酶、蜗牛酶进行扩增，并不能得到阳性结果，分析原因是溶菌酶、蜗牛酶对于PCR体系具有抑制作用；而先对菌落加溶菌酶、蜗牛酶处理后，煮沸10分钟，再进行PCR 反应，该抑制作用解除，分析可能是溶菌酶、蜗牛酶结合PCR反应体系的Taq酶，从而抑制 PCR扩增，煮沸后溶菌酶、蜗牛酶变性，不再对PCR体系产生影响。本发明所述菌落PCR方法适用于所有的细菌和酵母菌，优选为乳酸菌或芽孢杆菌。乳酸菌是指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸菌的细菌统称为乳酸菌。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。长期科学研究结果表明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，对人的健康与长寿非常重要。 本发明的一个实施例中，发明人使用了 8株不同的乳酸菌和芽孢杆菌接种到MRS 及牛肉膏蛋白胨培养基上，对所得不同菌落进行对比实验，证明了本发明所述方法的普遍性。 本发明人通过对比的方法验证了溶菌酶(蜗牛酶)处理的模板对菌落PCR的影响，对比组分别为处理1 普通菌落PCR的模板，用取菌针接菌落到30 μ L的无菌水里，再取1 μ L作为模板。处理2 在处理1的基础上，用沸水煮lOmin，取1 μ L作为模板。处理3 取少量菌落，在37°C用30yL的IX溶菌酶(蜗牛酶)缓冲液水浴60min，取1 μ L作为模板。处理4:在处理3的基础上，将其用沸水煮IOmin取IyL作为模板。然后进行PCR反应。实验结果表明，普通菌落PCR扩增乳酸菌效率低，不能满足乳酸菌的筛选及鉴定要求。通过溶菌酶(蜗牛酶)的处理，并煮沸lOmin，能够有效地解决扩增效率不高的问题。本发明人通过对比的方法验证了不同量的溶菌酶(蜗牛酶)处理的模板对PCR扩增反应的影响，即用不同浓度的溶菌酶处理菌落PCR的模板，其浓度梯度为0. 1，0. 2,0. 4， 0.5mg/mL。用不同浓度的蜗牛酶处理菌落PCR的模板，其浓度梯度为1，2，3，％ig/mL。在其处理之后，用沸水煮lOmin。实验结果表明，作为优选，溶菌酶浓度为0.4 0.5mg/mL。作为优选，蜗牛酶浓度为3 ％ig/mL。本发明人通过对比的方法验证了溶菌酶(蜗牛酶)对菌落PCR模板的处理时间对扩增反应的影响，即取测试菌株的少许菌落，用30 μ L浓度为0. 4mg/mL的1 X溶菌酶缓冲液(浓度为3mg/mL的IX蜗牛酶缓冲液)水浴处理，分别取5min, 15min, 30min, 45min 和60min的处理样品，进而用于PCR扩增反应。实验结果表明，优选的溶菌酶处理的时间为 30min ；优选的蜗牛酶处理的时间为30min。本发明通过测序的方法对PCR产物进行验证，同时与利用传统方法，即对目的菌进行DNA提取，以基因组DNA为模板进行PCR扩增后测序的结果进行对比。测序结果表明， 本发明溶菌酶(蜗牛酶)处理后煮沸进行菌落PCR获得的扩增产物和以基因组DNA为模板获得的扩增产物测序结果相一致。本发明还提供一种菌落PCR试剂盒，包括溶菌酶或蜗牛酶。作为优选，本发明所述试剂盒还包括细菌的通用引物27F和1492R、Taq酶、PCR缓冲液、dNTP混合物。PCR 反应体系为 ddH20 37. 5 μ L，10 X PCR 缓冲液 5 μ L, dNTP 混合物 4 μ L，Taq 0. 5yL，细菌通用引物27F 1 μ L，细菌通用引物1492R1 μ L，菌落基因组模板1 μ L。本发明所述试剂盒的PCR反应条件为 95°C IOmin ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin 30s，共30个循环；72°C延伸IOmin0本发明所述菌落PCR方法解决了普通菌落PCR在鉴定中扩增效率低、且不稳定的问题，且较现有的提取基因组DNA鉴定的方法成本低且更加安全，具有广泛的应用前景。
图1为普通菌落PCR与用溶菌酶改进的菌落PCR的比较；图2为不同溶菌酶量对菌落PCR扩增反应的影响；图3为溶菌酶对菌落PCR模板的处理时间对PCR扩增反应的影响；图4为溶菌酶对菌落PCR模板的处理时间对PCR扩增反应的影响；图5为溶菌酶处理后预变性时间对PCR扩增的影响；图6为普通菌落PCR与用蜗牛酶改进的菌落PCR的比较；图7为不同蜗牛酶量对菌落PCR扩增反应的影响；图8为蜗牛酶对菌落PCR模板的处理时间对PCR扩增反应的影响；图9为蜗牛酶对菌落PCR模板的处理时间对PCR扩增反应的影响；图10为蜗牛酶处理后预变性时间对PCR扩增的影响。
具体实施例方式本发明公开了一种菌落PCR方法及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合乳酸菌和芽孢杆菌的具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1 菌落培养在无菌操作台中，将分离纯化的乳酸菌和芽孢杆菌接种于MRS及牛肉膏蛋白胨培养基上，于37°C培养M 48h，其在培养基上长出肉眼可见的菌落，作为实验所用菌落。所用菌株共8株，见表1。表1菌落PCR菌株
权利要求
1.一种菌落PCR方法，其特征在于，包括以下步骤1)取菌落在含溶菌酶或蜗牛酶的缓冲液中37°C水浴处理30 60min；2)在沸水中煮lOmin，离心后取上清进行PCR反应。
2.根据权利要求1所述的菌落PCR方法，其特征在于，所述菌落为乳酸菌、芽孢杆菌或酵母菌的菌落。
3.根据权利要求1所述的菌落PCR方法，其特征在于，所述溶菌酶浓度为0.4 0. 5mg/mLo
4.根据权利要求1所述的菌落PCR方法，其特征在于，所述蜗牛酶浓度为3 ％ig/mL。
5.根据权利要求1所述的菌落PCR方法，其特征在于，所述PCR反应如为阴性结果，取菌落在含蜗牛酶或溶菌酶的缓冲液中37°C水浴处理30 60min ；在沸水中煮lOmin，离心后取上清再进行PCR反应。
6.根据权利要求1所述的菌落PCR方法，其特征在于，步骤幻所述PCR反应条件为 950C IOmin ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin30s，共 30 个循环；72°C延伸 lOmin。
7.一种菌落PCR试剂盒，其特征在于，包括溶菌酶或蜗牛酶。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括细菌的通用引物27F和1492R、 Taq酶、PCR缓冲液和dNTP混合物。
全文摘要
本发明公开了一种菌落PCR方法，主要步骤为取菌落在含溶菌酶或蜗牛酶的缓冲液中37℃水浴处理30～60min；在沸水中煮10min，离心后取上清进行PCR反应。该方法利用过量溶菌酶或蜗牛酶对菌落进行处理，有效地克服了普通菌落PCR存在的稳定性差、效率低的问题，达到快速、稳定鉴定的目的。本发明还提供一种菌落PCR试剂盒，可应用于细菌的筛选和鉴定，特别是乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌的筛选和鉴定中。
文档编号C12Q1/68GK102230010SQ20111015958
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月14日 优先权日2011年6月14日
发明者王凡, 王安如, 王建设 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 北京科高大北农饲料有限责任公司