专利名称：临床及实验用无异种蛋白干细胞培养基添加物及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种临床及实验用高效无异种蛋白干细胞培养基添加物及其用途，具体来说，本发明公开一种可用于体外扩增培养人脐带或骨髓造血干/祖细胞的培养基添加物，培养基添加物由人脐带或胎盘提取液和体积百分比为10%的人脐带血浆组成，所述人脐带或胎盘提取液的终浓度为0. 10-0. 45mg/ml。该培养基添加物还能用于体外扩增人脐带或骨髓间充质干细胞。
背景技术：
干细胞是生物体内存在的一种具有自我更新能力和多系分化潜能的原始细胞群体，人体所有的组织器官细胞均由干细胞分化而来。随着对干细胞研究的不断深入，其临床应用价值也越来越受到重视。因其具有组织修复，细胞再生，免疫调节和免疫重建等功能， 使其广泛应用于神经、骨关节、肾病、糖尿病、移植及肿瘤治疗等各个领域。但干细胞不论源于自体还是异体，数量很少，不能满足临床应用要求，多需要从体外培养扩增。因此培养基必须满足干细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、PH等诸多方面的要求。因此，干细胞培养要求较高，其中，脐带血干细胞的培养条件更为苛刻，也更难控制，易凋亡、分化。目前市面上昂贵的工业化生产的无血清培养基也无法为脐带血干细胞生长提供必需的营养物质和最佳的细胞因子比例，干细胞扩增受限且易于凋亡。脐带造血干细胞具有多能分化特性，临床应用潜力极大，特别是白血病等癌症放化疗后的造血干细胞移植，但因其造血干/祖细胞数量少，无法满足临床应用。长期以来各国学者竭力研究其培养条件以利大量扩增供临床应用(Piacibello W，Sanavio F， Garetto L. et al. Extensive amplification and self renewal of human primitive hematopoietic stem cells from cord blood. Blood，89 :2644-2653)。美国已有以脐带血清作为培养基添加剂的专利(US7060494)，但它仍需加入多种昂贵的细胞因子，而且扩增所需时间长，且易分化。我们做了大量的实验进行比较，它比现有的无血清和常规的含有胎牛血清(FBQ培养基都好。但它们的共同问题仍是细胞分化和部分造血祖细胞丧失，超过 3周后，培养的脐带血有核细胞同样发生分化或凋亡，同时红系集落形成在10天后完全消失，所以仍然无法满足脐带造血干细胞移植所需的细胞量。我们也测试了 ^vitrogen公司新近开发的基质干细胞无血清培养基，主要用于脐带间充质干细胞(MSC)或来源于成人骨髓间充质(MSC)干细胞的培养。它也可以扩增脐带血有核细胞9倍左右，但没有临床应用价值，因为培养10天后就丧失了红系集落形成能力。迄今为止，虽然大多数培养基都可以扩增脐带血有核细胞，但都无法在短时间内有效地扩增脐带造血干/祖细胞，特别是红系造血干细胞/前体细胞，所以临床脐带血移植治疗成人白血病和其他恶性肿瘤结果不十分满意。
发明内容
基于目前干细胞培养基的缺陷及临床应用和基础研究的需求，我们利用废弃的人类脐带、胎盘以及脐带血浆做干细胞培养基添加剂，发明了这种高效、无异种蛋白培养基， 适用于各种干细胞培养，也可直接用于临床；而且取材方便，价格低廉，对于干细胞培养和临床应用有着深远的意义。本发明用脐带血浆和脐带及胎盘提取液做干细胞培养基添加物，并非单纯血清，所以保存了所有的干细胞生长所需的营养成分和细胞因子，另外各种物质的比例处于完全自然的干细胞生长状态，在国内、外尚未报道。本发明的一个目的在于提供临床及实验用无异种蛋白干细胞培养基添加物，包括人脐带或胎盘提取液和体积百分比为10%的人脐带血浆，所述人脐带或胎盘提取液的终浓度为0. 10-0. 45mg/ml。作为更为优选的实施方案，脐带或胎盘提取液的终浓度为0. 25,0. 3 或 0. 45mg/mL·本发明具体提供一种脐带或胎盘提取物的制备方法，其具体步骤为用生理盐水、 抗生素、生理盐水依次清洗胎盘和脐带，在冰槽内将其切成l-2cm大小的组织块，在冰冻状态将组织粉碎，按anl/g的比例加入RPMI 1640，4°C离心，保存上清液，速冻沉淀部分，重复粉碎、离心步骤，混合上清液。进一步，本发明提供的干细胞培养基添加物可应用于制备人脐带造血干/祖细胞的体外培养基。采用本发明的干细胞培养基添加物，可短时间扩增无分化脐带造血干细胞，本发明可以大量地扩增脐带造血干细胞，2周即可扩增16. 18至52倍；每份脐带血如果能分离出4. OX IO8至5X IO8有核细胞，2周时间内至少可以获得4. OX IO8X 16. 18 = 6. 47X IO9个有核细胞。而国际骨髓移植公认的标准是，骨髓移植脐带血有核细胞数量为 4. 4X IO7Ag0因此，两周体外扩增的脐带血已足够体重为70kg的两个成人骨髓移植使用。另一方面，本发明提供的干细胞培养基添加物还可应用于制备人骨髓干/祖细胞、脐带间充质干细胞的体外培养基。本发明的干细胞培养基添加物可以在2周的时间内扩增大量的造血干/祖细胞，其结果与脐带造血干/祖细胞扩增相似；本发明可以大量地扩增成人无分化骨髓间充质干细胞，扩增量可达109_1(1倍；本发明可以大量地扩增无分化脐带间充质干细胞，扩增量可达IO9,倍。以上概括的描述了本发明，可通过参照本文提供的某些具体实施例进一步理解本发明，这些实施例仅是为了说明而不是限制本发明。
图1 不同组成的培养基添加剂对脐带血有核细胞扩增倍数的影响情况对比G 周培养)。纵轴数字X10代表有核细胞的扩增倍数；横轴各字母分别代表不同的培养基，a :10%脐带血浆；b 脐带血浆+0. 15mg/ml脐带或胎盘提取液；c 脐带血浆+0. 30mg/ml脐带或胎盘提取液；d :0. 30mg/ml脐带或胎盘提取液；e 10 %自体血清 +0. 30mg/ml脐带胎盘提取液；f 常规10%胎牛血清；g =Invitrogen无血清培养基；图2 不同组成的培养基添加剂对脐带血有核细胞扩增倍数的影响情况对比O 周培养)。纵轴数字X10代表有核细胞的扩增倍数；横轴各字母分别代表不同的培养基，a :10%脐带血浆；b 脐带血浆+0. 15mg/ml脐带或胎盘提取液；c 脐带血浆+0. 30mg/ml脐带或胎盘提取液；d :0. 30mg/ml脐带或胎盘提取液；e 10 %自体血清 +0. 30mg/ml脐带胎盘提取液；f 常规10%胎牛血清；g =Invitrogen无血清培养基。
具体实施例方式实施例1.材料准备及干细胞培养基添加剂的制备过程收集小于妊娠9个月分娩的脐带、胎盘(不可使用过期妊娠胎盘)，_80°C保存。保留脐带血，同时分离脐带血有核细胞、血浆；在分装血浆前，离心去除血小板，分装，-80°保存。脐带血有核细胞按常规细胞分离、冻存方法进行保存。实验中所需要使用的材料1.培养液等抗生素(青霉素、链霉素、红霉素、庆大霉素)，01^1，1^1，1 ^1-1640， 生理盐水，PBS,临床级别DMS0，临床级别胰酶-EDTA。2.培养干细胞消耗品人血白蛋白(临床应用品，用于细胞冻存)；SCF IOyg/ ml, G-CSFlOy g/ml, TPO 10yg/ml。3.流式细胞仪检测所需的针对如下抗原的抗体⑶13、⑶29、⑶59 ；⑶11、⑶14、 CD31、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86、CDl 17。干细胞培养基添加剂中的人脐带血浆和人脐带或胎盘提取液的具体制备流程如下1)从脐带静脉取脐带血，20_25U/ml肝素抗凝(助产士在产房内无菌取)；2)离心，分离血浆和细胞；3)离心去除血小板，560C，30分钟灭活补体，分装于冻存管，_80°C保存；4)常规分离有核细胞，冻存于RPMI-1640培养液，7% DMS0，20%人类白蛋白；5)用生理盐水反复清洗胎盘和脐带，去除所有血污，杂质，必须在冰槽内进行，至少5次；6)庆大霉素、红霉素生理盐水洗两次(庆大霉素32万单位/升，红霉素0. 25g/ 升)；7)再用生理盐水反复清洗两次去除抗菌素；8)用机器将其切成l-2cm大小的组织块(必须在冰槽内进行)；9)组织粉碎机将冰冻状态组织粉碎，按aiil/g的比例加入RPMI 1640 (0°C )，再加工直至无可见的组织块或成糊状；10)按每克组织加2_3ml培养液再加入RPMI 1640培养液；11)超声进一步粉碎1-aiiin (必须在冰水中进行)；12) 4°C离心，保存上清液于-80°C ；冻存沉淀部分；13)速冻沉淀部分，再用粉碎机粉碎，然后重复11-13步骤；14)离心，保留上清液并与第13步获得的上清液混合。测蛋白含量，调节到15mg/ ml ο实施例2.人骨髓间充质、脐带间充质干细胞的体外培养扩增实验中所需要使用的材料DMEM (临床应用级别)；胰蛋白酶-EDTA消化液 0. 125%胰蛋白酶-0.01% EDTA(临床级另Ij )；3. 1制备扩增骨髓、脐带间充质干细胞培养基添加剂(共7管，以测试何种组合最佳)a) 10%脐带血浆；b) 10%脐带血浆+0. 15mg/ml脐带或胎盘提取液；
c) 10%脐带血浆+0. 30mg/ml脐带或胎盘提取液；d) 0. 30mg/ml脐带或胎盘提取液； e) 10 %自体血清+0. 30mg/ml脐带或胎盘提取液；f)对照1 常规10%胎牛血清；g)对照2 =Invitrogen无血清培养基；3. 2骨髓间充质干细胞(BMSC)的分离和培养1)人骨髓的抽取所用器械预先用肝素润湿，IOml注射器吸入Iml肝素化 PBS(200U/ml)；2)骨髓间充质干细胞(BMSC)分离采用密度梯度离心法；3)骨髓间充质干细胞(BMSC)原代培养原代细胞接种后2 5天换液，原代细胞一般于7 9天达到80%融合，传代培养；4)骨髓间充质干细胞(BMSC)消化传代加入0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化、计数， 以5 XioVml继续培养。骨髓间充质干细胞在上述培养基中生长情况骨髓间充质干细胞在上述各种培养条件下，增殖状态相似，细胞均勻一致，而且增殖快，倍增时间约30小时，维持时间最长，可以传20代左右，没有发现明显的细胞形态改变和分化迹象。流式细胞仪检测细胞的表面标记仍然是均一的间充质干细胞，取10代和20代的培养细胞，流式细胞仪检测示，细胞表达 CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD59,而不表达 CD11、CD14、CD31、CD34、CD38、CD45、CD80、 ⑶86、⑶117，表明它是间充质干细胞而不是造血干细胞。细胞的表面标记显示扩增的是骨髓间充质干细胞且纯度应为95%以上，成活率98%以上，可视为克隆来源的骨髓间充质干细胞。培养的细胞20代以前生长良好，扩增达IO9倍，22代以后细胞生长明显变慢，光镜下形态变大、形状变为不规则，胞浆内及培养液中可见较多颗粒，折光性差。3. 3人类脐带间充质干细胞的体外培养扩增脐带间充质干细胞(MSC)的分离采用本领域常用胶原酶IV消化法进行分离，脐带间充质干细胞与骨髓间充质干细胞相似，使用上述各种培养基，体外培养可以达5个月，传 20代以上，扩增101°倍，细胞形态没有明显改变，流式细胞仪检测也证实95%以上仍为间充质干细胞。免疫表型测定分别对第5、10、20代脐带MSC进行流式细胞仪检测，结果表明各代间免疫表型无明显差异，均强表达⑶13、⑶四、⑶105、⑶44，弱表达⑶106，不表达⑶14、 CD34、CDlU CD31、CD45。第5、10、20代脐带间充质干细胞(MSC)培养潜伏期12 24h，2d 后进入对数生长期，对数增殖期持续4 5d，7 8d后长满瓶底，生长停止。第5、10、20代脐带间充质干细胞(MSC)倍增时间分别为30. 1、31. l、32.2h。第5、10、20代脐带间充质干细胞(MSC)克隆形成率分别为22. 5%,20. 18%、18. 17%。实施例3.脐带血干细胞/祖细胞的体外培养扩增常规Percoll分离有核细胞，使用PRMI-1640培养基进行人脐带血单个核细胞 (MNC)培养，分别加入实施例3中所述的7种组合的培养基，每种再加lOOng/ml TPO, IOOng/ ml CSF和lOOng/ml GM-CSF细胞因子，培养第1、2、3、4周分别进行单个核细胞计数和造血干细胞集落培养及计数。脐带血干细胞/祖细胞在上述培养基中生长情况(1)脐带血有核细胞扩增倍数在6孔板上加5X IO5/孔，培养4周，b、c组脐带血有核细胞扩增倍数最高可达98. 7倍，细胞活力在95 %以上；培养基组a和e相似，有50. 5、 41. 7倍的扩增；d组也有22. 0倍的扩增；而常规FBS培养组仅增加了 3. 02倍，Invitrogen 无血清培养基组增加了 9. 1倍，参见图1。用b和c组培养基，培养2周的脐带血有核细胞扩增倍数约为16. 18倍，对照培养基f和g组的扩增倍数仅是1. 87和2. 91倍，参见图2，表 1。表1.脐带血有核细胞培养2周后⑶34+细胞扩增
培养前CD34%培养后CD34+%培养后CD34+扩增倍数Invitrogen无血.清培养基1.0 ±0.250.51 ±0.022.51 ±0.7910%脐带血浆+0.3mg/ml 脐带或胎盘提取液1.0 ±0.252.71 ±0.51106.08±20.29(2)培养脐带血有核细胞1 X IO5,培养1，2，3，4周后，分别取1 X IO4有核细胞，在 0. 3%琼脂，30% FBS，10% BSA，5X 10_5mOl/L巯基乙醇，DMEM培养基基础上分别加入加入实施例3中所述的7种组合的培养基添加剂作为干细胞培养基。培养14天计数CFC (Colony Forming Cell), CFU-GM(colony forming unit granulocyte and macrophage), CFU-E (colony forming unit erythroid),CFU-MK (colony forming unit megakaryocyte) 和BFU-MK (burst forming unit megakaryocyte)。以c培养基为例，造血祖细胞集落计数显示第3周达高峰，第4周逐渐下降，而且这些培养基组扩增集落形成细胞(CFC)的能力明显高于无血清培养组。而红系在培养2周后开始下降，参见表2-5。集落培养结果表明随培养时间的延长，扩增细胞中所含造血祖细胞增殖分化能力呈下降趋势，表现为所生成集落变小，这也反映了扩增细胞质量方面的变化。因此，在扩增技术时，应根据不同的应用目的，选择相宜的扩增时间。有效扩增红系细胞不宜超过2 周，有效扩增髓系和CD34+细胞最佳扩增时间为也为2-3周，需要造血干/祖细胞具有最强的增殖分化能力，则培养时间也在2周左右为宜，所以体外扩增的脐带血干细胞用于移植， 培养扩增时间不宜超过2周。脐带血浆和胎盘提取物可以有效促进脐带血造血干细胞体外增殖，虽然脐带有核细胞的培养扩增，在培养4周以后可以接近100倍，但在临床应用中避免超过3周的体外培养扩增，以防止细胞发生分化和凋亡，影响扩增质量。如果从一份脐带血中能够得到4. OX IO8至5. OX IO8有核细胞，本发明可以在短短的2周时间内至少可以获得4. OX IO8 X 16. 18 = 6. 47 X IO9造血前体细胞(根据最低的红系扩增倍数计算。按成人骨髓移植所需的造血前体细胞数4. 4X107/kg计算，70kg的成人骨髓移植需要3. 08父109个造血祖细胞。所以两周的培养扩增一份脐带血已足够两个成人骨髓移植使用。除此之外，我们还对骨髓造血干/祖细胞进行体外培养扩增，发现应用脐带血浆脐带或胎盘提取液扩增骨髓造血干/祖细胞的结果与上述脐带造血干细胞扩增结果完全相似。
表2.脐带血干/祖细胞体外扩增集落形成细胞的能力(Colony Forming Cell, CFC)XIO权利要求
1.一种临床及实验用无异种蛋白干细胞培养基添加物，包括人脐带或胎盘提取液和体积百分比为10%的人脐带血浆，所述人脐带或胎盘提取液的终浓度为0. 10-0. 45mg/ml。
2.根据权利要求2的干细胞培养基添加物，所述脐带或胎盘提取液的终浓度为0.3mg/ml ο
3.根据权利要求1-2中所述干细胞培养基添加物，所述脐带或胎盘提取液的制备方法为用生理盐水、抗生素、生理盐水依次清洗胎盘和脐带，在冰槽内将其切成l-2cm大小的组织块，在冰冻状态将组织粉碎，按anl/g的比例加入RPMI 1640，4°C离心，保存上清液，速冻沉淀部分，重复粉碎、离心步骤，混合上清液。
4.权利要求1所述的干细胞培养基添加物在制备哺乳动物脐带或骨髓造血干/祖细胞体外培养基的应用。
5.权利要求1所述的干细胞培养基添加物在哺乳动物脐带或骨髓间充质干细胞体外培养的应用。
6.根据权利要求4-5的应用，所述哺乳动物是人。
全文摘要
本发明涉及一种临床及实验用高效无异种蛋白干细胞培养基添加物及其用途，具体来说，本发明公开一种可用于体外扩增培养人脐带或骨髓造血干/祖细胞的培养基添加物，培养基添加物由人脐带或胎盘提取液和体积百分比为10％的人脐带血浆组成，所述人脐带或胎盘提取液的终浓度为0.10-0.45mg/ml。培养两周，可以扩增达17倍左右。该培养基添加物还能用于体外扩增人脐带或骨髓间充质干细胞。本发明利用废弃的人类脐带、胎盘以及脐带血浆做干细胞培养基添加剂，能够大量地扩增各种干细胞，包括脐带、骨髓造血干细胞，而且可以确保扩增的干细胞无分化，此外培养液无异种蛋白，非常适合临床应用。
文档编号C12N5/0789GK102250838SQ20111015959
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月4日 优先权日2011年6月4日
发明者云升, 邱英 申请人:内蒙古医学院