专利名称：一种在肿瘤细胞表面合成α-半乳糖苷表位并激活免疫细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种在肿瘤细胞表面合成α -半乳糖苷表位(α -Gal)并激活免疫细胞的方法，具体而言，本发明利用陈旧的、经福尔马林固定的或经石蜡包埋的肿瘤标本，经 α-1，3_半乳糖苷转移酶(GT)催化，在肿瘤细胞膜上合成半乳糖苷(α-Gal)表位，增强肿瘤抗原性，并以此作为疫苗。这些肿瘤细胞膜上的α-Gal表位体外可被APC细胞吞噬，激活T细胞和CIK细胞，同时体外快速扩增肿瘤特异性T细胞和CIK细胞，这些扩增的免疫活性细胞可以特异性地杀伤体内肿瘤细胞。
背景技术：
特异性免疫治疗肿瘤的基本原理是诱导针对肿瘤相关抗原(tumour associated antigen, TAA)的有效免疫反应，从而杀伤残留的肿瘤细胞。然而，用自体的肿瘤细胞作为瘤苗来免疫肿瘤患者并不很成功，主要由于TAA的免疫原性较弱，以及作为疫苗的肿瘤细胞膜不能充分地被APC(DC细胞是一种功能强大的APC细胞)摄取。增强TAA的免疫原性的一个可能办法就是将肿瘤细胞膜上的抗原扩增，同时与相应的抗体结合，形成免疫复合物， 通过免疫复合物中IgG分子的Fc片段与APC细胞膜上的Fc受体相结合，促进APC对肿瘤细胞膜的吞噬。这个过程可以通过体外肿瘤细胞膜上合成α-1，3-半乳糖苷(a-Gal)表位以达到扩增肿瘤相关抗原，同时利用人类血清中存在的天然的抗α -Gal表位的抗体与带有α -Gal表位的肿瘤相关抗原形成免疫复合物来实现。用α -1,3-GT在肿瘤细胞膜表面扩增肿瘤抗原的研究早在90年代末期就开始， 自从 LaTemple 等人 艮道(LaTemple DC, Henion TR, Anaraki F，Galili U. Synthesis of alpha 1，3-galactosyl epitopes by recombinant alpha-1,3-galactosyltransferase for opsonization of human tumor cell vaccines by anti-galactose.Cancer Res 1996,56 :3069-3074)将a-l，3-Gal表位接到肿瘤细胞膜表面以扩增其肿瘤相关抗原的免疫原性以来，相继有众多的研究者用不同的方法在新鲜肿瘤细胞膜表面添加α -1,3-Gal 表位，并以此作为肿瘤疫苗(Galili U, LaTemple DC. Natural anti-Gal antibody as a universal augmenter of autologous tumor vaccine immunogenicity. Immuno Today 1997,18 :283-285 ；Galili U, Chen ZC, Manches 0， Plumas J, Preisler H. Preparation of autologous leukemia and lymphoma vaccines expressing alpha-gal epitopes. Hematother Stem Cell Res. 2001,10(4) :501-511)，国内也有类似报道(邢力，郭札和，利用人的天然抗体抗肿瘤，中国肿瘤生物治疗杂志2001,8(1) :67-69)。因为这些方法都可以增加肿瘤的抗原性，动物实验比较成功，I、II期临床试用也已开始(Galili U. Autologous tumor vaccines processed to express alpha-gal epitopes :a practical approach to immunotherapy in cancer. Cancer Immunol Immunother. 2004,53(11) :935-945 ； Manches 0， Plumas J， Lui G， Chaperot L， Molens JP, Sotto JJ, Bensa JC, Galili U. Anti-Gal-mediated targeting of human B lymphoma cells to antigen-presentingcells :a potential method for immunotherapy using autologous tumor cells. Haematologica. 2005,90(5) :625-634 ；Posekany KJiWiley JEiGagnon GA. A novel method to display alpha—1，3_gal antigens on human leukemic cells for preparation of anti-leukemia vaccines. Anticancer Res. 2009，29 (6) :2387-2392 ；Galili U，Chen ZC, DeGeest K. Expression of alpha-gal epitopes on ovarian carcinoma membranes to be used as a novel autologous tumor vaccine. Gynecol Oncol. 2003,90 (1) :100-108)。虽然这些技术可以使人类肿瘤细胞膜表面合成α半乳糖苷表位，肿瘤抗原性得以扩增，也可以促进APC细胞对肿瘤细胞抗原的吞噬，但他们无一例外地应用活的肿瘤组织和细胞。如1999年LaTemple等人报道方法，他们都利用活的、新鲜的肿瘤标本。国内邢力等人也是用活的肿瘤细胞，用转基因的方法在肿瘤细胞膜表面表达α "Gal表位，此方法除了必须应用活的标本外，还存在细胞的基因转染率较低，成本高，所需时间长等缺点。但是我们知道，很多临床情况下，手术医生为了方便，手术切除的肿瘤组织都直接放到福尔马林内固定，没有留有新鲜的、活的肿瘤标本。因此，多数情况下，肿瘤标本已用福尔马林固定，石蜡包埋，没有新鲜的、活的肿瘤组织可用。为了使人肿瘤细胞膜表面合成 α -半乳糖苷表位，上述文献记载的免疫治疗技术都需要应用活的肿瘤标本，而对那些没有在当时保留活的肿瘤标本的患者，这种免疫治疗技术则无法进行。本发明克服了上述不利因素，本发明是利用陈旧的、经福尔马林固定的、或经石蜡包埋的肿瘤标本，经α -1，3-半乳糖苷转移酶催化，在肿瘤细胞膜上合成半乳糖苷表位，增强肿瘤抗原性，以此作为疫苗。体外被APC细胞吞噬，激活T细胞，同时体外快速扩增肿瘤特异性T细胞。这些免疫活性细胞可以特异性地杀伤体内肿瘤细胞。本发明不受标本福尔马林固定的影响，甚至石蜡包埋的标本也可以应用。本发明既可以用新鲜肿瘤组织、细胞，又可以用已经被福尔马林固定，甚至已被石蜡包埋的肿瘤标本。所以只要有肿瘤标本，这种肿瘤个体特异性免疫治疗技术就可以实施。 期望能够用于肿瘤患者，彻底消灭体内残留的肿瘤细胞，以达到根治肿瘤的目的。本发明利用a-l，3_GT在福尔马林固定的肿瘤细胞膜表面合成α-Gal表位，以及在石蜡包埋的肿瘤细胞膜表面合成α-Gal表位，在国内外均属首次。
发明内容
一种在肿瘤细胞表面合成α -半乳糖苷表位的方法，其特征在于其具体步骤为 从已用福尔马林固定或已用石蜡包埋的肿瘤组织中分离肿瘤细胞，用Iml组成为0. IM MES(PH 6. 2),25mM MnCl2和ImM UDP-gal的酶缓冲液将上述分离的肿瘤细胞重新悬浮，然后加入ImU神经氨酸酶，5U重组半乳糖苷转移酶(α -1，3-GT)，在37°C、30分钟温浴，随后， 分别用含有ImM EDTA的生理盐水和不含EDTA的生理盐水清洗2次，即得到细胞膜上已合成α-半乳糖苷表位的肿瘤细胞。本发明的一个方面提供了从已用福尔马林固定的肿瘤组织分离肿瘤细胞的方法 将肿瘤标本切成小于Icm的组织块，浸泡在大量的冷生理盐水内，冷库内摇床上震荡至少6 小时，期间至少换三次生理盐水，显微镜下小心去除肿瘤组织周围所有的结缔组织，用细的弯曲的针头游离肿瘤细胞，细胞筛过滤，去除大的细胞团块和结缔组织，游离的肿瘤细胞用冷生理盐水洗涤三次。
本发明的另一个方面提供了从已用石蜡包埋的肿瘤组织分离肿瘤细胞的方法用手术刀片尽可能去除肿瘤标本周围所有的石蜡，准备Histo-Clear溶液系列、3个带盖的容器，每个100ml，置于通风橱内的摇床上；将处理过的肿瘤标本置于上述第一个容器内，待所有的石蜡溶解，转移到第二、第三容器内，进一步去除石蜡；将经上述脱蜡后的标本转移到下列4个酒精系列容器内(100^,50%, 20%和生理盐水)，在摇床上各一小时以上；用细的弯曲的针头游离肿瘤细胞，细胞筛过滤，去除大的细胞团块和结缔组织，游离的肿瘤细胞用冷生理盐水洗涤三次。本发明还提供一种激活免疫细胞的方法，其步骤在于，通过权利要求1所述的在肿瘤细胞表面合成α -半乳糖苷表位的方法来扩增肿瘤细胞的抗原性，进而用于筛选大量肿瘤特异性免疫细胞。以上概括地描述了本发明，可通过参照本文提供的某些具体实施例进一步理解本发明，这些实施例仅是为了说明而不是限制本发明。
图1 流式细胞检测图阴性对照组的反应体系中无唾液酸酶和半乳糖苷转移酶 (GT)时，虽然用抗α-Gal表位抗体，肿瘤细胞膜上仍无FITC荧光(实线箭头所示)，说明肿瘤细胞膜表面无α-Gal表位；若反应体系加GT，用阴性对照抗体，肿瘤细胞无荧光，呈阴性反应(虚线箭头所示)。显示本流式细胞检测系统结果可靠，无非特异性反应；图2 流式细胞检测图阴性对照组中反应体系中不加GT，虽然用特异性抗α-Gal 抗体，细胞膜表面无FITC荧光，呈阴性结果(短实线箭头所示)；试验组中的反应体系中加入唾液酸酶和GT，用阴性对照抗体，结果也呈阴性，说明检测无非特异性反应(虚线箭头所示)。反应体系中加GT，然后用抗α-Gal表位抗体检测，肿瘤细胞膜上有大量FITC荧光， 呈阳性结果(长实线箭头所示)，说明肿瘤细胞经GT处理后，膜表面有大量α-Gal表位合成。
具体实施例方式实施例1.从已用福尔马林固定的人类肿瘤组织分离肿瘤细胞将肿瘤标本切成小于Icm的组织块，浸泡在大量的冷生理盐水内，冷库内摇床上震荡至少6小时，期间至少换三次生理盐水。显微镜下小心去除肿瘤组织周围所有的结缔组织，用细的弯曲的针头游离肿瘤细胞，细胞筛过滤，去除大的细胞团块和结缔组织，游离的肿瘤细胞用冷生理盐水洗涤三次。实施例2.从已用石蜡包埋的肿瘤组织分离肿瘤细胞用手术刀片尽可能去除肿瘤标本周围所有的石蜡，准备Histo-Clear溶液系列、3 个带盖的容器，每个100ml，置于通风橱内的摇床上；将处理过的肿瘤标本置于上述第一个容器内，待所有的石蜡溶解，转移到第二、第三容器内，进一步去除石蜡；将经上述脱蜡后的标本转移到下列4个酒精系列容器内(100^,50%, 20%和生理盐水)，在摇床上各一小时以上；用细的弯曲的针头游离肿瘤细胞，细胞筛过滤，去除大的细胞团块和结缔组织，游离的肿瘤细胞用冷生理盐水洗涤三次。实施例3.在固定的肿瘤细胞表面合成α -Gal表位
3. 1 配置酶缓冲液 Iml (0. IM MES (PH 6. 2), 25mM MnCl2 和 ImM UDP-gal)。用 Iml 酶缓冲液将上述分离的肿瘤细胞重新悬浮。然后向体系内加入ImU神经氨酸酶，5U重组的牛α -1，3-GT，在37°C、30分钟温浴，取出200 μ 1做流式细胞检测阴性对照组无唾液酸酶(neuraminidase)、无GT实验组有唾液酸酶、有GT在温浴结束后，分别用含有ImM EDTA的生理盐水和不含EDTA的生理盐水各清洗 2次(1500转/分，离心10分钟)。3. 2流式细胞仪测定肿瘤细胞膜表面α -Gal表位的合成先将Iml人血清(内含天然的抗α -Gal表位的抗体)用1 % BSA生理盐水按1 5 稀释，和细胞混合后，在冰上孵育60分钟。再用BSA的生理盐水洗两次(lOOOrpm，离心 5min)。弃上清。加入FITC标记的鼠抗人的IgG荧光抗体1 500在冰上孵育30分钟，用冷生理盐水漂洗两次。最后用生理盐水悬浮，过细胞筛。将上述操作所得细胞用流式细胞仪进行检测，结果如图1，2。实施例4.在肿瘤细胞膜上合成α -Gal表位，以扩增肿瘤抗原性按照实施例1和2的方法分离纯化肿瘤细胞，制备成细胞悬液，再以实施例3的方法合成α-Gal表位；常规方法制备DC细胞参考文献见=Chapuis F，Rosenzwajg Μ， Yagello M, et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol，1997 ;27 :431；用获得的DC细胞与肿瘤细胞共培养，以活化DC，最后活化的DC再激活T/CIK，随之体外应用常规方法迅速扩增肿瘤抗原特异性T/CIK细胞克隆。
权利要求
1.一种在肿瘤细胞表面合成α-半乳糖苷表位的方法，其特征在于其具体步骤为 从已用福尔马林固定或已用石蜡包埋的肿瘤组织中分离肿瘤细胞，用Iml组成为0. IM MES(PH 6. 2),25mM MnCl2和ImM UDP-gal的酶缓冲液将上述分离的肿瘤细胞重新悬浮，然后加入ImU神经氨酸酶，5U重组半乳糖苷转移酶(α -1，3-GT)，在37°C、30分钟温浴，随后， 分别用含有ImM EDTA的生理盐水和不含EDTA的生理盐水清洗2次，即得到细胞膜上已合成α-半乳糖苷表位的肿瘤细胞。
2.权利要求1的方法，其特征在于，从已用福尔马林固定的肿瘤组织分离肿瘤细胞的方法为将肿瘤标本切成小于Icm的组织块，浸泡在大量的冷生理盐水内，冷库)内摇床上震荡至少6小时，期间至少换三次生理盐水，显微镜下小心去除肿瘤组织周围所有的结缔组织，用细的弯曲的针头游离肿瘤细胞，细胞筛过滤，去除大的细胞团块和结缔组织， 游离的肿瘤细胞用冷生理盐水洗涤三次。
3.权利要求1的方法，其特征在于，从已用石蜡包埋的肿瘤组织分离肿瘤细胞的方法为用手术刀片尽可能去除肿瘤标本周围所有的石蜡，准备Histo-Clear溶液系列、3个带盖的容器，每个100ml，置于通风橱内的摇床上；将处理过的肿瘤标本置于上述第一个容器内，待所有的石蜡溶解，转移到第二、第三容器内，进一步去除石蜡；将经上述脱蜡后的标本转移到下列4个酒精系列容器内(100%，50%，20%和生理盐水)，在摇床上各一小时以上； 用细的弯曲的针头游离肿瘤细胞，细胞筛过滤，去除大的细胞团块和结缔组织，游离的肿瘤细胞用冷生理盐水洗涤三次。
4.权利要求1的方法，其特征在于，用重组的半乳糖苷转移酶在福尔马林固定的、石蜡包埋的陈旧肿瘤细胞膜表面合成α "Gal表位，以增强肿瘤细胞的抗原性。
5.一种激活免疫细胞的方法，其步骤在于，通过权利要求1所述的在肿瘤细胞表面合成α -半乳糖苷表位的方法来扩增肿瘤细胞的抗原性，进而用于筛选大量肿瘤特异性免疫细胞。
全文摘要
本发明涉及一种在肿瘤细胞表面合成α-半乳糖苷表位(α-Gal)并激活免疫细胞的方法，利用陈旧的、经福尔马林固定的或经石蜡包埋的肿瘤标本，经α-1，3-半乳糖苷转移酶催化，在肿瘤细胞膜上合成半乳糖苷(α-Gal)表位，增强肿瘤抗原性，并以此作为疫苗。这些肿瘤细胞膜上的α-Gal表位体外可被抗原呈递细胞(APC)吞噬，激活T/CIK细胞，同时体外快速扩增肿瘤特异性T/CIK细胞，这些免疫活性细胞可以特异性地杀伤体内肿瘤细胞。
文档编号C12N5/0783GK102286428SQ20111015960
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月4日 优先权日2011年6月4日
发明者云升, 邱英 申请人:内蒙古医学院