一种寡核苷酸及其制备在防治心肌肥大与心力衰竭药物中的用途的制作方法

专利名称：一种寡核苷酸及其制备在防治心肌肥大与心力衰竭药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程及生物医药技术领域，涉及了一种寡核苷酸及其用于制备预防及治疗病理性心肌肥大及心力衰竭药物的用途。
背景技术：
慢性心力衰竭又称充血性心力衰竭是指由于心肌收缩カ降低，在有充分静脉回流的前提下，心脏排出血量绝对或相对减少，不能满足全身组织器官代谢需要的ー种病理状态，是多种病因造成的心脏疾病的终末阶段。随着人民生活水平和生活方式的改变，加上竞争的加剧和社会的老龄化，心カ衰竭的发病率呈逐年増加的趋势。因此，如何预防及治疗心力衰竭愈发显得重要和紧迫。
近些年的临床资料总结显示，病理性心肌肥大、心室重构是心カ衰竭的特征，同时也是决定心力衰竭发病率，病程发展和死亡率的关键因素。导致病理性心肌肥大的典型疾病包括高血压，心肌梗死、心肌病及瓣膜病等。心肌肥大通常伴随着多种基因的改变，研究显示，ANF和belta-MHC是最典型的心肌肥大的标志性蛋白，同时，伴随着心肌肥大的发展，心肌的间质细胞如成纤维细胞增殖，心脏纤维化，进而心脏的顺应性降低，射血功能也受到明显的影响，并最終使心律失常、心衰及猝死的发生率増加。因此，心肌肥大是慢性心力衰竭的病理变化的核心步骤，使用药物干预和逆转心肌肥大是防治慢性心カ衰竭的有效手段。目前，在心肌肥大及心力衰竭的防治方面，常用的主要有受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACE I)、血管紧张素受体拮抗剂(ARB)、利尿剤、醛固酮受体拮抗剂及洋地黄类制剂。然而，长期应用利尿剂可引起药物抵抗和肾的再灌注损伤，应用ACE I、ARB和β-受体阻滞剂则会引发高血压、肾功能的恶化及高钾血症，因此，迫切需要寻找新的治疗方法来用于心肌肥大及心力衰竭的治疗。寡核苷酸是含ー类含有非甲基化胞嘧啶一鸟嘌呤二核苷酸基序的单链DNA序列，其主要通过与Toll样受体9 (Toll-like receptor9, TLR9)的结合发挥刺激作用。研究显示，寡核苷酸能直接活化机体的天然免疫系统，诱导产生以Thl型为主的免疫应答，间接活化获得性免疫。因此，寡核苷酸被广泛的应用于肿瘤、病毒感染及过敏性疾病的治疗中，并在临床前及临床实验研究中取得了可喜的成果。有趣的是，许多TLR受体激活后导致ΡΙ3Κα信号通路激活，后者能够有效防止病理性心肌肥大，但至今，未见寡核苷酸有改善心室重构、心肌肥大作用的报道。本发明提供一种新颖有效的抗心肌肥大及心力衰竭的方法，将为临床治疗心カ裳竭提供新的选择。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸及其功能类似物在制备防治心肌肥大、心力衰竭药物中的应用，达到防治心カ衰竭等心脏疾病的目的。本发明首先提供了ー种能够有效抑制心肌肥大和慢性心力衰竭的发生发展的含有序列片段5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸。本发明同时给出了含有以上所述的序列片段且能够有效抑制病理性心肌肥大和慢性心力衰竭的发生与发展的寡核苷酸序列及其功能类似物。本发明同时提供了以上所述的寡核苷酸序列片段5’-AACGTT_3’、以及含有该序列片段5’ -AACGTT-3的寡核苷酸序列及其功能类似物在制备治疗心、脑血管疾病(包括心肌肥大、心室重构；急、慢性心力衰竭；及心肌肥大和心衰相关的心律失常或猝死)的药物制剂中的用途。同时还提供了以上所述的寡核苷酸序列及其功能类似物在制备治疗高血压、冠心病、瓣膜病、心肌病的药物制剂中的用途。所述的寡核苷酸序列及其功能类似物可以单独应用，或自身联合应用，或与ー种或几种其他的治疗心血管疾病的药物联合应用。所述的治疗心血管疾病的药物可以是β_受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACE I)、血管紧张素受体拮抗剂(ARB)、利尿剂、醛固酮受体拮抗剂及洋地黄类制剂。
本发明所述的寡核苷酸序列及其功能类似物在给予个体时可以单独应用或做为药物组合中的有效成分与药物学可接受的载体一起应用。所述的寡核苷酸序列及其功能类似物在应用个体时可经肠道、非肠道(如皮下注射、静脉注射和肌肉注射等)和外用及吸入等给药途径实施。所述的寡核苷酸序列及其功能类似物的应用剂量为治疗的有效剂量。本发明中的术语除非特别强调，本发明中的术语具有可以被本发明所属领域内技术人员所理解的通常意义。若出现含义上的冲突，应遵从本发明中的解释、界定或说明。“病理性心肌肥大及慢性心力衰竭”本发明中的“病理性心肌肥大”和“慢性心力衰竭”即现代医学定义的病理性心肌肥大和慢性心カ衰竭，其中病理性心肌肥大是心肌细胞在各种病理性刺激下所产生的ー种以心肌细胞增大为主要特征的代偿性改变，慢性心力衰竭是指由于心肌收缩カ降低，在有充分静脉回流的前提下，心脏排出血量绝对或相对减少，不能满足全身组织器官代谢需要的ー种病理状态。研究表明，包括冠心病、瓣膜病、高血压及先天性心脏病等多种心血管疾病的发生与发展过程中均伴随着病理性心肌肥大的出现，而多种心血管疾病的终末阶段均表现为心力衰竭。因此，本研究所涉及的病理性心肌肥大和心カ衰竭的治疗包括但不限于冠心病、瓣膜病、高血压及先天性心脏病等多种心血管疾病的治疗。“个体”个体是指应用本发明寡核苷酸的人类个体和非人类脊椎动物个体。非人类脊椎动物个体包括非人类灵长类动物，畜牧动物和宠物动物。“抗病理性心肌肥大及心力衰竭药物”抗病理性心肌肥大及心力衰竭药物是指个体用于治疗病理性心肌肥大及心力衰竭的药物，包括但不限于β_受体阻滞剂，血管紧张素转换酶抑制剂(ACE I)，血管紧张素受体拮抗剂(ARB)，利尿剤，醛固酮受体拮抗剂及洋地黄类制剂。本发明中的含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能类似物可以单独应用，或几种联合应用，或应用药物可接受的载体，或和ー种或几种其他的抗病理性心肌肥大药物联合应用。本发明提供的5’-AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能类似物可以和其他的抗病理性心肌肥大药物同时应用，或按先后次序应用。“寡核苷酸”寡核苷酸是由糖(如脱氧核糖或核糖)，磷酸基团和碱基组成的单核苷酸连接而形成的分子，其中糖分子和碱基连接成核苷(nucleoside),核苷由磷酸基团连接形成核苷酸(nucleotide),形成核苷的碱基有喃唳和嘌呤，喃唳有胸腺喃唳(thymine,缩写为T或t)和胞喃唳(cytosine,缩写为C或c),嘌呤有腺嘌呤(adenine,缩写为A或a)和鸟嘌呤(guanine，缩写为G或g)。寡核苷酸可以是单链的也可以是双链的。在本发明中，“寡核苷酸”(Oligodeoxynucleotide, 0DN)可以用它的英文缩写ODN代替。“化学修饰”与自然的DNA相比，本发明中的寡核苷酸可以经各种化学修饰，修饰的部位可发生在核苷之间的磷酸ニ酯键，核糖単位或/和有机碱基(A、T、C、G，尿嘧啶，uridine，缩写为U或U)。在寡核苷酸的合成期间或合成后都可以进行修饰。在合成期间的化学修饰可以在 寡核苷酸的内部或5'端进行修饰。合成后的寡核苷酸可以但不限于在活性基团(如5'或3'端的磷酸或羟基)进行化学修饰。专业人员可以了解这些化学修饰具体方式。本发明中的化学修饰包括寡核苷酸的骨架修饰。其中，至少ー个核苷酸间键合中的非桥性磷酸氧原子被硫原子取代。寡核苷酸的骨架也可发生非离子DNA类似物，如烷基、芳香-碳磷酸盐化合物(带电荷的碳磷酸盐化合物氧原子被烷基、芳香基取代)修饰，再如磷酸ニ酯和烷基磷酸三酯中的氧原子部分被烷基化修饰。寡核苷酸还可以是磷硫酰和磷酸ニ酯的嵌合体。化学修饰还包括碱基替代，如C-5丙炔嘧啶和7-deaza-7替代嘌呤替代。化学修饰还包括碱基修饰。修饰的碱基在化学上不同于典型的自然中的碱基，但具有它们基本的化学结构。本发明中的寡核苷酸还可以用胞嘧啶衍生物或胸腺嘧啶核苷衍生物修饰。这里胞嘧啶衍生物是指胞嘧啶样核苷(除外胞嘧啶)。胸腺嘧啶核苷衍生物是指胸腺嘧样核苷(不包括胸腺嘧啶)。另外，本发明中的寡核苷酸的修饰可以是在寡核苷酸的两个或ー个末端连接ー个ニ元醇，如四こニ醇或六こニ醇。“治疗有效剂量”为了治疗病理性心肌肥大，给个体应用的剂量是治疗有效剂量。该治疗的有效剂量是指在治疗病理性心肌肥大的过程中，给予个体后可产生理想的预防或治疗效果的含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能类似物的剂量。本发明中的含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能类似物可以直接或放到药物学上可接受的载体中应用。这个“剂量”的多少决定于本领域技术熟练人员应知的标准技术，还要參考其他因素，包括并不限于个体的体重、年龄、健康状况和疾病的严重程度。本发明中的寡核苷酸可以用作単独治疗或多次治疗。本发明中的含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能类似物每次应用到个体的剂量范围从I μ g到100mg。为了达到理想的治疗效果，本领域技术熟练人员可以对应用的剂量作调整，如主治医师在可靠的医疗判断的基础上，做出的剂量调整，其剂量范围可以是前述范围的10倍到1000倍。“药物组合物”药物组合物指的是治疗有效剂量的含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸及其功能类似物与药物学上可接受的载体组成的混合物。药物组合物可以包含一个或多个本发明中的含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸及其功能类似物。药物组合物可以但不限于水溶液、盐溶液、颗粒、气溶胶、片剂、粉剂、胶囊剂、栓剂、乳剂、滴剂和其他合适的物质。在各种情况下，药物组合物必须是无菌和稳定的。“药物学可接受的载体”药物学可接受的载体是指ー种或多种固体或液体的填充剂、稀释剂或包封物质，此载体适合将本发明中的寡核苷酸应用于个体。该载体可以是有机的、无机的、天然的或合成的。该载体包括各种溶液、稀释剂、溶剤、分散剂、脂质体、乳剂、糖衣、抗菌剂、抗真菌剂、和其他的适合本发明中的寡核苷酸的载体。药物学可接受的载体的选择决定于本发明中含5’-AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能类似物的应用方式。可注射用的载体包括水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖溶液、甘油等。本发明的优点和有益效果本发明提供了含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能类似物，以及应用该寡核苷酸或其功能类似物用于制备治疗心肌肥大药物的用途。本发明提供的含5’-AACGTT-3’的 寡核苷酸或其功能类似物含有5’ -AACGTT-3’序列。本发明提供的含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能类似物在细胞及动物实验中均可以抑制心肌肥大的发生与发展。同时，含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能类似物为免疫调节剂，对人体未见明显的毒副作用。


图I是寡核苷酸(ODN)对新生大鼠心肌细胞肥大过程中的ANF和β -MHC的mRNA表达的抑制作用4是各寡核苷酸对ANF表达的抑制作用，B是各寡核苷酸对β-MHC表达的抑制作用；对照组溶媒对照组；模型组异丙肾上腺素刺激后的心肌肥大模型组。图2是寡核苷酸(ODN)对心肌肥大过程中ANF蛋白表达的抑制作用；Α是间接免疫荧光法检测寡核苷酸(ODN)对心肌肥大过程中ANF蛋白表达的抑制作用，对照组溶媒对照组；模型组异丙肾上腺素刺激后的心肌肥大模型组；RJL01组寡核苷酸RJLOl加上异丙肾上腺素刺激组是对A图的统计学处理；图3是寡核苷酸(ODN)抑制心肌肥大过程中ANF和β -MHC的表达的剂量曲线；Α是不同浓度寡核苷酸RJLOl对ANF表达的抑制作用，B是不同浓度寡核苷酸RJLOl对β -MHC表达的抑制作用；图4是寡核苷酸(ODN)抑制心肌肥大过程中ANF和β -MHC的表达的时间曲线；A是不同时间点加入寡核苷酸RJLOl对ANF表达的抑制作用，B是不同时间点加入寡核苷酸RJLOl对β -MHC表达的抑制作用；图5是寡核苷酸(ODN)对心肌肥大过程中的心肌细胞表面积增大的抑制作用；Α是间接免疫荧光法检测寡核苷酸(ODN)对心肌肥大过程中的心肌细胞表面积增大的抑制作用，对照组溶媒对照组；模型组异丙肾上腺素刺激的心肌肥大模型组；RJL01组寡核苷酸R几01加上异丙肾上腺素刺激组；B是对A图的统计学处理；图6是寡核苷酸(ODN)对小鼠心肌肥大模型的抑制作用；A寡核苷酸对心室肥厚的抑制作用，B是寡核苷酸对心脏重量的抑制作用；(是寡核苷酸对心体比的抑制作用山是寡核苷酸对心肌细胞坏死的保护作用，对照组溶媒对照组；模型组异丙肾上腺素刺激的小鼠心肌肥大模型组；RJL01组注射寡核苷酸RJLOl后在注射异丙肾上腺素的模型组。
具体实施例方式实施例中的寡核苷酸由TAKARA公司合成，并经无热源处理。以下是在实施例中应用的寡核苷酸(ODN)的序列和名称RJL-I(SEQ ID NO:I):5， -tcgtcgttaa cgttaacgct tag-3J (23bp)RJL-2(SEQ ID NO:2):5， -tcttcgttaa cgttaacgat gacgta-3， (26bp)RJL-3(SEQ ID NO:3):5， -taaacgaacg ttttaacgtt cgttta-3， (26bp)RJL-4(SEQ ID NO:4):5， -tcgtcgttaa cgttaagacg taggg-3， (25bp)RJL-5(SEQ ID NO:5):5， -tcgcgaacgt tcgccgcgtt cgaacgcggg-3， (30bp)实施例I寡核苷酸(ODN)对新生大鼠心肌细胞肥大过程中的ANF和β -MHC的mRNA表达的抑制作用I新生大鼠心肌细胞的分离、心肌肥大模型的诱导和寡核苷酸的处理(I)仪器设备、器材、试剂和材料低温冰箱，ニ氧化碳孵箱，超净工作台，倒置显微镜，细胞培养瓶，水平离心机，加样器，各种规格的滴管等。ODN :均由Takara公司合成，OPC级别，其磷酸骨架除特殊标明外均为全硫代修饰。以PBS (配方參考《分子克隆实验指南(第三版)》)溶解，紫外分光光度计定量。异丙肾上腺素(异丙肾上腺素)，胰酶，II型胶原酶，ITS和Laminin均购于Sigma公司。HBSS, DMEM,双抗(PS)和FBS购于Gibco公司。(2)方法断头处死新生大鼠，打开其胸腔，取出心脏，修剪掉主动脉，把心室放至含有HBSS的小皿中，将其剪成四小块；把切好的心室转移至含有1%胰酶溶液的培养瓶中，放入冰箱4°C保存10-12h ;向培养瓶中加入IOml新生大鼠心肌细胞的分离I液(DMEM+7%FBS+1%PS)，37°C水浴3min ;吸出瓶中液体，加入IOmlII型胶原酶溶液(lmg/ml )，37°C水浴轻摇2min ；吸出液体，再加入IOmlII型胶原酶溶液，37°C水浴摇6_10min ;收集胶原酶/细胞悬液于50ml离心管中，井置于冰上；向剩下的心室组织中继续加入II型胶原酶溶液，重复步骤，直至看不到心室肌小块；用100目尼龙网过滤收集到的细胞悬液,500rpm离心5min ;用新生大鼠心肌细胞的分离I液悬浮细胞沉淀；将悬浮好的细胞悬液转移至培养瓶中，置于培养箱中培养75min ;将细胞悬液吸出，转移至另ー培养瓶中，置于ニ氧化碳培养箱中培养24h ；将分离I液吸出更换为新生大鼠心肌细胞分离II液(DMEM+1%ITS+1%PS)继续培养12h后，加入0DNRJL01，RJL02, RJL03, RJL04, RJL05至终浓度10mg/ml，作用12h后，加入异丙肾上腺素至终浓度1(^11101/1111，继续孵育4811后，进行后续实验；其中的对照组为溶媒对照组，实验过程中只加入PBS的溶媒对照；模型组为异丙肾上腺素刺激后的心肌肥大模型组，不进行ODN的刺激，只加入异丙肾上腺素作用48h。2、总RNA的提取、逆转录及实时定量PCR(I)仪器设备、器材、试剂和材料低温冰箱，实时定量PCR R(Eppendorf),紫外分光光度计，低温离心机，各种滴
管，离心管等。Trizol 购于 Takara,逆转录酶，Oligo dT, dNTPs, SYBR-green 等均购于invitrogen。
(2)方法总RNA的提取PBS洗涤经处理的细胞3次，加入Trizollml，吹打10次后，收集到离心管中，静置5min ;加入氯仿200 μ I,振荡混勻2min,静置15min, 12000转离心15min,取上清约500 μ I到一新的离心管中，加入异丙醇500 μ I,静置15min, 12000转离心IOmin,弃上清，加入75%こ醇1ml，12000转离心5min，弃上清，室温下干燥lOmin，以20 μ I无酶水溶解沉淀，做为模板进行后续实验。RT-PCR
I)将下列成分加入置于冰上的PCR管中Oligo dTI μ I模板RNAI μ g无酶水补足至10 μ I2)轻轻混匀，70°C孵育6min，置于冰上5min;3)将下列成份加入该管中
S^RT buffer5 μ
MLVI μ
RNA Enzvme inhibitor 0.5 μ dNTPs μ
无酶水7.5 μ 4) 42°C 60min,70°C IOmin终止反应，即为cDNA，置于4°C保存进行后续实验。实时定量PCR反应体系
SYBR GreenER qPCR SuperMix for iCycler10 μ
上游引物，10 μΜ0.5 μ
下游引物，10 μΜ0.5 μ
cDNAI μ
DEPC 水8.0 μ I反应程序①50 °C 2 分钟②95 °C 2 分钟③％でI5秒④60 °C I 分钟⑤返回步骤③，重复③和④29次⑥溶解曲线引物序列ANF: 5'端引物gggggtagga ttgacaggat3，端引物ctccaggagg gtattcaccaβ -MHC: 5'端引物cctcgcaata tcaagggaaa
3’ 端引物tacaggtgca tcagctccagl8s:5，端引物accgcagcta ggaataatgga3’端引物 gcctcagttc cgaaaacca3、实验結果结果显示，在新生大鼠心肌细胞肥大模型中，经异丙肾上腺素处理48h后，与对照组相比，ANF和β -MHC的mRNA表达显著上调，其中ANF的表达上调约7倍，β -MHC的表达上调约3倍。经各个寡核苷酸处理12h后，ANF和β -MHC的表达显著下降，与模型组相比，两者的Ρ〈0. 001，具有统计学差异(图I)。结论寡核苷酸可以显著抑制心肌细胞肥大模型中ANF和β -MHC的mRNA表达上 调。实施例2寡核苷酸(ODN)对心肌肥大过程中ANF蛋白表达的抑制作用I、新生大鼠心肌细胞的分离和心肌肥大的诱导方法同实施例1，注意把细胞接种到铺有20mm盖玻片的培养皿中。2、间接免疫荧光检测ANF蛋白的表达(I)仪器设备、器材、试剂和材料PI (sigma), ANF单克隆抗体(小鼠)购于Santa Cruz, FITC-突光二抗购于Invitrogen,共聚焦显微镜(Leica, Germany)。(2)方法吸去培养液，加入适量PBS清洗3次；加入4%甲醛溶液，室温固定20min ;加入适量 PBS 充分清洗，加入 O. 5%Tritonl00，-20°C通透 IOmin ;2%BSA 封闭 Ih ;加入 ANF—抗(I 200稀释)400 μ 1，室温孵育lh，PBS清洗3次;加入荧光ニ抗(I :200稀释)400 μ 1，室温孵育lh，PBS清洗3次；PI复染2min，PBS清洗2次。80%甘油封片，使用共聚焦荧光显微镜拍照、分析。3、实验結果结果显示，新生大鼠心肌细胞肥大模型中，与对照组相比，心肌细胞的ANF表达显著上调，ANF阳性表达的细胞可达到全部细胞的40%以上。经寡核苷酸RJLOl处理12h后，ANF的表达显著下降，ANF阳性表达的细胞只达到全部细胞的10%，与模型组相比，两者的P〈0. 001，具有统计学差异(图2)。结论寡核苷酸RJLOl可以显著心肌细胞肥大模型中的ANF的表达上调。实施例3寡核苷酸(ODN)抑制心肌肥大模型中的ANF和β -MHC表达的剂量曲线I、新生大鼠心肌细胞的分离和心肌肥大的诱导方法同实施例I。在剂量曲线的实验中，分别以终浓度20、10、5、2、1、0· 5μ g/ml的RJLOl刺激新生大鼠心肌细胞，对照组和模型组加入PBS，作用12h后，加入异丙肾上腺素至终浓度10 μ mol/ml，继续孵育48h后，进行后续实验。2、总RNA的提取、逆转录及实时定量PCR :方法同实施例I。3、实验结果结果显示，浓度为I μ g/ml的ODN RJLOl即可以有效的抑制心肌肥大过程中的ANF和β -MHC的表达上调，并且随着ODN浓度的増加，对该两种基因的抑制作用逐渐增强(*，与模型组相比，Ρ〈0· 05 ;**，与模型组相比，Ρ〈0· 001，图3)。结论RJL01对于心肌肥大过程中ANF和β -MHC的表达上调的抑制作用呈剂量依
赖关系。实施例4寡核苷酸(ODN)抑制心肌肥大模型中的ANF和β -MHC表达的时间曲线4、新生大鼠心肌细胞的分离和心肌肥大的诱导方法同实施例I。在时间曲线的实验中，分别在加入异丙肾上腺素之前12，3和Ih及加入异丙肾上腺素之后的1，3和12h加入终浓度为5 μ g/ml的R几01刺激进行刺激，再异丙肾上腺素作用48h后,进行后续实验。 5、总RNA的提取、逆转录及实时定量PCR :方法同实施例I。6、实验结果结果显示，在加入异丙肾上腺素的之前12，3和Ih及加入异丙肾上腺素之后的1，3h加入ODN RJLOl均可以有效的抑制心肌肥大过程中ANF和β-MHC的表达上调(*，与模型组相比，Ρ〈0. 05 ;**，与模型组相比，Ρ〈0. 001，图4)。结论RJL01的这种对心肌肥大作用过程中ANF和β -MHC的表达上调有预防和治疗性作用。实施例5寡核苷酸(ODN)对心肌肥大过程中的心肌细胞表面积增大的抑制作用I、新生大鼠心肌细胞的分离和心肌肥大的诱导方法同实施例I。2、间接免疫荧光法检测α-actin的表达PI (sigma), ANF单克隆抗体(小鼠)购于Santa Cruz, FITC-突光二抗购于invitrogen。(2)方法:吸去培养液，加入适量PBS清洗3次；加入4%甲醛溶液，室温固定20min ;加入适量 PBS 充分清洗，加入 O. 5%Tritonl00，-20°C通透 IOmin ;2%BSA 封闭 Ih ;加入 ANF—抗(I 200稀释)400 μ 1，室温孵育lh，PBS清洗3次;加入荧光ニ抗(I :200稀释)400 μ 1，室温孵育lh，PBS清洗3次；PI复染2min，PBS清洗2次。80%甘油封片，使用共聚焦荧光显微镜拍照，应用Image J软件对细胞表面积进行测量。3、实验结果心肌细胞肥大模型组与对照组相比，心肌细胞的表面积增大了 3倍。再经ODNRJLOl处理12h后，心肌细胞的表面积未出现明显的増大，与模型组相比，两者的P〈0. 001，具有统计学差异(图5)。结论RJL01可以显著抑制心肌肥大过程中心肌细胞表面积的增加。实施例6寡核苷酸(ODN)对小鼠心肌肥大模型的抑制作用I、小鼠心肌肥大模型的建立及ODN的注射将6 8周龄，18 22g C57BL/6小鼠分为4组，每组8只，每天下午3点背部皮下注射浓度为5mg/ml的异丙肾上腺素200 μ 1，连续注射6天，即可形成小鼠心肌肥大模型。ODN的于注射异丙肾上腺素的前一天开始腹腔注射，时间为早上8点，连续注射6天，浓度为250 μ g/ml ο对照组注射PBS。具体的分组如下实验分组对照组，背部皮下注射200 μ I PB,连续6天；模型组，背部皮下注射200 μ I浓度为5mg/ml的异丙肾上腺素，连续6天；ODN组，腹腔注射200 μ I 浓度为250 μ g/ml的RJLOl，连续6天；再从第二天开始背部皮下注射200 μ I浓度为5mg/ml的异丙肾上腺素6天。2、实验结果在最后一次注射的24h后，苯巴比妥注射麻酔小鼠，称重；进而打开胸腔，获取心脏后拍照、称重。心脏进行多聚甲醛固定，切片，HE染色。结果表明，与对照组相比，模型组小鼠的心脏重量明显增大，心脏重量和小鼠体重的比例(心体比)増大，HE染色显示心脏中出现大面积组织坏死。在注射ODN RJLOl之后，与模型组相比，ODN组的心脏重量下降，心体比下降，组织的坏死面积明显减小，两者的P〈0. 05,具有统计学差异(图6)。结论注射RJLOl对小鼠的心肌细胞肥大模型有明显的减轻作用。
权利要求
1.ー种能够有效抑制心肌肥大和慢性心力衰竭发生发展的含有序列片段5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸。
2.ー种含有权利要求I所述的序列且能够有效抑制心肌肥大和慢性心カ衰竭的发生与发展的功能类似物。
3.根据权利要求2所述的寡核苷酸序列及其功能类似物，其特征在于序列5’ -AACGTT-3’的两个末端可以添加其他任意的由4种核苷酸A、T、C和G组成的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的寡核苷酸序列及其功能类似物，其特征在于序列5’ -AACGTT-3’可以经化学修饰，化学修饰的部位可以是核苷间的磷酸ニ酯键和/或核糖和/或碱基；经化学修饰的寡核苷酸序列中任一的寡核苷酸被界定为相应的相应寡核苷酸的功能类似物。
5.权利要求I所述的含有序列片段5’-AACGTT-3’的寡核苷酸在制备预防及治疗心肌肥大、心室重构药物制剂中的用途。
6.权利要求I所述的含有序列片段5’-AACGTT-3’的寡核苷酸在制备预防及治疗急、慢性心力衰竭的药物制剂中的用途。
7.权利要求I所述的含有序列片段5’-AACGTT-3’的寡核苷酸在制备预防及治疗心肌肥大和心衰相关的心律失常或猝死的药物制剂中的用途。
8.权利要求2至4中任一项所述的寡核苷酸序列及其功能类似物在制备预防及治疗心肌肥大、心室重构药物制剂中的用途。
9.权利要求2至4中任一项所述的寡核苷酸序列及其功能类似物在制备预防及治疗急、慢性心力衰竭的药物制剂中的用途。
10.权利要求2至4中任一项所述的寡核苷酸序列及其功能类似物在制备预防及治疗心肌肥大和心衰相关的心律失常或猝死的药物制剂中的用途。
全文摘要
本发明属医药技术领域，具体涉及含5’-AACGTT-3’的寡核苷酸及其功能类似物，以及应用该寡核苷酸或其功能类似物用于预防及治疗心肌肥大及慢性心力衰竭的用途。本发明采用国内外学术界公认的心肌细胞及动物的肥大模型对含5’-AACGTT-3’的寡核苷酸的作用进行研究。实验结果显示，含5’-AACGTT-3’的寡核苷酸具有明显的抑制心肌肥大的标志性蛋白ANF、β-MHC基因的表达，并抑制心肌细胞表面积的增加，寡核苷酸的这种抑制作用同其剂量呈依赖关系。在整体实验中，含5’-AACGTT-3’的寡核苷酸能显著的抑制心肌肥厚及心体比的增加，并减少心肌坏死的发生。本发明的实验结果提示含5’-AACGTT-3’的寡核苷酸为有效治疗心肌肥大乃至心力衰竭的药物。
文档编号A61P9/04GK102719436SQ20121021501
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月27日 优先权日2012年6月27日
发明者唐向东, 李静, 杨亮 申请人:南开大学