Mr—1基因在心肌肥大中的调节功能的制作方法

专利名称：Mr—1基因在心肌肥大中的调节功能的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人类基因功能，特别是涉及与心肌肥大相关的基因功能；本发明还涉及该基因功能调控心肌功能的机理，阐明基因表达与心肌疾病发生的关系，为寻求相关疾病的临床诊断和治疗奠定了基础。
背景技术：
MR-1基因是成肌纤维生成的一种调节基因。成肌纤维的生成与一类特殊的成纤维细胞有关，它们具有收缩性，能合成和降解细胞外基质，并具有分泌细胞因子、生长因子和炎性介质等功能。人类成心肌(纤维)细胞是心脏肥厚和心力衰竭相关心肌纤维化的根源。后者受多种因素的调控，如Myostatin负调控细胞的增值；大量研究认为，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)，尤其是血管紧张素II(AngII)和醛固酮(ALD)参与心肌纤维化的形成。
AngII引起心肌纤维化的机理可能与增加血管壁通透性有关，其结果使血液循环中的大分子物质如血小板源性生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子-β(TGF-β)等渗入心肌间质，刺激成纤维细胞合成和分泌胶原。AngII直接影响心肌胶原的合成与降解，能够促进离体培养的心脏成纤维细胞增生。AngII介导的细胞毒表现为，它能诱导肾上腺髓质分泌儿茶酚胺(CA)，而高浓度的CA能直接引起心肌细胞坏死。此外，AngII的增高能加重缺血心肌的损伤，刺激并促进ALD的释放加重心肌纤维化的形成。
慢性高血压会导致心脏肥大，肾功能衰竭，脑或神经损害以及眼底视网膜改变。高血压患者遍及全身组织的外周动脉会逐渐硬化和增加血流阻力。血流阻力增大可使心肌波动强度增加以使血液能够输往全身。这种工作负载的增加必然会导致心肌劳损，其心脏异常的初发症状就是心肌变大。
心室肌细胞分泌的激素脑利钠肽(BNP)和心房利钠肽，又称心钠素(ANP)是心肌肥大的主要生化学指标。BNP主要存在于左心室。当心衰、低血压(心脏泵血功能差所致)、左心室肥大时，心脏释放BNP。ANP主要对细胞外液容量的变化作出快速反应。ANP合成后储存于心房肌细胞内，对刺激作出反应时，主要从储存池中释放出来，仅有少部分来源于新合成的激素。所以，ANP释放的调控主要在激素分泌水平，而且ANP的储存量往往在ANP mRNA转录激活前急剧减少。与ANP不同，BNP合成和分泌的调节主要在基因表达水平上进行。尽管BNP也存在于某些心房和心室肌细胞分泌颗粒中，但BNP mRNA转录速度要快得多。BNP的合成分泌呈现爆发式。病理状态下BNP主要来源于心室肌细胞，左心室收缩强度增加或容量负荷压力增大是BNP生成和释放的主要调节因素。
血管紧张素II(AngII)还可促进炎症因子的表达及细胞外基质集聚，从而在许多疾病的慢性进展中发挥重要作用。核因子KB(NF-KB)是一种与炎症因子的产生、细胞增殖、细胞外基质交联和细胞凋亡有关的转录因子，参与了多种炎症反应的信号转导过程。NF-κB是广泛存在于各种类型细胞中的一种转录因子.它调节大量与细胞应急反应，如免疫应答、炎症反应和细胞抗凋亡作用相关的基因的转录.NF-κB活化的失调与许多人类病症如类风湿性关节炎、癌症等直接相关，因此NF-κB激活的调节机理一直是细胞生物学及免疫学领域的研究热点.NF-κB通常与抑制因子IκBs相结合，以非活性形式存在于细胞质中，当细胞受到上游刺激因子如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素IL-6、细菌脂多糖等的作用时，IκB在激酶复合物IKK的作用下被磷酸化，进而被泛素连接酶复合物E3RSIκB/β-TrCP识别并泛素化，然后被26S蛋白酶体识别并迅速降解.IκB的降解使NF-κB的核定位序列暴露出来，进入核内起始转录。IKK的活化是NF-κB激活信号通路中的关键步骤，同时NF-κB的磷酸化、NF-κB前体的降解等也在其中发挥重要作用。
本发明所说的MR1(原命名为CR1)是由本实验室综合采用cDNA选择、EST定位、基因组DNA序列分析、PCR反应以及克隆末端延展等技术，以两个EST序列(AX014823)(AX013073)出发合成引物，从人骨骼肌cDNA文库中克隆得到编码为142个氨基酸蛋白的基因。研究证明，该基因主要表达于人体骨骼肌组织，也在心脏、肝脏、以及肾组织中存在，并和参与肌肉收缩的肌球蛋白重链myomesin 1(skelemin)、肌球蛋白调节轻链、肌肉纹状肌M带复合酶系的β-烯醇化酶等基因有相互作用。提示，MR1基因可在肌肉细胞重构和收缩单元中发挥重要的调控作用。研究还证明，MR1与含有Ras亚家族GTP酶蛋白存在相互作用，通过控制胞膜受体与信号途径之间的联系，调节细胞增殖与分化。该部分研究内容已申请“与细胞重构、传导及凋亡相关的CR1基因”的发明专利，并于2005年11月9日批准授权(专利号ZL02153656.2)。本实验室前曾采用RNA干扰技术，在细胞水平上证明，MR-1是通过AngII诱导，加剧心肌细胞肥大的(AmJPhysiol Heart Circ Physiol 2006，290279-285)。但是AngII在人体的作用是多方面的，MR-1作为一个新基因是如何通过AngII加剧心肌肥大的机理研究，迄今尚未见有相关报道。
本发明的目的是，在动物体内首先确证MR-1高表达加剧AngII诱导心肌肥大的作用，并通过研究MR-1基因高表达、低表达和AngII与核转录因子NF-κB诱导心肌肥大的关系，阐明MR-1在心肌肥大疾病中的作用，以便为心肌肥大的诊断与治疗寻找新的靶点和方法。

发明内容
本发明构建了MR-1转基因及高表达的小鼠，在动物体内通过血压和超声波心动描记实验，证明在AngII处理的转基因鼠中，心脏重量增加，左心室舒张术期直径、左心室横隔及左心室后壁也明显增加，同时，左室壁缩短率降低，心肌纤维化显著加剧，这些均为心肌肥大的征兆。这些均说明，MR-1基因在小鼠的高表达，明显加剧了AngII诱导转基因小鼠心肌肥大的症状。定量形态图象分析表明，转基因鼠经AngII处理后，心肌面积明显增大。采用蛋白印迹杂交检测证明，转基因小鼠由于心肌肥大，心肌负荷加大，其左心室利钠肽(ANP)和脑利钠肽(BNP)蛋白表达水平明显升高。利用凝胶迁移定量检测，证明转基因小鼠中转录调节核因子(NF-κB)活性明显提高。采用免疫复合激酶分析证明，NF-κB活性的升高与IKKβ激酶的活性有关。该激酶在NF-κB信号通路中，抑制蛋白IKBα特异性磷酸化酶，促进抑制蛋白IKBα的降解，是活化NF-κB因子的关键。本发明还证明，转基因小鼠心肌中伴有炎性细胞相关因子MCP-1、TNF-α、IL-6和心肌纤维化相关细胞外间质生成的转化生长因子TGF1-β1、TGF2-β3以及胶原质(collagen-I)的高表达。本发明还采用RNA干扰技术降低MR-1在心肌细胞中的表达，以减弱AngII对心肌中NF-κB信号通路的诱导。
发明效果本发明的积极效果在于动物体内实验证明了MR-1的高表达，加剧了AngII对心肌肥大、炎症及纤维化的作用，证明MR-1的作用机制是，通过对核因子NF-κB信号通路的调控，并确证MR-1通过加剧AngII对IKK激酶的诱导，促使NF-κB抑制蛋白的降解，从而激活NF-κB的信号通路。干扰MR-1的表达可以降低和削弱AngII对NF-κB的信号通路的诱导。本发明揭示，降低或阻断MR-1基因的表达，有望成为治疗心肌肥大相关疾病的新靶点。


图1-MR-1转基因小鼠尾血总DNA的PCR鉴定其中第74、75、79、83、84行为PCR阳性，证明MR-1基因已转入小鼠体内。其它行为PCR阴性，表明MR-1基因未进入小鼠体内。
图2-蛋白印迹杂交证明转基因小鼠中MR-1基因得到高表达其中WT1-3未转基因小鼠对照F1-4MR-1转基因小鼠；1-MR1；2-GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是一种管家基因，它在同种细胞或组织中的蛋白质表达量一般是恒定的。
图3-定量形态分析心肌细胞面积其中WT-未转基因小鼠对照；TG-转基因小鼠；1、2未经AngII处理假手术组，3，4经AngII处理实验组，纵坐标表示25个切片心肌细胞的总面积(微米平方)；*P＜0.01显著性分析，转基因小鼠与假手术的未转基因小鼠比较，§P＜0.01显著性分析，AngII处理的转基因小鼠与AngII处理未转基因小鼠比较。
图4-蛋白印迹杂交检测转基因小鼠左心室ANP和BNP蛋白的表达其中WT-未转基因小鼠对照；TG-转基因小鼠；1、2未经AngII处理假手术组，3，4经AngII处理实验组，*P＜0.01显著性分析，转基因小鼠与假手术的未转基因小鼠比较；§P＜0.01显著性分析，AngII处理的转基因小鼠与AngII处理未转基因小鼠比较。
图5-核因子(NF-κB)活性的检测其中WT-未转基因小鼠对照；TG-转基因小鼠；1、2未经AngII处理假手术组，3，4经AngII处理实验组；*P＜0.01显著性分析，转基因小鼠与假手术的未转基因小鼠比较；§P＜0.01显著性分析，AngII处理的转基因小鼠与AngII处理未转基因小鼠比较；纵坐标表示NF-κB与MR-1基因结合的百分数。
图6-转录调节核因子(NF-κB)激活蛋白IKKβ的活性检测其中WT-未转基因小鼠对照；TG-转基因小鼠；1、2未经AngII处理假手术组，3，4经AngII处理实验组；*P＜0.01显著性分析，转基因小鼠与假手术的未转基因小鼠比较；§P＜0.01显著性分析，AngII处理的转基因小鼠与AngII处理未转基因小鼠比较；纵坐标IKKβ的活性以％表示。
图7-转基因小鼠心肌炎性细胞因子表达的检测其中WT-未转基因小鼠对照；TG-转基因小鼠；1、2未经AngII处理假手术组，3，4经AngII处理实验组；*P＜0.01显著性分析，转基因小鼠与假手术的未转基因小鼠比较；§P＜0.01显著性分析，AngII处理的转基因小鼠与AngII处理未转基因小鼠比较。
图8-转基因小鼠心肌纤维化相关因子表达的检测其中WT-未转基因小鼠对照；TG-转基因小鼠；1、2未经AngII处理假手术组，3，4经AngII处理实验组；*P＜0.01显著性分析，转基因小鼠与假手术的未转基因小鼠比较；§P＜0.01显著性分析，AngII处理的转基因小鼠与AngII处理未转基因小鼠比较。
图9-RNA干扰MR-1基因表达后NF-κB活性的检测其中1-空白对照；2-pIRES2-GFP空载体；3-pIRES2-GFP空载体与AngII处理；4-pIRES2-GFP-hMR-1重组载体；5-pIRES2-GFP-hMR-1重组载体与AngII处理；6-RNA干扰腺病毒空载体；7-RNA干扰腺病毒空载体与AngII处理；8-RNA干扰腺病毒MR-1重组载体；9-RNA干扰腺病毒MR-1重组载体与AngII处理；纵坐标表示相对值。
实施方案下面给出一些实施例，目的仅仅在于更好地帮助了解本发明，而不是对本发明的限制。
<实施例1>MR-1转基因鼠模型的建立MR1基因的获得以人体骨骼肌cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，采用引物A和引物B进行PCR反应。
引物A5’-ATTAGAATTCATGGCGGCGGTGGTAGCTGCT-3’(EcoRI)引物B5’-ATTAGTCGACTCAGGTCTGCACCCCAGACCC-3’(SalI)获得的PCR产物，含有MR1基因，MR1基因是由425个核苷酸组成，编码142个氨基酸。将此片段以EcoRI和SalI酶切位点插入载体pIRES2-GFP(Clontech.公司)构建重组载体pIRES2-GFP-hMR-1。然后再用SphI将重组载体切为线形，经琼脂糖凝胶电泳回收4.8kb片段，通过Nuclespin柱(Clontech.公司)进行纯化。将此含MR1基因线形DNA片段通过显微注射技术注入小鼠受精卵300枚，得到108只新生小鼠。转基因动物CD-1/(ICR)BR远交系小鼠，引自美国CharlesRiver Laboratory(CRL)，购自北京大学医学部实验动物中心。
转基因鼠系的确定通过PCR方法进行鉴别。取小鼠尾血，提取总DNA用以上、下游引物进行PCR检测，PCR阳性小鼠F1代MR-1转基因小鼠，有3只雌鼠(74，75，79)、3只雄鼠(83，84，94)，将阳性转基因小鼠与正常小鼠进行交配，得到三个独立的转基因小鼠家系F2代。将得到的F2代小鼠进行转基因PCR鉴定，从47只F2代小鼠中鉴定出26只转基因小鼠，将F2代每一个家系的阳性转基因小鼠自身进行交配，繁育F3代。从得到的67只小鼠中鉴定出54只转基因阳性小鼠，然后再进行第4代交配，获得转基因纯合系小鼠。获得28只转MR-1基因小鼠，并对其进行了转基因小鼠尾血DNA的PCR鉴定(图1)。
<实施例2>转基因小鼠灌注血管紧张素AngII取14只转MR1基因小鼠和13个未转基因的小鼠作为对照。将AngII溶解在醋酸制成(0.001-0.005mol/l)溶液，以每天每公斤体重皮下注射0.1-0.3mgAngII的速度，灌注1-2周。另外还有14只转基因小鼠和13只未转基因小鼠作为假手术实验组进行对照。
<实施例3> 蛋白印迹杂交检测MR1在转基因小鼠中的高表达提取转基因小鼠心肌组织蛋白，约50微克在10％聚丙酰胺蛋白胶中电泳，转移至硝酸纤维膜，用MR1抗体(自制)和GAPDH抗体，作为内参(康成生物公司)杂交后，再用二抗过氧化酶偶联抗体显色，用化学发光试剂盒检测(Amersham，公司)。用蛋白印迹杂交的技术显示在转MR1基因小鼠中MR1基因得到了明显的高表达，而在对照鼠中MR1基因基本没有表达(图2)。
<实施例4>血压和超声波心动描记实验为了研究高表达MR1转基因鼠及经AngII处理后2周对小鼠心脏功能的变化，采用尾腕体积描记术(BP-2000 system；Visitech Systems，Apex，美国)和超声波心动描记术(Philips Electronics，Amsterdam，荷兰)来研究转基因鼠血压和心脏内部构造的变化，结果见表1。
表中数据*P＜0.05显著性分析，AngII处理的转基因鼠与AngII处理的未转基因小鼠的比较，P＜0.05显著性分析，AngII处理的转基因小鼠和未转基因小鼠假手术组的比较表1.转基因鼠心脏功能的变化

由表1数据可见，四个实验组的心率没有明显变化，未经AngII处理的转基因实验鼠与假手术组对照各项指标也无明显变化。但在AngII处理的转基因鼠中心脏重量增加，左心室舒张末期直径、左心室横隔及左心室后壁也明显增加，同时，左室壁缩短率降低，心肌纤维化显著加剧，这些均为心肌肥大的象症。这些均说明MR1基因在小鼠的高表达明显加剧了AngII诱导转基因小鼠心肌肥大的症状。
<实施例5>左心室组织心肌细胞面积的测定小鼠心脏取出后，去血在磷酸缓冲液中冲洗，并在60mM KCl浸泡后，称重，用4％的多聚甲醛固定，包埋在石腊中，液氮中切片并用苏木精和曙红染色，定量形态图象分析仪(IBAS2000型，OPTON公司，德国)测定心肌细胞面积。转基因鼠4个系左心室共进行25个切片的图像分析(图3)。结果表明，转基因鼠经AngII处理后心肌面积明显增大。
<实施例6>蛋白印迹杂交检测转基因小鼠左心室ANP和BNP蛋白表达水平提取转基因小鼠心肌组织蛋白，约50微克在10％聚丙酰胺蛋白胶中电泳，以GAPDH作为内参，蛋白电泳后，转移至硝酸纤维膜，分别用ANP、BNP和GAPDH抗体(康肽生物科技有限公司)杂交后，再用二抗过氧化酶偶联抗体显色，用化学发光试剂盒检测(Amersham，公司)。Alpha Imager 5500凝胶成像系统分析成像，以GAPDH内参灰度值比值进行定量分析(图4)。由图4可见在AngII处理的小鼠左心室的ANP和BNP均比假手术对照组的表达高，而转基因小鼠经AngII处理后两者，尤其是BNP的表达明显增高，说明转基因小鼠左心室肥大形成的负荷压力使BNP的表达很快升高。
<实施例7>凝胶迁移定量检测转录调节核因子(NF-κB)在转基因鼠的活性制备小鼠心肌组织核蛋白提取液。将心肌组织置于-70℃，在150mM NaCl，10mM Hepes，0.6％，0.2mM EDTA，0.5mM PMSF，pH7.9缓冲液，并置液氮中研碎，850rpm离心30秒，除去细胞碎片，上清3,500rpm离心10分钟，沉淀悬于25％甘油，20mM Hepes，0.5M NaCl，1mM MgCl2，0.2mM EDTA，0.5mM PMSF，pH7.9缓冲液中，在冰上保持30分钟，再14000rpm离心2分钟，收集上清保存于-70℃。蛋白含量用BCA(bicinchoninic acid)方法(PIERCE，美国)进行蛋白定量测定。按照Gel Shift Assay System E3300，Promega，美国公司说明，用32P-ATP(50,000cpm/ng)标记NF-κB保守序列(5-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’)片段。约500-2000ng蛋白与标记的NF-κB片段在4％甘油、1mMEDTA、10mMTris-HCl，pH7.5，10mMNaCl，0.1mg/ml牛血清蛋白BSA，室温中保温20分钟，在4-16％聚丙酰胺凝胶电泳后，干胶，用磷图象分析系统(phosphorimager)(Fuji公司，德国)进行定量分析，计算NF-κB与MR1蛋白结合量(图5)。由图5可见AngII处理后，尤其是转基因鼠中NF-κB与MR1蛋白结合明显增高。
<实施例8>转录调节核因子(NF-κB)激活蛋白IKKβ激酶活性的测定小鼠心肌细胞在25mmol/LTris-HCL(pH8.0)，150mmol/L NaCl，50mmol/Lβ-甘油磷酸，1mmol/L EDTA，10％甘油，1％Triton X-100，1mmol/L PMSF，0.2mg/mL亮抑肽酶，1mmol/L DTT缓冲液裂解，离心，用IKKβ抗体(Santa Cruz公司，德国)进行免疫沉淀4℃，2小时。沉淀物用Tris缓冲液洗涤后，在激酶缓冲液[25mmol/LHEPES(pH 7.5)，150mmol/L NaCl，25mmol/L β-甘油磷酸，10mmol/L MgCl2]加入GST-IKBα用5mCi32P-ATP标记30℃，20分钟，反应终止后在4-10％SDS-PAGE电泳，转硝酸纤维膜后，IKKβ激酶活性利用磷图像进行检测(Fuji公司，德国)。结果表明IKKβ激酶活性在转基因小鼠中明显增高(图6)。
<实施例9>转基因小鼠心肌炎性细胞因子表达的检测采用实施例6的蛋白印迹杂交实验方法，以核细胞趋化蛋白(MCP-1)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素IL-6抗体(康肽生物科技有限公司)作为一抗进行检测(图7)。表明转基因小鼠相关炎性细胞因子MCP-1、TNF-α和IL-6的表达均显著升高。
<实施例10>转基因小鼠心肌纤维化相关因子的检测采用实施例6的蛋白印迹杂交实验方法，检测了与心肌纤维化相关的细胞外间质生成的转化生长因子(TGF1-β1和TGF2-β3)以及胶原质(collagen-I)的表达(图8)，表明转基因小鼠心肌纤维化相关因子均明显增高。
<实施例11>RNA干扰MR-1基因表达后NF-κB活性的检测以MR-1mRNA结构设计合成靶序列，插入腺病毒质粒载体Ad，纯化，并进行包装(北方基因中心提供服务)，构建了RNA干扰腺病毒重组质粒Ad-MR-1。分离Wistar大鼠原代心肌细胞，在DMEM细胞培养液(GIBCO，公司)培养至细胞汇合度达到80％，随后采用脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen，公司)包裹质粒DNA方法进行转染，建立了AngII诱导MR-1基因低表达细胞，同时，设立对照组。以实施例7方法检测NF-κB的活性(图9)，表明MR-1基因表达被干扰后，AngII诱导NF-κB的活性明显降低。
权利要求
1.MR-1基因在心肌肥大中的调节功能及其检测方法，其特征是根据研究揭示的作用机理，构建MR-1高表达转基因小鼠模型或在心肌细胞降低MR-1的表达，经过血管紧张素AngII处理后，观察MR-1对小鼠心肌肥大、心肌纤维化、心肌细胞表面积增加、与心肌功能衰变相关的利钠肽含量的影响，并通过检测转录调节核因子NF-κB活性及其信号相关通路蛋白、炎症相关因子和心肌纤维化因子等方法，确定MR-1基因在心肌肥大中的作用。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是将MR-1基因构建在pIRES2-GFP等质粒载体，转入小鼠受精卵，获得转基因小鼠，并经AngII处理后，利用蛋白印迹杂交实验证明转基因小鼠中MR-1基因得到高表达，继而采用尾腕体积描记术和超声波心动描记术，确定转基因鼠血压升高和左心室明显肥大，并伴有心肌明显的纤维化。定量形态分析也表明MR-1高表达转基因小鼠的心肌细胞表面积明显增加。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是取AngII处理的MR-1高表达转基因小鼠心肌组织，经蛋白印迹分析，确证在心肌肥大状态下，所产生的心利钠肽ANP和脑利钠肽BNP明显增高。4.如权利要求1所述的方法，其特征是取AngII处理的MR-1高表达转基因小鼠心肌核蛋白，经凝胶迁移定量检测其转录调节核因子NF-κB活性的明显提高，而且，经免疫复合激酶分析证明，NF-κB抑制蛋白IKBα的降解，因磷酸化激酶IKKβ活性的升高而加剧。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是取AngII处理的MR-1高表达转基因小鼠，经蛋白印迹杂交实验，证明心肌组织中相关炎性细胞因子、核细胞趋化蛋白MCP-1、肿瘤坏死因子TNF-α和白细胞介素IL-6均有显著增高。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是取AngII处理的MR-1高表达转基因小鼠，经蛋白印迹杂交实验，证明其心肌组织中与心肌纤维化相关的转化生长因子TGF1-β1、TGF2-β3以及胶原质collagen-I的表达均有明显增高。
6.，如权利要求1所述的方法，其特征是根据研究揭示的作用机理，采用RNA干扰技术，构建RNA干扰腺病毒重组质粒Ad-MR-1及AngII诱导的MR-1基因低表达大鼠心肌细胞，经凝胶迁移定量检测，证明MR-1基因低表达的心肌细胞转录调节核因子NF-κB活性明显降低。
7.权利要求1、2、3、4、5或6所述方法在制备心肌肥大、心肌炎和心肌纤维化诊断/治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及人类基因功能，特别是涉及与心肌肥大相关的MR－1基因功能，动物体内实验证明了该基因的高表达，其加剧了AngII对心肌肥大、炎症及纤维化的作用，证明MR－1的作用机制是通过对核因子NF－κB信号通路的调控，干扰MR－1的表达可以降低和削弱AngII对NF－κB信号通路的诱导，说明降低或阻断MR－1基因的表达，有望成为治疗心肌肥大相关疾病的新靶点。
文档编号A61P9/00GK101020065SQ20071008715
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月23日 优先权日2007年3月23日
发明者王以光, 李洪亮, 李天伯, 折志刚, 戴文建, 刘德培, 孔维佳, 赫卫清, 左增艳, 蒋建东 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所