专利名称：Ckip-1蛋白及其编码基因的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种CKIP-I蛋白及其编码基因的新用途。
背景技术：
心血管疾病是危害人类健康的主要疾病之一，每年主要心血管病的医疗费用达1300亿元人民币，给社会造成巨大的经济负担。深入研究心血管疾病发病机制及分子机理并在此基础上建立新的防治策略和防治措施，降低心血管疾病的死亡率和致残率，是生命科学需要解决的重大基础科学问题。心肌细胞肥大是临床多种心血管疾病所伴有的病理改变，是心脏对生物机械牵张和神经体液刺激的一种主要反应。虽然早期心肌肥大是心脏维持有效心输出量的一种代偿性机制，但持久的心肌肥大会导致心脏进入失代偿阶段，胎儿期基因ANP，BNP, ^-MHC 等重新表达，继而发生不可逆转的心肌肥大和扩张，心肌收缩力下降，导致心力衰竭。触发心肌肥大的反应与多种信号通路的激活有关，包括钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶(Calcium calmodulin-dependent protein kinases, CaMK) / HDACs / MEF2,|丐调神经憐酸酶(Calcineurin),丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK),憐酸肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K),蛋白激酶 B (protein kinaseB, PKB)/AKT,哺乳动物雷帕霉素祀蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)和核因子-K B (nuclear factor kappa B,NF_kB)等。由此可见,心肌细胞肥大信号通路是一复杂的调控网络。寻找参与心肌肥大调控的新基因及信号通路是心血管领域的研究热点。贺福初实验室于1999年从人22周龄胎肝中克隆到CKIP-I基因，表达409个氨基酸组成的CKIP-I蛋白。CKIP-I蛋白N端含有一个PH (pleckstrin homology)结构域,通过结合磷脂介导了其质膜定位，C末端含有一个亮氨酸拉链,介导CKIP-I与c-Jun、JunD等AP-I家族成员的相互作用。Litchf ield实验室通过酵母双杂交筛选激酶CK2的结合蛋白时得到同一个基因，命名为酪蛋白激酶结合蛋白(casein kinase2_interacting protein-1,CKIP-I)。
发明内容
本发明的目的是提供一种CKIP-I蛋白及其编码基因的新用途。本发明提供了 CKIP-I蛋白、所述CKIP-I蛋白的编码基因或含有所述CKIP-I蛋白的编码基因的质粒在制备预防和/或治疗心肌肥大的药物中的应用；所述CKIP-I蛋白(ckip-1蛋白)如序列表的序列I所示。所述CKIP-I蛋白的编码基因(又称CKIP-I基因或ckip-1基因)为如下I)-4)中任一所述的DNA分子I)序列表中序列2自5’末端第43至1266位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)所不的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
4)与I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在0. I XSSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。含有所述CKIP-I蛋白的编码基因的质粒具体可为将所述CKIP-I蛋白的编码基因插入pJG/ALPHA MHC质粒得到的重组质粒。所述CKIP-I蛋白、所述CKIP-I蛋白的编码基因或含有所述CKIP-I蛋白的编码基因的质粒对心肌肥大的预防和/或治疗作用可体现为如下(a)至(e)中的至少一种(a)促使心肌细胞变小和心肌纤维化程度减弱；(b)降低心脏指数；(c)降低左心室指数；(d)降低心脏组织中胎儿期基因的表达水平；(e)增加左心室射血分数和心室短轴缩短率。本发明还提供了所述CKIP-I蛋白、所述CKIP-I蛋白的编码基因或含有所述CKIP-I蛋白的编码基因的质粒在制备产品中的应用；所述产品为具有如下(a)至(e)中的 至少一种功能的产品(a)促使心肌细胞变小和心肌纤维化程度减弱；(b)降低心脏指数；(c)降低左心室指数；(d)降低心脏组织中胎儿期基因的表达水平；(e)增加左心室射血分数和心室短轴缩短率。本发明还提供了用于抑制所述CKIP-I蛋白编码基因表达的物质在制备产品中的应用；所述产品为具有如下(I)至(4)中的至少一种功能的产品(1)制作心肌肥大动物模型；(2)促使心肌细胞变大和心肌纤维化发生；(3)增加心脏指数；(4)增加心脏组织中胎儿期基因的表达水平。以上任一所述胎儿期基因为ANF基因、BNP基因和P -MHC基因中的至少一种。本发明具有如下重大发现(I) CKIP-I基因敲除会导致自发性心肌肥大的发生，增加压力过负荷导致的心肌肥大的敏感性；(2) CKIP-I基因过表达能明显对抗由于压力过负荷导致的心肌功能的下降及心肌肥大的发生；(3) CKIP-I蛋白的作用机制是通过与HDAC4直接的相互作用实现的，二者的相互作用，可以促进HDAC4进入核内，抑制MEF2C的转录活性。本发明发现了 CKIP-I蛋白及其编码基因在心肌肥大疾病中的调节作用，以便为心肌肥大的诊断与治疗寻找新的靶点与方法，为寻求相关疾病的临床诊断和治疗奠定基础。本发明对于心肌肥大的治疗和预防具有重大价值。
图I为KO小鼠与WT小鼠心脏组织形态的变化。图2为KO小鼠与WT小鼠心脏重量与体重的比值变化。图3为KO小鼠与WT小鼠ANF基因、BNP基因和P -MHC基因表达的变化。图4为KO小鼠与WT小鼠中MEF2C转录抑制因子HDAC4在心肌细胞中定位的变化。图5为KO小鼠与WT小鼠中中，HDAC4磷酸化水平的变化。图6为在KO小鼠与WT小鼠中，Akt/mT0R/S6K磷酸化水平的比较。图7为KO小鼠与WT小鼠手术4周后心脏组织形态结构的变化。图8为KO小鼠与WT小鼠手术4周后心脏指数的变化。图9为KO小鼠与WT小鼠手术4周后ANF基因、BNP基因和P -MHC基因表达的变化。图10为KO小鼠与WT小鼠手术4周后心脏功能变化比较。图11为TG小鼠与WT小鼠手术4周后心脏组织形态结构的变化。图12为TG小鼠与WT小鼠手术4周后心脏指数的变化。图13为TG小鼠与WT小鼠手术4周后心脏组织中ANF、BNP和P -MHC表达的变化。图14为TG小鼠与WT小鼠手术4周后通过超声心动检测心脏功能的变化。图15为CKIP-I对心肌增强因子MEF2C转录活性的抑制作用。
图16为外源表达的CKIP-I对HDAC4在胞内定位的影响。
图17为实施例2的步骤三的2中的PCR扩增程序。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。C57/BL小鼠(又称野生型小鼠或WT小鼠，用WT表示)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级。ploxPI质粒和pBluescript SK(+)质粒参考文献(该文献同时也是详细描述打靶载体构建的文献)如下李力博士论文人胎肝来源PACT等重要功能基因的基因打靶，2005年，中国人民解放军军事医学科院。小鼠胚胎干细胞参考文献UL，DengB. Xing G. Teng Y. Tian C. Cheng X. YinX, YanR .I, Gao X，Zhu Y，Sun Q, ZhanR L, YanR X，He F. Proc Natl Acad Sci US A. PACTis a negative regulator of p53and essential for cell growth and embryonicdevelopment. 2007May 8;104(19):7951-6. Epub 2007Apr 30。pJG/ALPHA MHC 质粒参考文献Gulick J，Robbins J. Cell-type-specifictransgenesis in the mouse. Methods Mol Biol.2009;561:91—104.。CKIP-1 表达质粒(pCMV-Myc-CKIP-1 质粒)参考文献Lu K，Yin X，Weng T，XiS，Li L，Xing G，Cheng X，Yang X，Zhang L，He F.Target ing ww domains linkerof hect-type ubiquitin ligase smurfI for activation by ckip-1. Nat CellBiol.2008;10:994-1002。HDAC4 质粒(Flag-epitope-tagged HDAC4 质粒)参考文献Vega RB，MatsudaK，Oh J，Barbosa AC，Yang X, Meadows E, McAnally J, Pomajzl C，Shelton JMj RichardsonJAj Karsenty G，Olson EN. Hi stone deacetylase 4controls chondrocyte hypertrophyduring skeletogenesis. Cell. 2004Nov 12;119 (4):555-66。MEF2C 质粒(Myc-tagged MEF2C 质粒)参考文献Arnold MAj Kim Y，CzubrytMP，Phan D, McAnally J，Qi X，Shelton JMj Richardson JAj Bassel-Duby R，Olson EN. MEF2Ctranscription factor controls chondrocyte hypertrophy and bone development. DevCell. 2007Mar;12(3):377_89)。
pRL-TK 质粒购自 Promega 公司(E2241)。293T细胞购自协和医科大学基础医学细胞中心细胞库。C2C12细胞购自协和医科大学基础医学细胞中心细胞库。pEGFP_Nl_HDAC4 质粒参考文献Wang AH, Kruhlak MJ, Wu J, Bertos NR, VezmarM, Posner BI,Bazett-Jones DP,Yang XJ. Regulation of histone deacetylase 4bybinding of 14-3-3proteins. Mol Cell Biol. 2000S印；20 (18) : 6904-12.。pIRES-DsRed-CKIP-1 质粒参考文献Zhang L, Xing G, Tie Y, Tang Y, Tian C, LiL, Sun L,Wei H, Zhu Y, He F.Role for the pleckstrin homologydomain-containingprotein CKIP-1in AP-I regulation and apoptosis. EMBO J. 2005Feb 23;24(4):766-78.pIRES-DsRed 质粒和 pEGFP-Nl 质粒均购自 Clontech。
实施例I、CKIP-1基因敲除小鼠的获得一、CKIP-I基因敲除小鼠的获得I、打靶载体的构建小鼠CKIP-I 基因组为 GENBANK ACCESSION NO. 67220 (Gene ID: 67220, updatedon 11-May-2012)所示双链DNA分子。(I)用限制性内切酶NotI和XhoI双酶切小鼠CKIP-I基因组，回收约I. 4kb的片段(片段甲)。(2)用限制性内切酶NotI和XhoI双酶切ploxPI质粒，回收载体骨架。(3)将步骤(I)回收的片段和步骤(2)的载体骨架连接，得到重组质粒。(4)用限制性内切酶EcoR I和SspI双酶切小鼠CKIP-1基因组，回收约9. 6kb的片段。(5)用限制性内切酶EcoR I和SspI双酶切pBluescript SK(+)质粒，回收载体骨架。(6)将步骤(4)回收的片段和步骤(5)的载体骨架连接，得到重组质粒。(7)用限制性内切酶EcoRI和Clal双酶切步骤(6)得到的重组质粒，回收约9. 6kb的片段(片段乙)。(8)用限制性内切酶EcoRI和Clal双酶切步骤(3)得到的重组质粒，回收载体骨架。(9)将步骤(7)回收的片段和步骤(8)的载体骨架连接，得到打靶载体pTV-CKIP-1。打靶载体上的片段甲和片段乙可以和小鼠基因组DNA发生同源重组，从而敲除掉CKIP-I基因。2、将打靶载体转染入小鼠胚胎干细胞打靶载体经Not I线性化后，电转(600V，25 U F)入小鼠胚胎干细胞内。电转后24小时后用500 u g/ml G418和300 u g/ml潮霉素B筛选中靶细胞。利用G418筛选可以得到含有新霉素基因(neomycin)的胚胎干细胞，这种细胞发生了打靶载体的插入，但是G418筛选无法排除打靶载体随机整合入基因组进而获得抗性的细胞；潮霉素B则用来筛选不含有胸苷激酶(tk)的细胞，被杀死的细胞为打靶载体随机整合入基因组进而获得抗性的细胞。4、将中靶细胞进行囊胚注射，然后移植到WT小鼠雌鼠的胚胎，雌鼠生产的小鼠为CKIP-I的嵌合体小鼠(子一代)。5、将嵌合体小鼠与WT小鼠交配，得到的子代小鼠即为杂合子小鼠(子二代)。6、将杂合子小鼠交配，得到子代小鼠(子三代)。二、CKIP-I基因敲除小鼠的基因型鉴定分别将步骤一得到的每只子三代小鼠进行如下实验步骤I、提取小鼠鼠尾的基因组DNA。2、以步骤I提取的基因组DNA为模板，分别采用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增。如果采用引物对甲得到了约500bp的靶序列且采用引物对乙得到了约443bp的靶序列，待测小鼠的基因型为CKIP-1+/-。如果采用引物对甲得到了约500bp的靶序列且采用引物 对乙没有得到约443bp的靶序列，待测小鼠的基因型为CKIP-1-/-。如果采用引物对甲没有得到约500bp的靶序列且采用引物对乙得到了约443bp的靶序列，待测小鼠的基因型为CKIP-l+/+o引物对甲由引物KO-1和引物K0-2组成，用于鉴定敲除突变型小鼠，靶序列约500bp。引物对乙由引物WT-I和引物WT-2组成，用于鉴定野生型小鼠，靶序列约443bp。KO-I:5’-CCA GAC TGC CTT GGG AAA AGC GCC TCC CCT ACC-3'；K0-2 :5_Ttc ccc ctt tgt gaa gcc cca act ctt gac tc，_3，。WT-I5' -GTT CTG CTT TTG TCA CTA GAC ACT TGT TTT CTG CC-3’ ；WT-2 :5’-tgg ttt ccc ctc gga cct gta gga ag_3’ 。PCR 反应体系(15 ill):两条引物(0. Iii g/ill)各 0.5 iil，IOXBuffer I. 5u I,dNTP(2. 5mmol/L) I. l，Taq DNA polymerase (5U/y I) 0. 3 y I，基因组 DNA Iy UnddH2O补足到15iU。PCR 反应程序94°C 3min ；94°C lmin、61°C 50s,72°C lmin，循环 38 次；72°C 7min。选取基因型为CKIP-1-/-的小鼠，即为纯合型CKIP-I基因敲除小鼠(又称KO小鼠，用KO表不)。三、转空载体对照小鼠的获得用ploxPI质粒代替打靶载体进行步骤一的2，得到转空载体对照小鼠甲。实施例2、KO小鼠与WT小鼠的心脏形态和心脏功能等参数的比较一、心脏组织形态的变化分别取2个月(或8个月)的KO小鼠和WT小鼠的心脏，进行组织切片后利用HE染色、WGA染色和MTT染色检测心肌结构及纤维化程度。结果见图I。图IA为HE染色的照片，图IB为图IA的局部放大图，图IC为MTT染色的照片，图ID为WGA染色的照片。与WT小鼠相比，2个月时KO小鼠的心脏体积和心肌细胞明显增大，8个月时KO小鼠表现出心肌纤维化。转空载体对照小鼠甲的心脏形态变化与WT小鼠一致。二、心脏指数的变化取2个月的KO小鼠3只、8个月的KO小鼠3只、2个月的WT小鼠3只和8个月的
WT小鼠3只，称重(计量单位为g)，然后后取心脏并称取重量(计量单位为mg)，计算心脏指数，即心脏重量与体重的比值(mg/g)。结果见图2 (3只小鼠的平均值)，##P<0. 01。结果表明，与WT小鼠相比，KO小鼠心脏指数显著增大。转空载体对照小鼠甲的心脏指数与WT小鼠一致。三、心肌肥大相关基因的表达取2个月的KO小鼠3只、8个月的KO小鼠3只、2个月的WT小鼠3只和8个月的WT小鼠3只，分别进行如下步骤I、取心脏组织，并提取总RNA。2、以总RNA为模板，进行RT-PCR，检测各个胚胎期基因(ANP基因、BNP基因或3-MHC的表达)。RT-PCR 反应体系5XReaction buffer 5iil,底物 dNTP (10mmol /I ) 0. 5 U I,MgS04 (25mmol/l) I ii 1，AMV 反转录酶(5U/ii 1)0. l，Tfl DNA 聚合酶(5U/y I) 0. 5 y 1，上游引物(25pmol/iil)liil，下游引物(25pmol/iil)liil，总 RNA 约 lOOng，加去 RNase 水 M 25 u I0RT-PCR反应程序见图17。用于检测心钠肽基因(ANP基因)的引物对如下(靶序列为142bp)上游引物5’-ITCGGGGGTAGGAITGACAG-3’；下游引物5’-CACACCACAAGGGCTTAGGA-3’。用于检测脑钠肽基因(BNP基因)的引物对如下(靶序列为185bp)上游引物5’-TGTTTCTGCTTTTCCTTTATCTG-3’ ；下游引物5’ -Tctttttgggtgttcttttgtga-S'。用于检测肌球蛋白重链基因(P-MHC基因)的引物对如下(靶序列为IlObp)上游引物5’-TCCCCAACCGCAITCTCTAT-3’ ；下游引物5’ -CAGTITCTCAGCCCCTTTCC-3’。以相同月份的WT小鼠中基因的表达量为I，计算各个月份的KO小鼠的各个胚胎期基因的相对表达量，结果见图3。结果表明，与WT小鼠相比，2个月时KO小鼠的心脏组织中ANF基因、BNP基因和P -MHC基因的表达呈现升高的趋势，8个月时这种差异更加明显。转空载体对照小鼠甲各个基因的表达量与WT小鼠一致。四、心脏功能的超声心动检测取2个月的KO小鼠8只、8个月的KO小鼠4只、2个月的WT小鼠9只和8个月的WT小鼠5只，分别进行如下实验步骤小鼠腹腔注射水合氯醛(450mg/kg)，使用超声诊断仪(探头为15W，多普勒检测频率为14. 0MHz，试验中仪器增益固定为65dB，图像深度调至30mm，探头置于胸骨左侧，与胸骨中线成10° -30°，于左室长轴和短轴切面腱索水平行M型扫描)测量左室功能相关指标。结果见表I。表I心脏功能的超声心动检测结果(平均值土标准差)
权利要求
1.CKIP-I蛋白、所述CKIP-I蛋白的编码基因或含有所述CKIP-I蛋白的编码基因的质粒在制备预防和/或治疗心肌肥大的药物中的应用；所述CKIP-I蛋白如序列表的序列I所/Jn o
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述CKIP-I蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的DNA分子 1)序列表中序列2自5’末端第43至1266位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 4)与I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
3.如权利要求I或2所述的应用，其特征在于所述CKIP-I蛋白、所述CKIP-I蛋白的编码基因或含有所述CKIP-I蛋白的编码基因的质粒对心肌肥大的预防和/或治疗作用体现为如下(a)至(e)中的至少一种 Ca)促使心肌细胞变小和心肌纤维化程度减弱； (b)降低心脏指数； (c)降低左心室指数； Cd)降低心脏组织中胎儿期基因的表达水平； Ce)增加左心室射血分数和心室短轴缩短率。
4.CKIP-I蛋白、所述CKIP-I蛋白的编码基因或含有所述CKIP-I蛋白的编码基因的质粒在制备广品中的应用；所述CKIP-I蛋白如序列表的序列I所不；所述广品为具有如下(a)至(e)中的至少一种功能的产品 Ca)促使心肌细胞变小和心肌纤维化程度减弱； (b)降低心脏指数； (c)降低左心室指数； Cd)降低心脏组织中胎儿期基因的表达水平； Ce)增加左心室射血分数和心室短轴缩短率。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述CKIP-I蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的DNA分子 1)序列表中序列2自5’末端第43至1266位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 4)与I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
6.用于抑制CKIP-I蛋白的编码基因表达的物质在制备产品中的应用；所述CKIP-I蛋白如序列表的序列I所不；所述广品为具有如下(I)至(4)中的至少一种功能的广品 (1)制作心肌肥大动物模型； (2)促使心肌细胞变大和心肌纤维化发生； (3)增加心脏指数； (4)增加心脏组织中胎儿期基因的表达水平。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述CKIP-I蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2自5’末端第43至1266位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 4)与I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
全文摘要
本发明公开了一种CKIP-1蛋白及其编码基因的新用途。本发明提供了CKIP-1蛋白、所述CKIP-1蛋白的编码基因或含有所述CKIP-1蛋白的编码基因的质粒在制备预防和/或治疗心肌肥大的药物中的应用；所述CKIP-1蛋白如序列表的序列1所示。本发明发现了CKIP-1蛋白及其编码基因在心肌肥大疾病中的调节作用，以便为心肌肥大的诊断与治疗寻找新的靶点与方法，为寻求相关疾病的临床诊断和治疗奠定基础。本发明对于心肌肥大的治疗和预防具有重大价值。
文档编号A61K38/17GK102793910SQ20121018642
公开日2012年11月28日 申请日期2012年6月7日 优先权日2012年6月7日
发明者李英贤, 张令强, 贺福初, 孙乔, 凌树宽 申请人:中国航天员科研训练中心, 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所