Sh2b衔接蛋白1（sh2b1）在治疗心肌肥厚中的功能及应用的制作方法

Sh2b衔接蛋白1（sh2b1）在治疗心肌肥厚中的功能及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种SH2B衔接蛋白1（SH2B1）在治疗心肌肥厚中的功能及应用。本发明确定了SH2B1基因的表达与心肌肥厚之间的相互关系：心肌肥厚发生时SH2B1的表达明显上调；SH2B1的干扰和过表达腺病毒分别抑制和促进心肌细胞肥大；SH2B1基因缺陷和过表达分别抑制和显著上调Jak2/Stat3信号通路的激活，抑制和促进心肌肥厚、纤维化，保护和恶化心功能。因此，SH2B1基因可作为药物靶标用于在筛选保护心脏功能和/或预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物；SH2B1基因可作为基因治疗中的靶基因，用于设计和制备保护心脏功能和/或预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物，为心肌肥厚的治疗提供了新的途径。
【专利说明】SH2B衔接蛋白1 (SH2B1)在治疗心肌肥厚中的功能及应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种SH2B衔接蛋白1 (SH2B1)在治 疗心肌肥厚中的功能和应用，具体是在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚药物中的应用。

【背景技术】
[0002] 随着经济发展和生活水平的提高，心力衰竭在心血管事件的发生率和病死率中所 占的比例越来越高，是心肌肥厚最常见的并发症，是一种心脏舒缩功能不全而无法满足机 体代谢需要的复杂的综合征，它是当今人类主要死因之一。目前研究的重点在于心脏的左 室肥厚性重构，是当前公认的心血管疾病死亡率危险因素。心肌肥厚是心脏对许多外来刺 激如：高血压、瓣膜性心脏病、心肌梗死和心肌病等的一种适应性反应，是心脏负荷增加时 室壁应力正常化的一种适应性改变。虽然这个过程是对心脏增加作功的一种代偿，但长期 如此会导致心力衰竭、心律失常和猝死。心肌肥厚的特征是心肌细胞体积增大、蛋白质合 成增加及肌纤维增多。目前关于心肌肥厚发生的分子机制研究众多，主要有：1、神经钙蛋 白-NFAT信号通路。2、P13K/AKT/GSK-3依赖信号通路。3、MEF2/HPAC对心肌肥大的转录调 控。4、G蛋白复合受体的肥大信号通路。5、小G蛋白与肌原纤维信号通路。6、MPK信号通 路。7、PKC信号通路。8、GP130/STAT3信号通路。9、脂质代谢障碍机制。10、MMP/TNF机制 等。然而，现有的研究并不能完全诠释心肌肥厚的发生机制。因此需要寻找新的治疗方法， 特别是药物治疗方法来提高心衰病人的生存率和生活质量，更好地解释心肌肥厚的发生机 制是通向这一目标的关键因素。
[0003] SH2B1是SH2B家族的成员，SH2B是一类含有SH2和PH结构域的信号接头蛋白， 在生长发育、代谢平衡和免疫调节等诸多方面发挥着重要的调控作用。SH2B1基因长约6. 1 kb，它编码的蛋白质包含有SH2和PH结构域。SH2B1是SH2B信号蛋白家族（SH2-B、APS、 LNK)的新成员，与适配子蛋白APS和LNK组成一个新的适配子家族。SH2B、APS、LNK现在分 别被命名为SH2B1、SH2B2、SH2B3。SH2B1是酪氨酸激酶受体A (TrkA)与细胞膜相连的结合 蛋白，属保守的接头蛋白，主要介导含有酪氨酸磷酸化的信号转导途径。SH2B1是采用双酵 母杂交筛选系统分离鉴定得出，存在于大量的组织和细胞中，包括下丘脑、肝脏、肌肉、脂肪 组织、心脏、膜脏等【1，2】。有研究表明SH2B1是体重调节系统的关键蛋白，在调控脂肪储 存、糖的使用、能量平衡和体重的众多信号分子中它作为一个关键蛋白起作用。利用多种遗 传、饮食和激素技术发现SH2B1能调节代谢信号分子瘦素（leptin)和胰岛素（insulin)活 性、调节来自食物的能量利用，调节身体体重。
[0004] 转录因子 STAT (signal transducer and activator of transcription)被称之 为信号转导子和转录激活子，在细胞因子-受体相互作用的过程中充当载体，保持信号在 细胞内传递的内在特异性，它在信号转导和转录激活上发挥了关键性的作用，在细胞的生 长、凋亡过程中发挥重要的作用。目前已发现的STAT家族有STAT1-6共6个成员，它们在 结构上都有共同的特性，由7个不同的功能结构域组成。STAT可以通过SH2结构域识别磷 酸化的受体，然后STAT也发生磷酸化，形成二聚体进入胞核，它作为有活性的转录因子，影 响相关基因的表达。
[0005] 关于Jak/Stat信号转导途径已经有较多的研究报道，已有研究表明Jak2/Stat3 信号通路在缺血性脑损伤、心肌梗死、骨骼发育、能量代谢、癌症、血管重构等病理过程中发 挥重要的作用。丹参水提物预处理对缺血再灌注损伤的大鼠心肌细胞有很好的保护作用， 可减少其氧化损伤、提高免疫功能，减少心肌细胞凋亡，该作用是通过激活JAK2/STAT3信 号通路【3】;激活JAK2/STAT3信号通路，显著保护缺血再灌注引起的大脑及神经元损伤【4， 5】；在体内/体外实验中已经证实，抑制JAK2/STAT3信号通路，可减少胃癌肿瘤细胞生长 【6】;在卵巢癌中，抑制JAK2/STAT3信号通路可抑制肿瘤干细胞，降低肿瘤负荷【7】;丹参酮 IIA通过减少JAK2/STAT3信号通路分子的磷酸化水平，从而促进缺氧肺动脉平滑肌细胞的 凋亡，逆转血管重构【8】。
[0006] 【参考文献】： 1、 Li Y， et al. Cloning and characterization of human Lnk, an adaptor protein with pleckstrin homology and Src homology 2 domains that can inhibit T cell activation. J Immunol (2000). 164(10):5199 - 5206 2、 Takaki S，et al. Control of B cell production by the adaptor protein Ink. Definition of a conserved family of signal-modulating proteins. Immunity. 13(5):599 - 609 3、 Ge G， et al. Protective effect of Salvia mi Itiorrhiza aqueous extract on myocardium oxidative injury in ischemic-reperfusion rats. Gene. 2014;546(1):97-103 4、 Liu et al. Diosmin protects against cerebral ischemia/reperfusion injury through activating JAK2/STAT3 signal pathway in mice. X. Neuroscience, 2014， 268:318-27 5、 Haibo Zhu et al. SMND-309，a novel derivative of salvianolic acid B， protects rat brains ischemia and reperfusion injury by targeting the JAK2/STAT3 pathway. European Journal of Pharmacology. 2013 ， 714(1-3):23-31 6λ Judd LM et al. Inhibition of the JAK2/STAT3 Pathway Reduces Gastric Cancer Growth In Vitro and In Vivo. PLoS One. 2014;9(5) :e95993 7、 Abubaker K et al. Inhibition of the JAK2/STAT3 pathway in ovarian cancer results in the loss of cancer stem cell-like characteristics and a reduced tumor burden. BMC Cancer. 2014:10.1186/1471-2407-14-317 8、 Chen M et al· Tanshinone IIA promotes pulmonary artery smooth muscle cell apoptosis in vitro by inhibiting the JAK2/STAT3signaling pathway. Cell Physiol Biochem. 2014:33(4):1130-8。


【发明内容】

[0007] 为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于确定SH2B1的表达和心肌 肥厚的相互关系，提供一种SH2B1作为药物靶标在筛选保护心脏功能和/或预防、缓解和/ 治疗心肌肥厚的药物中的应用，提供一个用于保护心脏功能和/或预防、缓解和/或治疗心 肌肥厚的靶基因 SH2B1的新用途。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现： 本发明首先通过试验确定SH2B1表达与心肌肥厚之间的关系： 1、在发生心肌肥厚的情况下，SH2B1的表达明显上调 本发明选用正常人和扩张型心肌病、肥厚性心肌病患者以及正常小鼠和发生心肌肥厚 小鼠的心脏，对心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Western blot)，结合特异 性识别SH2B1蛋白和心肌细胞肥大标志物ΑΝΡ、β -MHC的抗体进行检测，测定其SH2B1的表 达。结果表明，在人和小鼠发生肥厚的心脏中，心肌细胞肥大标志物ΑΝΡ、β-MHC的表达明 显上调，SH2B1的表达也明显上调（图1、图2)。
[0009] 2、SH2B1的干扰腺病毒抑制心肌细胞肥大；SH2B1的过表达腺病毒促进心肌细胞 肥大 本发明通过在体外分离、培养了 SD乳鼠心肌细胞，并构建SH2B1干扰（Adsh SH2B1)及 过表达（Ad SH2B1)腺病毒，通过结合Ang II刺激模拟心肌细胞肥大模型，研究SH2B1对心 肌细胞肥大的影响。通过在荧光显微镜下观察到Ang II刺激后心肌细胞明显大于PBS组， Ang II刺激后SH2B1干扰腺病毒的心肌细胞肥大程度明显被抑制，而SH2B1过表达腺病毒的 心肌细胞肥大则显著增加（图3)。
[0010] 3、SH2B1基因敲除显著抑制了心肌肥厚、纤维化的程度，保护心功能；SH2B1基因 过表达显著促进了心肌肥厚及其纤维化的程度，恶化心功能 本发明选用野生型小鼠、SH2B1基因敲除小鼠及心脏特异性SH2B1转基因小鼠和非转 基因小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主 动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠 进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究SH2B1基因敲除/过表达对主动脉弓缩窄 诱导的心肌肥厚的影响。结果表明敲除SH2B1基因所致的SH2B1缺陷显著抑制心肌肥厚、 纤维化，保护心功能；过表达SH2B1基因显著恶化心肌肥厚、纤维化以及心功能（图4-11)。
[0011] 4、SH2B1基因敲除抑制激活Jak2/ Stat3信号通路；SH2B1基因过表达促进激活 Jak2/ Stat3信号通路 本发明用野生型小鼠、SH2B1基因敲除小鼠及心脏特异性SH2B1转基因小鼠和非转基 因小鼠分别进行假手术和主动脉弓缩窄手术，然后在术后4周对各组小鼠心脏提取蛋白质 进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Western blot)，结果显示敲除SH2B1基因所致的SH2B1缺 陷显著抑制Jak2/Stat3信号通路的激活，SH2B1基因过表达促进Jak2/Stat3信号通路的 激活（图12,图13)。
[0012] 由以上结果可知发生心肌肥厚时，SH2B1表达上调，SH2B1基因缺陷抑制Jak2/ Stat3信号通路的激活，抑制了心肌肥厚及其纤维化，保护心功能，SH2B1基因过表达促进 Jak2/Stat3信号通路的激活，显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能。因此，SH2B1基因 可作为药物靶点，构建SH2B1基因过表达的体外细胞模型或动物模型，用于筛选预防、缓解 和/或治疗心肌肥厚疾病的药物；SH2B1基因也可作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预 防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物和/或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解 和/或治疗心肌肥厚的目的。例如以SH2B1为靶基因，设计可干扰SH2B1表达的双链siRNA， 通过化学方法合成以后，注射入人体通过RNA干扰的方法使SH2B1基因沉默来治疗心肌肥 厚疾病；还可以设计并构建SH2B1的突变体，注射后进入细胞，竞争SH2B1原形的作用底物， 从而抑制SH2B1的功能，起到治疗目的；此外，还可以以SH2B1为靶点设计小分子化合物抑 制剂，利用SH2B1基因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选，发现其中能够特异性 抑制SH2B1的分子，从而为心肌肥厚疾病的治疗提供新的治疗性分子。
[0013] 针对SH2B1的上述功能，提供SH2B1作为药物靶标在筛选保护心脏功能和预防、缓 解和/或治疗心肌肥厚的药物中的应用。
[0014] 针对SH2B1的上述功能，提供SH2B1的抑制剂在制备保护心脏功能和预防、缓解和 /或治疗心肌肥厚的药物中的应用。
[0015] 一种保护心脏功能的药物，包含SH2B1的抑制剂。
[0016] 一种预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，包含SH2B1的抑制剂。
[0017] 所述的SH2B1的抑制剂优选为SH2B1基因的siRNA、SH2B1基因的RNA干扰载体， SH2B1的抗体及其他能够抑制SH2B1表达的抑制剂中的一种。
[0018] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： (1)本发明发现了 SH2B1基因的新功能，即SH2B1能够恶化心脏功能和促进心肌肥厚的 作用。
[0019] (2)基于SH2B1在恶化心脏功能和促进心肌肥厚中的功能，为研制心肌肥厚的药 物提供靶标。
[0020] (3)SH2B1的抑制剂可用于制备保护心脏功能和预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的 药物。

【专利附图】

【附图说明】
[0021] 图1是正常人和心肌病患者心脏中ΑΝΡ、β -MHC、SH2B1的蛋白表达情况；A是正常 人和扩张型心肌病患者心脏中ΑΝΡ、β -MHC、SH2B1的表达，心肌病患者心脏SH2B1的表达上 调（* :p < 0. 05 vs正常人组）；B是正常人和肥厚性心肌病患者心脏中ΑΝΡ、β -MHC、SH2B1 的表达，心肌病患者心脏SH2B1的表达上调（* :ρ < 0. 05 vs正常组)。
[0022] 图2是小鼠在假手术（Sham)和主动脉弓缩窄手术（AB)后心脏中ANP、β-MHC、 SH2B1的表达，说明发生心肌肥厚的心脏SH2B1的表达上调；其中4W表示4周，8W表示8周 (* :p < 0· 05 vs野生型小鼠 Sham组）。
[0023] 图3是SD乳鼠原代心肌细胞用腺病毒AdshRNA、Adsh SH2Bl、Ad-GFP和Ad SH2B1 感染，经Ang II刺激后的免疫荧光图，结果表明SH2B1的干扰腺病毒抑制心肌细胞肥大， SH2B1的过表达腺病毒促进心肌细胞肥大（* :p < (λ 05 vs PBS组，# :p < (λ 05 vs Ang II 组)。
[0024] 图 4 是 SH2B1+/+ 和 SH2B1-/-小鼠 AB 模型 4 周后 HW/BW、LW/BW 及 HW/TL 的统计 柱状图（* :p < 0. 05 vs野生型Sham组，# :p < 0. 05 vs野生型AB组）。
[0025] 图5是SH2B1+/+和SH2B1-/-小鼠 AB模型4周后心脏组织HE染色及心肌细胞横 截面积统计柱状图（* :p < 0· 05 vs野生型Sham组，# p < 0· 05 vs野生型AB组)。
[0026] 图6是SH2B1+/+和SH2B1-/-小鼠 AB模型4周后心脏组织天狼星红染色及左室 胶原面积统计柱状图（* :p < 0. 05 vs野生型Sham组，# :p < 0. 05 vs野生型AB组)。
[0027] 图7是NTG和TG小鼠 AB模型4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图（* :p < 0· 05 vs NTG Sham 组，# :p < 0· 05 vs NTG AB 组）。
[0028] 图8是NTG和TG小鼠 AB模型4周后心脏组织HE染色及心肌细胞横截面积统计 柱状图（* :P < 〇· 05 vs NTG Sham 组，# :p < 0· 05 vs NTG AB 组）。
[0029] 图9是NTG和TG小鼠 AB模型4周后心脏组织天狼星红染色及左室胶原面积统计 柱状图（* Φ < 〇· 05 vs NTG Sham 组，# :p < 0· 05 vs NTG AB 组）。
[0030] 图10是SH2B1+/+和SH2B1-/-小鼠 AB模型4周后心功能检测结果。A是超声检 测心功能结果统计柱状图；B是血流动力学检测心功能结果统计柱状图，其中，LVEDD为左 室舒张末期内径、LVESD为左室收缩末期内径、FS为短轴缩短率、EF为射血分数、dP/dt max 为左室内压最大上升速率及dP/dt min为左室内压最小上升速率（*:p< 0.05 vs野生型 Sham 组，# :p < 0· 05 vs 野生型 AB 组）。
[0031] 图11是NTG和TG小鼠 AB模型4周后心功能检测结果。A是超声检测心功能结 果统计柱状图；B是血流动力学检测心功能结果统计柱状图，其中，LVEDD为左室舒张末期 内径、LVESD为左室收缩末期内径、FS为短轴缩短率、EF为射血分数、dP/dt max为左室内 压最大上升速率及dP/dt min为左室内压最小上升速率（* :p < 0. 05 vs NTG Sham组，# : p < 0· 05 vs NTG AB 组）。
[0032] 图 12 是 SH2B1+/+ 和 SH2B1-/-小鼠 Sham 及 AB 模型 4 周时 Jak2/ Stat3 信号通 路Western blot检测图，结果显示SH2B1敲除会降低Jak2和Stat3的磷酸化激活水平； 其中"P-"代表磷酸化的激酶（Jak2和Stat3)，"T-"代表总的(磷酸化的和未磷酸化的）激 酶（Jak2 和 Stat3)，GAPDH 用作内参（*:p<(X05 vs 野生型 Sham 组，#:p<(X05 vs 野生 型ΑΒ组）。
[0033] 图13是NTG和TG小鼠 Sham及ΑΒ模型4周时Jak2/ Stat3信号通路Western blot检测图，结果显示SH2B1过表达会促进Jak2和Stat3的磷酸化激活水平；其中"p-" 代表磷酸化的激酶（Jak2和Stat3)，"T-"代表总的(磷酸化的和未磷酸化的）激酶（Jak2和 Stat3)，GAPDH 用作内参（* :p < 0· 05 vs NTG Sham 组，# :p < 0· 05 vs NTG AB 组）。

【具体实施方式】
[0034] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0035] 实验用动物及饲养 实验动物：选用8-10周龄、体重在23. 5-27. 5g，背景为雄性C57BL/6的心脏特异性Cre 小鼠（野生型小鼠 α-MHC-Cre (命名 SH2B1+/+)，购自 Jackson Laboratory，货号 005650)、 SH2B1基因敲除小鼠（SH2B1-/-，购自日本RIKEN公司，货号：RIKEN00994)、心脏特异性 SH2B1转基因小鼠（TG，心脏特异性SH2B1转基因小鼠由武汉大学心血管病研究所李红良教 授实验室构建）及非转基因小鼠（NTG，同窝对照非转基因小鼠）为实验对象。
[0036] 心脏特异性SH2B1转基因小鼠的构建： 用引物（上游引物：GTTGTCGACGCCACCATGAATGGTGCCCCTTCCCC ;下游引物： GCCAAGCTTACACAGTCACTCGCTCCG)扩增小鼠 SH2B1 全长基因（NCBI，Gene ID :20399， XM_006507481. 1)，把扩增的SH2B1全长基因连接于心肌肌球蛋白重链（α-MHC)启动 子下游，将构建的序列通过显微注射构造成受精胚胎（C57BL/6J背景)，得到心脏特异性 SH2B1转基因老鼠。（上述的转基因小鼠参照下述文献制备Jiang DS，Bian ZY，Zhang Υ，Zhang SM，Liu Y，Zhang R et al. Role of interferon regulatory factor 4 in the regulation of pathological cardiac hypertrophy. Hypertension 2013; 61:1193-1202.) 饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级实验动物中心。SRF 级大小鼠饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。饲养条件：室温在22-24°C之间，湿度在 40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。
[0037] 实施例1 SH2B1在正常人和心肌病患者心脏中的表达 选用正常人心脏(非心脏原因的死亡捐献的个体)、扩张型心肌病患者心脏(做心脏移 植手术病人置换的受体，DCM)和肥厚性心肌病患者心脏(做心脏移植手术病人置换的受 体，HCM)，对心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Western blot)，结合特异性 识 SH2B1 (R&D，AF6915)蛋白和心肌细胞肥大标志物 ANP (Millipore，AB2232)、β-MHC (santa cruz，sc53090)的抗体进行检测，测定其 SH2B1 的表达，GAPDH (Cell Signaling Technology, 2118)做内参。检测结果如图1所示，与正常人心脏相比，心肌病患者心脏心肌 细胞肥大标志物ΑΝΡ、β -MHC的表达明显上调，SH2B1的表达也明显上调。
[0038] 实施例2 SH2B1在野生型小鼠 Sham组和ΑΒ手术4W、8W心脏中的表达 1.心肌肥厚模型采用主动脉弓缩窄手术，模型操作流程： 1. 1术前准备 (1)麻醉：先给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药（3%戊巴比妥钠）量，通过腹 腔注射，并记录注射时间点。夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准(一般 注射后约l〇min无明显反应，以麻醉后约50min小鼠夹趾有反应，麻醉后30min左右为最佳 手术时间）。
[0039] (2)术区准备：将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢腋下的皮肤去毛。剃毛后用湿纱 布擦拭术区去除鼠毛，以不影响手术视野为宜。
[0040] (3)气管插管：用橡皮筋将小鼠上门齿固定于V形板斜面上，并迅速将气管插管经 声门准确插入气管内，随后右侧卧位置于加热垫上(加热垫需提前预热)，然后将气管插管 与呼吸机连接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。
[0041] 1.2主动脉弓缩窄术 取右侧卧位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用医用胶带将两前肢固定。右胸部下方垫 入棉签，抬高胸廓，依次用碘酒及体积分数为75%酒精对手术区域皮肤消毒。左手持眼科镊 将左胸部皮肤捏起，右手持眼科剪剪开皮肤约lcm，依次分离肌肉及软组织，于第2-3肋水 平打开胸腔，用棉签稍拨开左肺，游离主动脉弓降支，将7-0手术缝线穿过血管，并在血管 上方平行放置一段26G (25. 0-27. 5g小鼠）或者27G (23. 5-25. 0g)注射器针头，将血管及 针头一起结扎好，再抽出针头即可达到相应程度的血管缩窄。结扎完毕后依次缝合，关闭胸 腔，用注射器从缝口处插入胸腔并抽出lcc气体以恢复胸腔内负压，拔出注射器后迅速缝 合皮肤切口。假手术组（Sham)在游离出主动脉降支后只穿线不结扎，其余步骤同心肌肥厚 (AB)模型组。
[0042] 1.3术后护理 主动脉弓降支结扎术后，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插管，并 将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。
[0043] 2.取材：打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。眼科弯镊夹住心耳下方的 血管蒂，剪下心脏，迅速置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记 录，将心脏放入相应的冻存管中，迅速置于液氮罐中，于_80°C冰箱保存后用于分子生物学 检测。
[0044] 3. SH2B1在Sham小鼠和AB小鼠心脏中的表达 分别选野生型Sham小鼠和AB手术后4周及8周的心脏，对心脏提取蛋白质进行 SDS-PAGE-免疫印迹试验（Western blot)，结合特异性识别SH2B1蛋白及心肌细胞肥大标 志物ΑΝΡ、β -MHC的抗体进行检测，测定其SH2B1的表达，检测结果如图2所示，心肌细胞肥 大标志物在ΑΒ术后ΑΝΡ、β -MHC的表达明显上调，SH2B1的表达在ΑΒ术后明显上调。
[0045] 实施例3 SH2B1干扰（Adsh SH2B1)及过表达（Ad SH2B1)腺病毒对Ang II刺激的 原代心肌细胞SH2B1表达的影响 1.原代新生SD大鼠心肌细胞培养 (1)新生1天Sprague-Dawley乳鼠8只，颈部以下75%酒精消毒，用眼科剪和显微镊取 下心脏，放入盛有10mL DMEM/F12液的玻璃平皿中。再取另一只，重复以上过程。
[0046] (2)用DMEM/F12培养基清洗心脏，并将心脏剪成l-2mm3的碎片。转入到放有转子 的血清瓶中，吸去DMEM/F12,加入胰酶消化液。转速为120r/min，消化15min，静止数秒钟， 弃去上清液。
[0047] (3)加入胰酶消化液，转速为120r/min，消化15min。静止数秒钟，吸取上清液，用 20%小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，并置于4°C冰箱保存。重复该步骤，循环若干次。 取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。
[0048] (4)将收集好的心肌细胞悬液，以1500rpm转速离心8min，弃去上清液。在离心管 中加入适量培养基，轻柔吹打重悬细胞，集中至1个50mL离心管中，细胞悬液用细胞40 μ m 过滤网过滤。
[0049] (5)将细胞接种在100mm的培养皿中，差时贴壁90min，吸取未贴壁的细胞悬液过 滤。根据细胞悬液的总量加入Brdu (终浓度0. ImM)，混匀之后，加入到用0. 1%明胶包被的 器皿中。
[0050] (6)轻摇分散细胞，勿漩涡摇晃。37°C、5% C02孵育48小时用PBS清洗1次，更换 培养基。
[0051] 2. SH2B1干扰（Adsh SH2B1)及过表达（Ad SH2B1)腺病毒对经Ang II诱导的心 肌细胞肥大模型的影响 AdshRNA (含 shRNA (沉默 RNA)的腺病毒，用作对照，SABIOSCIENCES 公司）、Adsh SH2B1 (含shRNA- SH2B1 (沉默RNA- SH2B1融合蛋白）的腺病毒，购自SABIOSCIENCES公司，货号 KR45212G)、AdGFP (含GFP (绿色荧光蛋白）的腺病毒，用作对照，购自Vector Biolabs公 司，货号1060)及Ad SH2B1腺病毒(含GFP-SH2B1绿色荧光蛋白-SH2B1融合蛋白）的腺 病毒，购自Vector Biolabs公司，货号ADV-271872) 10 MOIs分别感染培养3天的原代心 肌细胞，12小时后用1 μ Μ血管紧张素 II (Ang II )(购自Sigma公司，A9525)或对照PBS刺 激48小时，然后进行免疫荧光试验。结果表明Adsh SH2B1腺病毒感染后的心肌细胞表面 面积较AdshRNA对照组减少，而经Ad SH2B1感染的心肌细胞表面面积则比对照组AdGFP明 显增加（图3)。说明SH2B1的干扰腺病毒抑制心肌细胞肥大；SH2B1的过表达腺病毒促进心 肌细胞肥大。
[0052] 实施例4小鼠心肌肥厚（AB)模型心肌肥厚及纤维化检测 1.心肌肥厚模型采用主动脉弓缩窄手术，模型操作流程： 选用8-10周龄、体重在23. 5-27. 5g的野生型小鼠、SH2B1基因敲除小鼠、心脏特异性 SH2B1转基因小鼠及非转基因小鼠各分成假手术组和心肌肥厚模型组，每组10只小鼠。造 模方法同实施例2。
[0053] 2.取材 (1)前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10%甲醛的尿杯，并贴好标签(小鼠编号、 组别、手术类型及取材日期)。将倒满质量分数10% KC1溶液的培养皿置于取材处。打开分 析天平，调零备用。再称重处死小鼠。
[0054] (2)取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10% KC1 溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后， 称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。
[0055] (3)相关测量及计算：取出小鼠肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后 肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值（HW/BW)，肺重与体重的比值 (LW/BW)以及心重与胫骨长度的比值（HW/TL)。
[0056] 3.病理学检测 3. 1制备石錯标本切片 主要操作程序包括修剪心脏一包埋框处理一流水冲洗一脱水一透明一浸蜡一包埋一 切片一摊片一晾干或烘烤后备用。
[0057] 3.2苏木精-伊红（HE)染色 主要步骤为：55 °C烘烤30min -二甲苯5min，3次一100%酒精lmin - 95%酒精 lmin - 70%酒精lmin -双蒸水lmin -苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021) 5min -水 洗lmin - 1%盐酸酒精(取3mL浓盐酸与297mL 70%酒精充分混合均匀）l-3s -水洗 lmin - Scott液(碳酸氢钠0. 35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馈水）lmin -水洗 lmin -伊红溶液(珠海贝索，BA-4024) 3_5min -蒸馈水洗去浮色一70%酒精Is - 95%酒 精Is - 100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即封片一通风橱内吹干， 显微镜拍照。
[0058] HE染色图片统计：每张图片选择3个以上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用 Image-Pro Plus 6. 0软件圈细胞面积。
[0059] 3. 3天狼星红（PSR)染色 主要步骤为：55 °C烘烤30min -二甲苯2min，3次一100%酒精lmin - 95%酒 精lmin - 70%酒精lmin -流水冲洗lOmin -双蒸水lmin -质量分数0. 2%磷钥酸 2min - 0. 1%天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min -去除残液一0. 01N盐 酸4s - 70%酒精1次一90%酒精1次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲 苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。
[0060] PSR染色图片统计（Image-Pro Plus 6. 0软件):胶原比例=胶原面积/(总面积-空 白面积）X 1〇〇%。
[0061] 心肌组织由心肌细胞和间质组织组成，心脏是一终末分化器官，心肌细胞失去增 殖能力，各种生理或病理性刺激引起的心肌细胞反应，只能是单个细胞的体积增大而不能 在数量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理过程中，主要表现为心肌细胞体积增大，肌节 数量增多，细胞排列紊乱，心脏间质改变包括心肌成纤维细胞的增殖与转化，胶原纤维密度 增加，胶原分泌增加，胶原比例平衡失调等。
[0062] SH2B1+/+和SH2B1-/-小鼠 AB模型后的表型结果见图4-6。Sham (假手术）组 中SH2B1+/+小鼠和SH2B1-/-小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之间的差异均无统计学意义； SH2B1+/+ 小鼠 AB 术后 4 周的 HW/BW、LW/BW、HW/TL 高于其 Sham 组；AB 术后 4 周，SH2B1-/-小 鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均较SH2B1+/+小鼠降低（图4)。HE染色切片可观察到：Sham组 心脏无明显差异，AB组较Sham组的心脏均增大，SH2B1-/-小鼠的心脏明显小于SH2B1+/+ 组小鼠；Sham组心肌肌原纤维细胞排列整齐、致密，形态完整，胞核及核仁结构清晰；AB组 肌丝排列紊乱、松散，心肌细胞体积明显增大，形态不规整，胞核深染、增大、畸形，核仁模 糊，SH2B1-/-组则无 SH2B1+/+组细胞肥大明显，差异有统计学意义（图5)。PSR染色后，发 现AB组心室心肌间质胶原含量较Sham组增加，动脉血管周围胶原增加更为明显，胶原增 粗，排列紊乱成网络状；SH2B1-/-小鼠 AB术后胶原含量及血管周围胶原含量则比SH2B1+/+ 小鼠 AB术后增加较少（图6)。以上结果说明经AB模型后，小鼠发生明显的心肌肥厚， SH2B1-/-小鼠的心肌肥厚程度小于SH2B1+/+小鼠。
[0063] 图7-9是NTG和SH2B1-TG小鼠 AB模型后的表型结果。同样TG小鼠 AB术后4周 的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham组；AB术后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增 大的程度明显大于NTG小鼠（图7)。心脏表型，AB组较Sham组的心脏均增大，且AB术后TG 小鼠心脏增大的程度远大于NTG小鼠。HE染色切片可观察到：TG小鼠 AB术后心肌细胞横 截面积大于Sham组，显著大于NTG小鼠 AB组（图8)。PSR染色可见，TG小鼠 AB术后心肌 间质胶原含量及血管周围胶原含量均大于NTG小鼠 AB组（图9)。以上结果说明经AB模型 后，小鼠发生明显的心肌肥厚，SH2B1-TG小鼠的心肌肥厚程度大于NTG小鼠。
[0064] 实施例5心肌肥厚（AB)模型小鼠心功能检测 1超声检测心功能 1. 1前期准备 (1)麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封 盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋 钮，出气压力维持在〇· 2-0. 3mPa。
[0065] (2)待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的 小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1. 5-2. 0%异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。
[0066] 1.2心功能检测 小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂(天津成信公司）。采用高 频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量、左室舒张末期内径 (LVEDD)、左室收缩末期内径（LVESD)及短轴缩短率（FS)。
[0067] 2心脏导管超声（PV)检测血流动力学 2. 1前期准备 (1)麻醉机准备：同超声检测心功能部分。
[0068] (2)待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，颈部手术区剃毛，并用湿纱 布擦拭去毛。将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1. 5-2. 0%异氟烷以维持麻醉 深度，避免麻醉过深或过浅。
[0069] 2. 2 PV 检测 碘酒及75%酒精消毒后，剪开小鼠颈部皮肤，依次分离肌肉和软组织，并游离出右颈总 动脉，于血管下穿过双线并结扎远心端，同时活结结扎近心端。用血管剪在远心端剪一切口 (1/3-1/2管径)，于体视显微镜下将Millarl. 4F超微导管迅速插入右颈总动脉，同时穿一 缝线将导管和血管结扎。打开近心端活结，将导管沿右颈总动脉-升主动脉插入左心室内， 连接Powerlab生物信号采集处理系统。观察记录仪上波形情况，调节导管的位置使波形图 清晰且稳定。监测射血分数（EF)、左室内压最大上升速率（dP/dt max)及左室内压最小上 升速率（dP/dt min)等指标。
[0070] 图10是SH2B1+/+和SH2B1-/-小鼠 AB模型后心功能检测结果图。与SH2B1+/+ Sham组相比，SH2B1+/+小鼠 AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚，主要表现为心肌肥 厚的指标LVEDD、LVESD均不同程度的增加，而反映心功能的指标FS则下降。AB术后4周， SH2B1-/-小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度小于SH2B1+/+ 小鼠（图10A)。通过血流动力学指标的检测，观察到AB术后4周SH2B1+/+小鼠 EF、dP/dt max和dP/dt min均比其Sham组降低，AB术后SH2B1-/-小鼠比SH2B1+/+小鼠 AB组的EF、 dP/dt max和dP/dt min降低较少（图10B)。这些结果均与SH2B1-/-小鼠心肌肥厚程度较 小的结果一致。
[0071] 图11是NTG和SH2B1-TG小鼠 AB模型后的超声和PV检测结果。与NTG Sham组 相比，NTG小鼠 AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚。主要表现为心肌肥厚的指标 LVEDD、LVESD增大，而反映心功能的指标EF、FS则下降。AB术后4周，与NTG小鼠相比，TG 小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度则大于NTG组（图11A)。 通过血流动力学指标的检测，观察到AB术后4周NTG小鼠 EF、dP/dt max和dP/dt min均 比其Sham组降低，TG小鼠 AB术后EF、dP/dt max和dP/dt min降低的程度则大于NTG组， 差异有统计学意义（图11B)。
[0072] 实施例6 SH2B1基因敲除抑制Jak2/Stat3信号通路的激活；SH2B1基因过表达 促进Jak2/Stat3信号通路的激活 用野生型小鼠、SH2B1基因敲除小鼠及心脏特异性SH2B1转基因小鼠和非转基因小 鼠分别进行假手术和主动脉弓缩窄手术，在术后4周对各组小鼠心脏提取蛋白质进行 SDS-PAGE-免疫印迹试验（Western blot)，检测Jak2/Stat3信号通路蛋白的表达情况， GAPDH (Cell Signaling Technology，2118)作为内参。结果显示 AB 手术后 Jak2/Stat3 信 号通路被激活，敲除 SH2B1 基因后 p-Jak2 (Cell Signaling Technology, 3776)、p_Stat3 (Cell Signaling Technology,9145)的蛋白表达水平要低于其对照野生型小鼠组，总的蛋 白 T_Jak2 (Cell Signaling Technology，3230)、T_Stat3 (Bioworld，BS1336)在 Sham 及 AB的各组小鼠间均无明显差异（图12) ;SH2B1基因过表达后p-Jak2、p-Stat3的蛋白表达 水平要高于其对照NTG小鼠，总的蛋白T-Smad2、T-Smad3在Sham及AB的各组小鼠间均无 明显差异（图13)。
[0073] 由以上结果可知发生心肌肥厚时，SH2B1表达会上调，SH2B1基因缺陷显著抑制了 心肌肥厚、纤维化，保护心功能，SH2B1基因过表达显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功 能。因此SH2B1基因具有恶化心功能和促进心肌肥厚及纤维化的作用，特别是SH2B1基因 能够恶化主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。
[0074] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. SH2B1作为药物靶标在筛选保护心脏功能的药物中的应用。 2. SH2B1作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中的应用。 3. SH2B1的抑制剂在制备保护心脏功能的药物中的应用。
4. 一种保护心脏功能的药物，其特征在于：包含SH2B1的抑制剂。 5. SH2B1的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中的应用。
6. -种预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，其特征在于：包含SH2B1的抑制剂。
7. 根据权利要求3或5所述的应用，其特征在于：所述的SH2B1的抑制剂为SH2B1基 因的siRNA、SH2Bl基因的RNA干扰载体或SH2B1的抗体及其他能够抑制SH2B1表达的抑制 剂中的一种。
8. 根据权利要求4或6所述的药物，其特征在于：所述的SH2B1的抑制剂为SH2B1基 因的siRNA、SH2Bl基因的RNA干扰载体或SH2B1的抗体及其他能够抑制SH2B1表达的抑制 剂中的一种。
【文档编号】C12Q1/68GK104141012SQ201410376652
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年8月1日 优先权日:2014年8月1日
【发明者】李红良, 蒋丁胜, 蒋曦, 张晓东 申请人:武汉大学