专利名称：一种癌基因及其编码蛋白与专用细胞系的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中一种癌基因及其编码蛋白与专用细胞系。
背景技术：
蛋白酪氨酸激酶受体(PTKR)在各种细胞调控水平及肌体不同发育阶段中起着重要作用，比如参与细胞的增殖、分化及抗凋亡等过程。典型的PTKR结构表现为细胞脂质双分子层上的单跨膜蛋白，分为胞外区、跨膜区及胞内区。胞外区具有相应配体的特异性识别位点，在结合配体过程中起重要作用。胞内区含有酪氨酸激酶功能域，参与胞内的信号转导及受体、衔接蛋白的磷酸化过程，特别是有丝分裂原的信号转导。PTKR在细胞内的异常表达常会导致遗传疾病及肿瘤。因此，PTKR蛋白的表达在肌体内受到严格调控。目前为止，至少有18种PTKR与肿瘤转化有关，可作为癌基因。重要的实例包括成纤维生长因子受体(FGFR)、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板来源的生长因子受体(PDGFR)、胰岛素受体(InsR)和肝细胞生长因子受体(Met)等。
研究显示部分PTKR异常剪接变异体与肿瘤的发生相关。比如从人骨肉瘤及乳腺癌细胞可分离到缺少全部跨膜区的可溶性FGFR3分子。而在胃癌细胞中，一种符合蛋白编码的49氨基酸的缺失可导致Ron酪氨酸受体的组成性激活。最近从脑垂体肿瘤中人们分离到一种新型FGFR4剪接变异体，被称做ptd-FGFR4。这种剪接变异体缺少几乎全部的FGFR4受体胞外区，并且不包含信号肽，导致该成熟蛋白仅在胞浆表达。过量表达ptd-FGFR4可导致细胞转化。通过转基因方式在小鼠体内进行组织特异性表达可形成垂体瘤。另外，利用N端和C端特异性抗体，人们发现部分恶性肌骨骼瘤临床病人样品中也有N端缺失的Met受体表达。
发明创造内容本发明的目的是提供一种癌基因及其编码蛋白与专用细胞系。
本发明所提供的癌基因，名称为具有激酶功能域的新型癌基因，简称为NOK基因(NovelOncogene withKinase-domain)，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №1由1269个碱基组成，其开放阅读框架为自5′端第1位-1269位碱基。
在实际应用中，为了便于检测，在其3′端还带有HA标签的编码基因，该带HA标签的编码基因的核苷酸序列如序列表中的序列3所示，序列3由1296个碱基组成，自5′端第1267位-1296位碱基为HA标签的编码基因。
具有激酶功能域的新型癌基因编码蛋白，名称为NOK，它是具有序列表中SEQ ID№2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
序列表中SEQ ID №2的蛋白质由422个氨基酸残基组成。在实际应用中，为了便于检测，其羧基端还带有HA标签，该带HA标签的NOK的氨基酸序列如序列表中的序列4所示，序列4由431个氨基酸残基组成，自氨基端第423位-431位氨基酸残基为HA标签。
含有NOK基因的载体和细胞系，如pcDNA3(NOK-H)和于2004年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)、保藏号为CGMCC№1145的BaF3-NOK细胞系，均属于本发明的保护范围。
实验证明，NOK基因在BaF3细胞稳定表达导致该细胞发生转化，使BaF3细胞由白细胞介素3(IL-3)依赖性转化为非依赖性；NOK稳定表达细胞系BaF3-NOK皮下接种裸鼠后，可导致接种部位肿瘤生成及远处脏器转移，表现为恶性肿瘤特点。NOK是一个新型癌基因。BaF3-NOK接种裸鼠可作为研究肿瘤发生与转移机制，以及筛选抗肿瘤生成与转移药物的模型动物。BaF3-NOK可作为细胞水平的模型工具用于筛选抗肿瘤生成与转移药物，将在抗肿瘤药物筛选及抗肿瘤药物的药效检测中发挥重要作用。
图1为从扁桃体肿瘤总RNA中经RT-PCR扩增得到的NOK基因产物图2为用HA抗体检测BaF3-NOK及BaF3-p3稳定细胞NOK蛋白表达情况图谱图3为在饥饿条件下BaF3-NOK的增殖曲线图4为BaF3-NOK细胞在没有血清及WEHI-3B的半固体培养基中形成集落的照片图5为BaF3-NOK皮下接种裸鼠成瘤照片图6为BaF3-NOK细胞在裸鼠远处脏器肝脏、脾脏及肾脏的转移，以及侵润注射皮下骨骼肌的情况
具体实施例方式
实施例1、NOK基因的获得NOK全长cDNA从人扁桃体肿瘤总RNA中经RT-PCR获得，具体步骤如下按常规方法提取人扁桃体肿瘤总RNA，然后以5′-TATAAAGCTTATGGGCATGATGACACGGATGCT-3′和5′-TATACTCGAGTCAGGCGTAGTCGGGCACGTCGTAGGGGTAAAGCATGCTATAGTTGTA-3′为引物(下划线为HA表达标签)，反应条件按照一步法RT-PCR的使用说明进行(Takara)，得到的PCR产物(图1)纯化后直接亚克隆到T载体(购自Promega公司)，酶切鉴定后再进行测序。将测序过的RT-PCR产物经HindIII和XhoI双酶切后亚克隆到pcDNA3.0(购自Invitrogen公司)上，构成pcDNA3(NOK-H)表达质粒。测序表明NOK基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。该融合基因C末端携带HA标签(序列表中序列3)，可被鼠HA抗体识别。
NOK基因编码蛋白是具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质，具有典型的酪氨酸激酶功能域(自氨基端105-327氨基酸残基)。
实施例2、BaF3-NOK稳定细胞系的构建离心收取1×106BaF3细胞，重悬于0.5ml无血清RPMI-1640培养液。将3μg实施例1中得到的pcDNA3(NOK-H)与BaF3细胞混合，冰浴10分钟后，用ECM399(BTX公司)电转仪进行电转。电转条件为200-230V，电流为25-35毫秒。电转染后的细胞在RPMI-1640全培养基中生长。由于质粒pcDNA3携带新酶素抗性基因，稳定细胞可在500μg/mlG418下进行筛选。每三天换一次液，连续培养三周后，在100mm培养皿中进行扩增。在药物G418的筛选下获得稳定外源基因的表达的细胞系BaF3-NOK CGMCC №1145。
实施例3、检测BaF3-NOK稳定细胞系NOK基因的表达由于NOK基因的羧基端融合了一个HA标签，阳性细胞克隆可通过蛋白印记杂交(Western Blot)进行检测。等蛋白量的BaF3-NOK及BaF3-P3对照(pcDNA3.0空载体稳定转染的BaF3)的细胞裂解液经10％SDS/PAGE分离后转到硝酸纤维素膜上。以鼠源抗HA标签的单克隆抗体为一抗(Santa Cruz公司)进行杂交，以荧光素标记的羊源抗鼠抗体(Amersham Biosciences UK Limited)为二抗，最后用ECL化学发光的底物进行杂交信号放大。结果如图2所示，表明细胞系BaF3-NOK有特异性NOK蛋白表达，分子量约为45kD。
实施例4、BaF3-NOK细胞呈现白细胞介素3(IL-3)非依赖性的特点BaF3细胞为小鼠前B细胞，需要有白细胞介素3的刺激下才能增殖。在没有血清及没有WEHI-3B的RPMI-1640(掺入的3H胸腺嘧啶脱氧核苷)培养液中在37℃培养3天，[3H]掺入检测细胞增殖结果如图3所示，表明在没有血清及没有WEHI-3B的RPMI-1640培养液中，BaF3-NOK可显著增殖3天以上，而BaF3-P3(pcDNA3.0空载体稳定转染的BaF3)对照由于需要IL-3的刺激，因而细胞几乎没有增殖。说明在BaF3细胞中稳定表达NOK基因，可以使BaF3-NOK在没有WEHI-3B条件培养液(提供IL-3)的情况下也可以增殖。
实施例5、BaF3-NOK在‘饥饿’培养条件下具有锚定非依赖增长的特性稳定细胞在半固体培养基中的生长是检测细胞转化特性的依据之一。将BaF3-NOK细胞以1×105个细胞/ml培养基的浓度悬浮在60mm培养皿盛装的0.4％琼脂糖培养基中，铺在0.8％的琼脂糖培养基之上。琼脂糖培养基用RPMI-1640培养液制备，其中含有5％FBS及400μg/ml G418。以pcDNA3.0空载体稳定转染的BaF3(BaF3-p3)为阴性对照。在没有血清及没有WEHI-3B上清的条件下，置于含5％二氧化碳的37℃孵箱中培养。三周后，用倒置显微镜计算直径大于0.1mm的细胞集落数，结果如图4所示，表明BaF3-NOK在‘饥饿’培养条件下有明显的集落生成。统计结果如表1所示，表明在BaF3细胞中稳定表达NOK，可使BaF3细胞的增殖特性发生改变，具有肿瘤细胞的特点。
表1、BaF3稳定细胞系在半固体琼脂糖培养基中的集落生成试验BaF3细胞系细胞数 集落数(标准差)BaF3-p3 1×1050(0)BaF3-NOK 1×105206(18)注集落数为三次平行实验的平均值±标准差实施例6、BaF3-NOK细胞具有肿瘤生成特性，皮下接种裸鼠可导致恶性肿瘤生成体内成瘤实验的具体步骤是，将1×107BaF3-NOK稳定细胞系皮下注射4-6周去胸腺Balb-c裸鼠，注射部位是裸鼠右前臂腋下皮肤。以稳定表达pcDNA3.0空载体的BaF3细胞(BaF3-p3)为阴性对照。每一种细胞注射六只裸鼠。每一实验组包括三只雌鼠(F1、F2、F3)及三只雄鼠(M1、M2、M3)。注射BaF3-NOK细胞一周后可见接种部位皮下有明显肿瘤形成(图5)。接种二周后对照组与试验组成瘤情况如图4所示。接种BaF3-NOK细胞一个月后小鼠全身出现衰竭，行动迟缓，35-40天死亡。BaF3-NOK细胞在裸鼠体内呈现恶性肿瘤生长趋势，在注射部位骨骼肌成侵润性生长，肝脏及脾脏明显增大，并导致远处脏器如肝脏、脾脏、肾脏和肺脏转移(图6和表2)。图6中，T表示肿瘤灶，箭头所指为转移的肿瘤细胞。
表2、BaF3-NOK在裸鼠肿瘤生成情况
a代表裸鼠的平均值±标准差序列表<160>4<210>1<211>1269<212>DNA<213>人属人(Homo sapiens)<400>1atgggcatga cacggatgct cctggaatgc agtctcagtg acaagttgtg tgtcatccag60gagaagcagt atgaagtgat tatcgtccca actttgttgg ttactatctt cctcatcctt120cttggggtca tcctgtggct ttttatcaga gaacaaagaa ctcaacagca gcgttctgga180cctcaaggca ttgcccctgt tcctccacct agggacctaa gctgggaagc aggacatgga240ggaaatgtgg ctttgccact taaggagaca tccgtggaaa actttctggg agctaccaca300cctgccctgg ctaagctgca ggtgccgcgg gagcaactct ctgaagttct ggagcagatt360tgcagcggta gctgtgggcc catctttcga gccaatatga acactgggga cccttctaag420cccaagagtg ttattctcaa ggctttaaaa gaaccagctg ggctccatga ggtacaagat480ttcttagggc gaatccaatt ccatcaatac ctggggaaac acaaaaacct ggtgcagctg540gaaggctgct gcactgaaaa gctgccactc tatgtggtgt tggaggatgt ggcccagggg600gacctgctta gctttctctg gacctgtcgg cgggatgtga tgactatgga tggtcttctc660tatgatctca cagaaaaaca agtatatcac atcggaaagc aggtcctttt ggcgctggaa720ttcctgcagg agaagcattt gttccatggg gatgtggcag ccaggaatat tctgatgcaa780agtgatctca ctgctaagct ctgtggatta ggcctggctt atgaagttta cacccgaggg840gccatctcct ctactcaaac catacctctc aagtggcttg ccccagaacg gcttctcctg900agacctgctc gcatcagagc agatgtctgg tcttttggga tcctgctcta tgagatggtg960actctaggag caccaccgta tcctgaagtc cctcctacca gcatcctaga gcatctccaa1020agaaggaaaa tcatgaagag acccagtagc tgcacacata ccatgtacag tatcatgaag1080tcctgctggc gctggcgtga ggctgaccgc ccctcaccta gagagctgcg cttgcgccta1140gaagctgcca ttaaaactgc agatgacgag gctgtgttac aagtaccaga gttggtggta1200cctgaactgt atgcagctgt ggccggcatc agagtggaga gcctcttcta caactatagc1260atgctttga1269<210>2<211>422<212>PRT<213>人属人(Homo sapiens)<400>2Met Gly Met Thr Arg Met Leu Leu Glu Cys Ser Leu Ser Asp Lys Leu
1 5 10 15Cys Val Ile Gln Glu Lys Gln Tyr Glu Val Ile Ile Val Pro Thr Leu20 25 30Leu Val Thr Ile Phe Leu Ile Leu Leu Gly Val Ile Leu Trp Leu Phe35 40 45Ile Arg Glu Gln Arg Thr Gln Gln Gln Arg Ser Gly Pro Gln Gly Ile50 55 60Ala Pro Val Pro Pro Pro Arg Asp Leu Ser Trp Glu Ala Gly His Gly65 70 75 80Gly Asn Val Ala Leu Pro Leu Lys Glu Thr Ser Val Glu Asn Phe Leu85 90 95Gly Ala Thr Thr Pro Ala Leu Ala Lys Leu Gln Val Pro Arg Glu Gln100 105 110Leu Ser Glu Val Leu Glu Gln Ile Cys Ser Gly Ser Cys Gly Pro Ile115 120 125Phe Arg Ala Asn Met Asn Thr Gly Asp Pro Ser Lys Pro Lys Ser Val130 135 140Ile Leu Lys Ala Leu Lys Glu Pro Ala Gly Leu His Glu Val Gln Asp145 150 155 160Phe Leu Gly Arg Ile Gln Phe His Gln Tyr Leu Gly Lys His Lys Asn165 170 175Leu Val Gln Leu Glu Gly Cys Cys Thr Glu Lys Leu Pro Leu Tyr Val180 185 190Val Leu Glu Asp Val Ala Gln Gly Asp Leu Leu Ser Phe Leu Trp Thr195 200 205Cys Arg Arg Asp Val Met Thr Met Asp Gly Leu Leu Tyr Asp Leu Thr210 215 220Glu Lys Gln Val Tyr His Ile Gly Lys Gln Val Leu Leu Ala Leu Glu225 230 235 240Phe Leu Gln Glu Lys His Leu Phe His Gly Asp Val Ala Ala Arg Asn245 250 255Ile Leu Met Gln Ser Asp Leu Thr Ala Lys Leu Cys Gly Leu Gly Leu260 265 270Ala Tyr Glu Val Tyr Thr Arg Gly Ala Ile Ser Ser Thr Gln Thr Ile275 280 285Pro Leu Lys Trp Leu Ala Pro Glu Arg Leu Leu Leu Arg Pro Ala Arg290 295 300Ile Arg Ala Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Tyr Glu Met Val305 310 315 320
Thr Leu Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Glu Val Pro Pro Thr Ser Ile Leu325 330 335Glu His Leu Gln Arg Arg Lys Ile Met Lys Arg Pro Ser Ser Cys Thr340 345 350His Thr Met Tyr Ser Ile Met Lys Ser Cys Trp Arg Trp Arg Glu Ala355 360 365Asp Arg Pro Ser Pro Arg Glu Leu Arg Leu Arg Leu Glu Ala Ala Ile370 375 380Lys Thr Ala Asp Asp Glu Ala Val Leu Gln Val Pro Glu Leu Val Val385 390 395 400Pro Glu Leu Tyr Ala Ala Val Ala Gly Ile Arg Val Glu Ser Leu Phe405 410 415Tyr Asn Tyr Ser Met Leu420<210>3<211>1296<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3atgggcatga cacggatgct cctggaatgc agtctcagtg acaagttgtg tgtcatccag60gagaagcagt atgaagtgat tatcgtccca actttgttgg ttactatctt cctcatcctt120cttggggtca tcctgtggct ttttatcaga gaacaaagaa ctcaacagca gcgttctgga180cctcaaggca ttgcccctgt tcctccacct agggacctaa gctgggaagc aggacatgga240ggaaatgtgg ctttgccact taaggagaca tccgtggaaa actttctggg agctaccaca300cctgccctgg ctaagctgca ggtgccgcgg gagcaactct ctgaagttct ggagcagatt360tgcagcggta gctgtgggcc catctttcga gccaatatga acactgggga cccttctaag420cccaagagtg ttattctcaa ggctttaaaa gaaccagctg ggctccatga ggtacaagat480ttcttagggc gaatccaatt ccatcaatac ctggggaaac acaaaaacct ggtgcagctg540gaaggctgct gcactgaaaa gctgccactc tatgtggtgt tggaggatgt ggcccagggg600gacctgctta gctttctctg gacctgtcgg cgggatgtga tgactatgga tggtcttctc660tatgatctca cagaaaaaca agtatatcac atcggaaagc aggtcctttt ggcgctggaa720ttcctgcagg agaagcattt gttccatggg gatgtggcag ccaggaatat tctgatgcaa780agtgatctca ctgctaagct ctgtggatta ggcctggctt atgaagttta cacccgaggg840gccatctcct ctactcaaac catacctctc aagtggcttg ccccagaacg gcttctcctg900agacctgctc gcatcagagc agatgtctgg tcttttggga tcctgctcta tgagatggtg960
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权利要求
1.一种癌基因编码蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述癌基因编码蛋白是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于所述癌基因编码蛋白的羧基端还带有HA标签，所述带有HA标签的癌基因编码蛋白具有序列表中序列4的氨基酸序列。
4.一种癌基因，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述癌基因是具有序列表中SEQ ID№1的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于所述癌基因的3′端还带有HA标签的编码基因，所述带HA标签编码基因的癌基因具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列。
7.含有权利要求4所述基因的表达载体。
8.根据权利要求7所述的载体，其特征在于所述表达载体为pcDNA3(NOK-H)。
9.含有权利要求4所述基因的细胞系。
10.根据权利要求9所述的细胞系，其特征在于所述细胞系为BaF3-NOK CGMCC№1145。
全文摘要
本发明公开了一种癌基因及其编码蛋白与专用细胞系。本发明所提供的癌基因编码蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。NOK是一个新型癌基因。BaF3－NOK CGMCC№1145接种裸鼠可作为研究肿瘤发生与转移机制，以及筛选抗肿瘤生成与转移药物的模型动物。BaF3－NOK CGMCC №1145可作为细胞水平的模型工具用于筛选抗肿瘤生成与转移药物，将在抗肿瘤药物筛选及抗肿瘤药物的药效检测中发挥重要作用。
文档编号C12N15/12GK1570107SQ200410037888
公开日2005年1月26日 申请日期2004年5月13日 优先权日2004年5月13日
发明者刘力, 傅新元, 常智杰, 张淑平 申请人:清华大学